Особенность применения методов хроматографии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Понятие о хроматографии, суть и принципы хроматографического метода, классификация

2. Методы разделения белков с помощью ионообменной и аффинной хроматографии

Выводы

Список использованной литературы

Введение

Хроматография в настоящее время является наиболее широко используемым аналитическим методом. Она активно применяется для научных исследований, анализа показателей качества и безопасности пищевых продуктов. Исследуя разнообразие сложных смесей, хроматография выполняет одну из важнейших задач химической науки: точное и подробное изучение состава.

Быстрое развитие хроматографических методов на практике позволило существенно расширить возможности использования хроматографии для анализа практически всех веществ: газообразных, жидких, твердых.

Наиболее активное применение методов хроматографии для анализа пищевых продуктов началось с развития приборной базы, появления доступного оборудования, особенно отечественного производства.

Решение задачи продовольственной безопасности дало определенный стимул к развитию и совершенствованию хроматографических методов исследований для целей анализа состава и определения биологической ценности пищевых продуктов, а также количественного измерения содержания в них различных контаминантов и токсичных веществ.

Важные особенности хроматографических методов анализа - высокая селективность, большая чувствительность и универсальность.

Многие методики выполнения измерений являются универсальными, применимыми для широкого спектра исследований, что позволяет занимать ведущее место среди инструментальных методов анализа сложных многокомпонентных смесей.

Хроматография - это физический метод анализа и исследования веществ и их смесей, основанный на разделении компонентов в динамическом режиме за счет распределения их при перемещении между неподвижной фазой и потоком подвижной фазы.

Все хроматографические методы подразделяют на группы в зависимости от типа сорбционного процесса.

Одним из наиболее удобных методов разделения биологических соединений является хроматография. Разнообразие ее видов и модификаций позволяет сделать выбор, который зависит от природы выделяемого материала.

С помощью хроматографических методов можно разделить как большие, так и малые количества биологического материала (несколько пикограммов).

Определение аминокислотного состава белков может быть осуществлено различными методами: химическим, хроматографическим, микробиологическим и изотопным. Чаще используются хроматографические методы.

1. Понятие о хроматографии, суть и принципы хроматографического метода, классификация

Хроматография изучает термодинамику состояния двухфазных систем газ-жидкость, жидкость-жидкость, жидкость-твердое тело, сверхкритическое и жидкокристаллическое состояние веществ, исследует природу межмолекулярных взаимодействий, кинетику процессов внутреннего и межфазного массообмена, процессы комплексообразования, ассоциации и образования соединений включения, стереохимию органических соединений и многое другое.

В связи с исключительной многогранностью понятия "хроматография" оно не может быть охвачено одним единственным определением. В категориях "явление, процесс, метод, наука" хроматографию предложено определять как:

Ш явление образования, движения и изменения концентрационных зон веществ (частиц) в условиях массообмена между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами или на границе раздела этих фаз;

Ш процесс дифференцированного многократного перераспределения веществ или частиц между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами, приводящий к обособлении) концентрационных зон индивидуальных

Ш компонентов исходных смесей этих веществ или частиц;

Ш метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз;

Ш наука о межмолекулярных взаимодействиях и переносе молекул или частиц в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.

Впервые термин «хроматография» был использова российским биологом Михаилом Семеновичем Цветом для описания разработанного им метода разделения компонентов хлорофила на бумаге.

В общем случае хроматография это наука о принципах и методах разделения, количественного и качественного определения веществ, используя их различия (размер, заряд, массу, полярность и т.д.) в потоке на границе нескольких гетерогенных сред (газ и твердое тело, жидкость и твердое тело, газ и жидкость, несмешиващиеся жидкости и т.д.).

В основу той или иной классификации хроматографических методов могут быть положены различные характерные признаки процесса, например:

ь агрегатное состояние фаз;

ь природа элементарного акта;

ь способ относительного перемещения фаз;

ь способ аппаратурного оформления процесса;

ь способ осуществления процесса.

По агрегатному состоянию фаз хроматографию разделяют на газовую, когда подвижной фазой является газ, и жидкостную - когда подвижной фазой является жидкость.

Газовая хроматография подразделяется на газо-адсорбционную (газо-твердофазную), когда неподвижной фазой является твердый сорбент, и газо-жидкостную, когда неподвижной фазой является жидкость на твердом носителе.

Аналогично подразделяют и жидкостную хроматографию на жидкостно-жидкостную, жидкостно-твердофазную и жидкостно-газовую.

В названии вида хроматографии первое слово характеризует подвижную фазу, а второе - неподвижную. Жидкостно-жидкостную хроматографию иногда называют экстракционной, так как распределение веществ происходит между двумя несмешивающимися жидкими фазами, одна из которых (неподвижная) зафиксирована в тонком слое на пористом твердофазном носителе (рис. 6).

По механизму взаимодействия сорбента и сорбата выделяют несколько основных видов хроматографии (рис.5):

Ш распределительную хроматографию, основанную на различии растворимости разделяемых веществ в подвижной и неподвижной фазах;

Ш ионообменную, основанную на разной способности веществ к ионному обмену;

Ш адсорбционную, основанную на разной способности к адсорбции веществ на твердом сорбенте;

Ш осадочную, основанную на различии растворимости образующихся осадков с сорбентом.

По технике выполнения выделяют колоночную хроматографию, когда разделение веществ проводится в специальных колонках с сорбентом, и плоскостную хроматографию, когда разделение проводится в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография) или на хроматографической бумаге (бумажная хроматография).

Сущность метода: хроматографическую колонку промывают элюентом, сорбируемость которого меньше, чем любого из компонентов разделяемой смеси. Затем в колонку вводят разделяемые вещества, растворенное в элюенте, и продолжают непрерывно пропускать элюент.

Рис.1.

Рис.2.

Методы разделения белков

Исследование однородности белковых препаратов и выделение отдельных белковых фракций производится с помощью различных методов, наиболее важные из которых основаны на применении ультрацентрифугирования, электрофореза, хроматографии, а также на изучении растворимости белков.

1. Методы разделения белков и аминокислот, основанные на различиях веществ в молекулярной массе:

а) ультрацентрифугирование. В ультрацентрифуге сначала осаждаются более тяжелые молекулы, затем менее тяжелые.

б) гель-фильтрация. При этом методе хроматографическая колонка заполняется пористыми гранулами сильно гидратированного углеводного полимера, чаще всего сефадекса (специальным образом обработанные производные высокомолекулярного углевода декстрана). При фильтровании через такую колонку смеси низкомолекулярных и высокомолекулярных белков небольшие белковые молекулы, проникая через поры внутрь гранул сефадекса, будут протекать по колонке медленнее, чем белки, молекулы которых не помещаются в порах гранул и поэтому быстрее вытекают из колонки.

2. Методы разделения белков и аминокислот, основанные на различиях в их кислотно-основных свойствах (или различия их электрических зарядов):

а) метод электрофореза. Смысл электрофореза заключается в разделении находящихся в растворе веществ в электрическом поле на основе различий их электрических зарядов. Электрофоретическое исследование белка производят обычно при нескольких значениях рН, т.к. установлено, что если при одном рН препарат белка ведет себя как однородное вещество, то при другом рН этот же препарат может быть неоднородным.

За последние годы широкое распространение получил электрофорез растворов белков и пептидов на различных носителях - фильтровальной бумаге, целлюлозном или крахмальном порошке, полиакриламидном геле. Эти методы позволяют анализировать чрезвычайно малые количества белков. белок ионообменный аффинный хроматография

б) диск-электрофорез в полиакриламидном геле, при котором смесь белков подвергается одновременному воздействию электрического поля и градиента рН. Он обладает особенно высокой разрешающей способностью.

Фильтрование через гель, так же как и электрофорез в полиакриламидном геле, широко применяется для быстрого приблизительного определения молекулярной массы белков.

в) ионообменная хроматография. В ионообменной хроматографии в качестве носителя используются полимеры, несущие на себе заряд - ионообменные смолы:

Ш катионообменные смолы (заряженные отрицательно) - обмениваются катионами;

Ш анионообменные смолы (заряженные положительно) - обмениваются анионами.

Например, часто используется катионообменная полистероидная сульфированная смола. Если раствор аминокислот имеет кислую среду, при загрузке колонки, положительно заряженные аминокислоты и белки вытесняют натрий и соединяются с сульфид-анионом. При добавлении гидрооксида натрия рН увеличивается; когда рН достигнет значения, равного изоэлектрической точке молекулы белка, аминокислоты теряют заряд и становятся нейтральными. Под действием силы тяжести аминокислота выходит из колонки, потеряв заряд. Разные белки (аминокислоты) имеют разные значения изоэлектрических точек.

3. Методы разделения, основанные на различиях в веществ по растворимости:

а) метод фракционирования белков солевыми растворами. Основан на том, что каждый индивидуальный белок разделяемой смеси осаждается из нее при определенной концентрации той или иной соли, в то время как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе. Процесс осаждения белка из раствора под действием соли называется высаливанием. При дальнейшем насыщении солью выпадает следующий индивидуальный белок и, таким образом, можно один за другим выделить относительно чистые индивидуальные белки.

б) распределительная хроматография на бумаге. Этот метод основан на различной степени распределения компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами (подвижной и неподвижной) и заключается в том, что каплю гидролизата белка наносят на полоску хроматографической бумаги, один конец которой опускают в органический растворитель. Растворитель под действием капиллярных сил всасывается бумагой и, проходя по полоске бумаги, увлекает за собой аминокислоты.

Скорость перемещения аминокислот по бумаге зависит от их химического строения и способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителях. В качестве подвижного растворителя используют водонасыщенный фенол, n-бутиловый спирт и др. Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают бумагу. Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость, например, в феноле, тем быстрее они движутся вслед за фронтом органического растворителя.

2. Методы разделения белков с помощью ионообменной и аффинной хроматографии

Ионообменная хроматография основана на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

Рис. 3. Электрофорез белков сыворотки крови здорового человека на бумаге.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН.

Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

По указанным соображениям для разделения белков используют ионообменники, в которых матрица ("подложка") отчетливо гидрофильна. Особенно распространены ионообменники, получаемые присоединением монотонных групп к целлюлозе, поперечно-сшитым декстранам (сефадексы).

Для получения катионов в качестве ионогенной чаще всего используют карбоксильную группу рКа которой, несколько изменяющийся в зависимости от микроокружения, близок к 4 (карбоксиметил (СМ)-производные целлюлозы, сефадекса, содержащие группировки

Карбоксильные группы таких ионитов отрицательно заряжены при рН 5 и выше и, следовательно, способны связывать белки, которые в этих условиях несут положительный заряд. Связывание белков усиливается, если на их поверхности встречаются скопления ("гроздья") катионных групп. При прочих равных условиях с катионитом лучше связываются белки большей молекулярной массы, что объясняется кооперативностью многоточечного взаимодействия обширных участков поверхности такого белка с анионными группами ионообменника.

Десорбция белков, связанных катионитом, обычно достигается повышением ионной силы элюирующего раствора, причем взаимодействующие между собой заряженные группы белка и ионита оказываются в окружении противоположно заряженных ионов солей.

В результате при определенной концентрации соли, характерной для каждого белка, электростатические взаимодействия между ним и ионитом снимаются и белок элюируется с колонки.

Плавное увеличение ионной силы раствора, применение линейного или более сложного градиента концентрации соли вызывает десорбцию сначала наиболее слабо удерживаемых молекул, затем более прочно связанных белков и т.д.

В препаративных опытах нередко прибегают к ступенчатой элюции, при которой концентрации соли повышается скачками. Это ускоряет разделение и позволяет собрать белок в небольшом объеме, однако легко приводит к образованию одним и тем же белком нескольких ложных.

При промывании колонки с ионитом раствором соли подходящей концентрации белок десорбируется, иногда образуя довольно длинный "хвост", что может быть следствием неравномерного распределения ионных групп в сорбенте.

Участки с их повышенным содержанием, скопления таких групп прочнее удерживают белок, что и вызывает задержку элюции и образование "хвоста". В такой ситуации скачкообразное повышение ионной силы элюирующего раствора резко улучшает условия десорбции, поэтому часть белка, которая в обычных условиях образовывала бы "хвост", десорбируется скачком, давая ложный пик.

Ввиду этого следует определять белковый состав каждой фракции независимым методом, например электрофорезом в полиакриламидном геле, или подвергать сомнительные пики повторной хроматографии в тех же условиях. Несоблюдение таких предосторожностей нередко приводит к ошибочному обнаружению "множественных форм" белков.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д.

Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом (рис. 4). Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

Рис. 4. Аффинная хроматография.

Для разделения белков применяется также ряд др. аналогичных методов. Т. называют ковалентная хроматография основана на избирательном образовании и последующем расщеплении ковалентных связей между выделяемым веществом и носителем, например между белком с SH-группами и ртуть-органическое производными агарозы.

Применяется также лигандообменная хроматография, при которой ферменты связываются через функциональный ион металла с комплексоном, иммобилизованным на носителе. Получила распространение гидрофобная хроматография, при которой сорбент (например, фенилсефароза), содержащий гидрофобные группировки, вкрапленные в гидрофильную матрицу, взаимодействует с гидрофобными участками, содержащимися на поверхности белков. Нередко при этом наблюдаются также ионообменные взаимодействие, как, например, при использовании в качестве сорбента алкиламиносефароз.

Рис. 5. Схема хроматографии белков на аффинном носителе.

Рис.6. Ионообменная колоночная хроматография.

Выводы

Хроматография - область науки, изучающая процессы, основанные на перемещении зоны вещества вдоль слоя сорбента в потоке подвижной фазы и связанные с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов.

В любом варианте хроматографических методов используют сочетание неподвижной (стационарной) фазы (НФ) и подвижной фазы (ПФ). Подвижная фаза (газ, жидкость) в процессе хроматографирования непрерывно перемещается вдоль неподвижной фазы (твердое тело, жидкость) так, что частицы хроматографируемых веществ, переносимые вместе с ПФ, могут многократно переходить из ПФ в НФ и обратно. Разделение веществ основано на их различном сродстве к ПФ и НФ. Различие в сродстве приводит к различию в скоростях движения частиц разделяемых веществ с ПФ и, в конце концов к их разделению.

В зависимости от природы адсорбента и механизма разделения веществ хроматографию подразделяют на несколько видов.

Ионообменная хроматография основана на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству - наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой.

Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

Список использованной литературы

1. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 1. Пер. с англ.: -- М.: Мир, 1993. - 384 с.

2. И.Н.Дмитревич, Г.Ф.Пругло, О.В.Фёдорова, А.А.Комиссаренков. Физико-химические методы анализа. Ч.III. Хроматографические методы анализа: учебное пособие для студентов заочной формы обучения/ СПб ГТУРП. - СПб., 2014.- 53с.

3. Общая химия: учебник / А. В. Жолнин; под ред. В. А. Попкова, А. В. Жолнина. - 2012. - 400 с.: ил.

4. Биохимия: учебник для вузов/ под ред. Е.С.Северина - 5-е изд., - 2009. - 768 с.

5. Аналитическая химия. Количественный анализ. Физико-химические методы анализа: учебное пособие / Ю. Я. Харитонов, Д. Н. Джабаров, В. Ю. Григорьева. - 2012. - 368 с.: ил.

Размещено на Allbest.ru