Исследование биологических объектов с применением современных методов хроматографического анализа

3.5.2 Детекторы, используемые в жидкостных хроматографах

В жидкостных хроматографах применяются следующие детекторы: рефрактометрические, фотометрические, флуоресцентные, электрохимические, масс-спектрометрические, инфракрасные и некоторые другие.

В рефрактометре Френеля луч света падает на поверхность раздела двух оптических сред Количество света, отраженного от поверхности раздела двух фаз (жидкость/стекло), пропорционально разности показателей преломления и углу падения света на поверхность раздела. Если угол падения подобрать таким образом, чтобы угол проникания был -90° (т. е. близок к полному углу отражения), то небольшие изменения показателя преломления приведут к значительным изменениям интенсивности отраженного луча. Вместимость кювет составляет 3-5 мкл, т. е. возможна работа при небольших расходах элюента. Рефрактометр Френеля наиболее чувствителен к пульсациям потока, имеет меньший линейный диапазон. Высокие требования предъявляются к чистоте стекла.

В интерферометре коэффициент преломления измеряется методом интерференции света. Интерферометр имеет две проточные кюветы вместимостью 5 мкл. Чувствительность и линейный диапазон в несколько раз больше, чем у других моделей. Предел обнаружения составляет 3 мкг/мл.

Фотометрические детекторы подразделяют:

на детекторы с фиксированной длиной волны;

детекторы с длиной волны, дискретно изменяемой с помощью оптических фильтров;

спектрофотометрические детекторы с плавно изменяемой длиной волны, предназначенные для регистрации поглощения в определенной области УФ-спектра;

спектрофотометрические детекторы на фотодиодных линейках.

Фотометры с фиксированной длиной волны - наиболее дешевые и простые детекторы, применяемые в высоко эффективной жидкостной хроматографии для выполнения массовых анализов. Источником света в детекторах этого типа является ртутная лампа низкого давления; детектирование проводится на длине волны
253,7 нм, на которой излучается 90% излучения. Свет от источника излучения проходит через проточную ячейку, в которую из хроматографической колонки поступает поток элюента. Для аналитических колонок диаметром 4-6 мм, заполненных сорбентом с размером частиц 5-7 мкм, обычно используются ячейки с длиной оптического пути 10 мм, диаметром светового канала ~1 мм и рабочим объемом 8 мкл. Увеличение рабочего объема кюветы может привести к нежелательному размыванию хроматографических пиков.

Фотометрические детекторы с детектированием на длине волны, дискретно изменяемой с помощью оптических фильтров, отличаются от детекторов с фиксированной длиной волны источником с широким спектром испускаемого излучения и тем, что для деления узкого диапазона длин волн, соответствующего максим поглощения детектируемых компонентов, используется набор стеклянных или интерференционных фильтров. Фотометрические детекторы этого типа более универсальны и чувствительны по сравнению с фотометрами с фиксированной длиной волны.

Спектрофотометр с перестраиваемой длиной волны (например, СПФ микроколоночного жидкостного хроматографа «Милихром-5») состоит из источника света, монохроматора и фотоприемника. В качестве источника света используется дейтериевая лампа ДДС-30 с непрерывным спектром испускаемого излучения от 190 до 600 нм. Необходимую спектральную линию, длина которой, как правило, соответствует максимуму спектра поглощения определяемого компонента, выделяют с помощью либо дифракционных решеток, имеющих 1000-3000 штрихов на 1 мм, либо интерференционных фильтров с заданной шириной спектральной полосы. Монохроматический пучок света поочередно проходит через рабочую и сравнительную проточные кюветы, и измеряется оптическая плотность или пропускание излучения на выделенной длине волны.

Традиционные спектрофотометрические детекторы для ВЭЖХ позволяют осуществлять мониторинг элюируемых компонентов пробы по их максимумам поглощения. Сканирование спектра требует в большинстве случаев остановки потока и занимает несколько секунд или даже минут в зависимости от диапазона длин волн.

Электрохимические детекторы реагируют либо на изменение свойств элюента, либо на конкретное анализируемое соединение. К первому типу относится кондуктометрический детектор, ко второму -амперометрический. Большинство электрохимических детекторов работают в амперометрическом режиме, при котором поддерживается постоянное напряжение между двумя электродами погруженными в поток элюента, и регистрируется зависимость силы тока от времени.

Кондуктометрический детектор построен на том, что при создании разности потенциалов ионы, находящиеся в растворе, начинают перемещаться по направлению к электродам. Проводимость зависит от числа заряженных частиц в растворе - именно эта зависимость и положена в основу количественной оценки в кондуктомет-рии. Таким образом, для получения количественных результатов должна быть постоянной молярная проводимость. При применении детекторов этого типа следует избегать протекания электрохимических реакций на поверхности электродов, поэтому используют источники переменного тока с частотой от 50 до 1000 Гц и напряжением от 5 до 10 В. Измерения проводят с применением моста сопротивлений Уинстона.

Детекторы данного типа наиболее пригодны для определения заряженных соединений в элюате, предпочтительны при анализе малых концентраций ионов [1,с. 94-100].

Таким образом, в хроматогафии применяются различные типы детекторов.

4. ОБЗОР НОРМАТИВНОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ И ЛИТЕРАТУРЫ ДЛЯ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

4.1 Общие положения

В настоящее время разработаны хроматографические методе предназначенные для определения состава многих видов пищевой в промышленной продукции или установления содержания в них отдельных компонентов. Многие из этих методик гостированы и их применение регламентировано в качестве метода контроля показателей качества соответствующей продукции.

Таблица 4.1 - ТНПА на хроматографические методы анализа

Однако большинство хроматографических методик предназначено для определения в многокомпонентной пищевой или промышленной продукции содержания отдельных компонентов. К таким методикам относятся, например, методики определения в пищевых продуктах остаточных пестицидов, афлатоксинов, витаминов, отдельных жирных кислот, отдельных сахаров, насыщенных и ароматических углеводородов и многих других. Их особенностью является то, что ввиду многокомпонентности и сложности состава анализируемых продуктов на стадии подготовки пробы к анализу тем или иным способом, чаще всего жидкостной экстракцией, проводится выделение определяемого компонента, чистого или содержащего небольшое количество примесей, из анализируемого продукта, а затем на хроматографической колонке осуществляется его качественная идентификация и количественное определение.

Во многих случаях для выделения определяемых компонентов и оптимизации условий хроматографирования приходится подвергать определяемые компоненты дополнительной обработке, позволяющей, например, отделить их от компонентов, мешающих определению или засоряющих хроматографическую колонку, или придать определяемым компонентам необходимые для хроматографирования свойства, например более высокую летучесть. Например, при хроматографическом определении насыщенных и ароматических углеводородов в продуктах животного и растительного происхождения, рыбопродуктах определяемые компоненты выделяют из неомыляемой фракции липидов, получаемой при обработке анализируемого образца спиртовым раствором щелочи, экстракцией гексаном. Затем экстракт разделяют на хроматографической колонке и углеводороды идентифицируют и количественно определяют с помощью газовой или высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для газохроматографического определения сахаров - глюкозы, фруктозы, арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, рафинозы, сорбита и инозита - в пищевых продуктах с целью повышения летучести сахаров анализируемые пробы обрабатывают триметилхлорсиланом или гексаметилдисилазаном в присутствии пиридина и трифторуксусной кислоты.

Применение хроматографии для анализа биологических сред достаточно быстро расширяется по мере оснащения производственных и испытательных лабораторий современным оборудованием [1, с. 118-120].

4.2 Описание методики определения патулина в яблочных соках методом тонкослойной хроматографии (СТБ ГОСТ Р 51440-2006)

СТБ ГОСТ Р 51440 устанавливает метод определения содержания патулина в яблочных соках, концентрированных яблочных соках и напитках, содержащих яблочный сок, с помощью тонкослойной хроматографии.

Предел обнаружения патулина данным методом составляет 25 мкг/дм³ при условии, что взятый для анализа объем пробы готового к употреблению сока составляет 50 см³.

4.2.1 Сущность метода

Сущность методики определения патулина в соках яблочных, концентрированых яблочных соках и напитках, содержащих яблочный сок, с помощью тонкослойной хроматографии по СТБ ГОСТ Р 51440-2006 (ИСО 8128-2-93)состоит в том, что патулин экстрагируют из исследуемой пробы смесью этилацетата с хлороформом (3:2 по объему).Далее экстракт очищают на колонке с силикагелем. Количественный и качественный анализ экстракта проводят с помощью двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) при проявлении пятен раствором гидрохлорида гидразона 3-метил-2-бензотиазолина (МБТГ).

Предел обнаружения патулина настоящим методом составляет 25 мкг/дм³ при условии, что взятый для анализа объем пробы готового к употреблению сока составляет 50 см³

4.2.2 Реактивы

Используют реактивы аналитической чистоты и воду квалификации «для хроматографии».

Растворители: этилацетат, хлороформ и толуол.

Подвижные фазы для двумерной ТСХ:

- бензол/метанол/уксусная кислота (массовой долей 80%) (19:2:1 по объему);

-толуол/этилацетат/муравьиная кислота (массовой долей 90%) (5:4:1 по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц от 0,063 до 0,2 мм.

Элюирующий раствор: смесь толуола с этилацетатом (75:25 по объему).

Стандартный раствор патулина (С₇Н₆0₄).

Приготовление стандартного раствора патулина.

Навеску патулина массой 10,0 мг, взятую с точностью до 0,1 мг, растворяют в мерной колбе с одной отметкой вместимостью 100 см³ в этилацетате (1.3.2.1). Объем содержимого в колбе доводят до отметки этилацетатом.

Пипеткой переносят 10,0 см приготовленного раствора в другую мерную колбу с одной отметкой вместимостью 100 см, объем содержимого в колбе доводят до отметки этилацетатом.

Массовая концентрация патулина в приготовленном стандартном растворе составляет около 10 мкг/см³.

Измеряют оптическую плотность стандартного раствора при длине волны 276 нм на подходящем спектрофотометре с использованием кварцевых кювет рабочей длиной 10 мм.

Расчет концентрации стандартного раствора патулина

Концентрацию стандартного раствора патулина с_ps. мгк/см³, рассчитывают по формуле

с_ps= (3.1)

где - оптическая плотность стандартного раствора патулина;

- молярный показатель поглощения раствора патулина при длине волны 276 нм, дм³*моль^-1 *см ^-1 (14600);

М - молярная масса патулина, г/моль;

С - постоянная прибора (обычно С = 1).

Приготовление раствора гидрохлорида МБТГ.

Навеску моногидрата гидрохлорида гидразона З-метил-2-бензотиазолина (МБТГ) массой 0,5 г растворяют в 100 см³ воды.

Приготовленный раствор хранят в холодильнике. Срок годности раствора - 3 сут.

4.2.3 Приборы и лабораторное оборудование

Перед использованием лабораторное оборудование промывают раствором гипохлорита натрия концентрации 10 г/см³.

Лабораторное оборудование:

Хроматографическая колонка длиной 300 мм, внутренним диаметром 22 мм, с резервуаром вместимостью 250 см и запорным краном, снабженная с выходного конца пористым стеклянным диском.

Оборудование для ТСХ: стеклянные хроматографические камеры, длинноволновая ультрафиолетовая лампа (360 нм) и устройство для опрыскивания.

Флюороденситометр.

Пластинки для ТСХ размером 20Ч20 см, покрытые силикагелем (1.3.2.3) толщиной слоя 0,25 мм, без флюоресцентного индикатора.

Сушильный шкаф с принудительной вентиляцией, пригодный для работы при (130 ± 1) °С.

4.2.4 Отбор проб

Проба, поступающая в лабораторию, должна быть представительной и без следов порчи или изменения свойств продукта при транспортировании и хранении.

4.2.5 Проведение испытаний

Приготовление испытуемого раствора

При испытании концентрированных яблочных соков их разводят водой 1:5 по объему. Дальнейшую процедуру проводят для всех продуктов одинаково, как описано ниже.

Пробу объемом 50 см³ экстрагируют порцией смеси этилацетата с хлороформом (3:2 по объему) объемом 50 см³ в течение не менее 1 мин. Экстракцию повторяют еще два раза той же смесью новыми порциями объемом по 60 см³. Экстракты объединяют и фильтруют на воронке с пористым стеклянным фильтром через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см, фильтрат собирают в отгонную колбу вместимостью 250 см³.

Экстракт упаривают не ротационном испарителе под вакуумом досуха, остаток количественно переносят в мерный цилиндр вместимостью 100 см³ , ополаскивая колбу четырьмя порциями этилацетата объемом по 5 см³. Объем содержимого в цилиндре доводят сначала до 25 см³ этилацетатом, затем до 100 см³ толуолом.

Колоночная хроматография

В основание колонки (3.2.3.1) помещают ватный тампон. В колонку вносят 25 см³ толуола и суспензию 15 г силикагеля (3.2.2.1) в 40 см³ толуола. После оседания силикагеля в колонку вносят 15 г безводного сульфата натрия и дают растворителю стечь до верхней кромки насыпного слоя. В колонку вносят экстракт из исследуемой пробы, после чего растворителю дают стечь до верхней кромки насыпного слоя, элюат отбрасывают. В колонку вносят 200 см³ элюирующего раствора (3.2.2.4) и проводят элюирование при скорости потока около 5 см³/мин, элюат собирают в градуированный цилиндр. Собранный элюат упаривают приблизительно до объема 2 см³.

Сконцентрированный элюат количественно переносят в пробирку вместимостью 20 см³ с помощью четырех порций этилацетата объемом около 4 см³ каждая и упаривают досуха в токе азота. Остаток немедленно растворяют в 0,5 см³ этилацетата, так как патулин не стабилен.

Тонкослойная хроматография

Пластинки для ТСХ, предварительно покрытые силикагелем (3.2.2.1), активируют при температуре 110 °С в течение 2 ч. С помощью капиллярной пипетки или микрошприца на пластинку в точку, находящуюся на расстоянии 2 см от левого края и 2 см от нижнего края, наносят аликвотную часть очищенного экстракта из пробы (3.2.5.2) объемом 0,020 см³. В точку, находящуюся на расстоянии 2 см от правого края и 2 см от нижнего края пластинки, наносят 0,005 см³ стандартного раствора патулина (3.2.5.1). В точку, находящуюся на расстоянии 2 см от левого края и 2 см от верхнего края пластинки, наносят также 0,005 см³ стандартного раствора патулина. В точку, находящуюся на расстоянии 2 см от левого края пластинки и 4 см от верхнего края пластинки, наносят 0,010 см³ стандартного раствора патулина (см. рисунок 3.1).

Хроматограмму развивают в направлении I (рисунок 3.1), используя подвижную фазу бензол/метанол/уксусная кислота (3.2.2.2), до прохождения фронтом растворителя расстояния 14 см. Пластинку вынимают из камеры, высушивают на воздухе, после чего развивают хроматограмму в направлении II (рисунок 1), используя подвижную фазу толуол/этилацетат/муравьиная кислоте (3.2.2.2), до прохождения фронтом растворителя расстояния 14 см. Пластинку вынимают из камеры и высушивают при комнатной температуре. Пластинку опрыскивают раствором гидрохлорида МБТГ (3.2.2.6), после чего высушивают в течение 15 мин в сушильном шкафу (3.2.3.5) при температуре 130 ?С.

Направление II

20Ч20 2 12 4 2

Рисунок 3.1 - Двумерная тонкослойная хроматография

4.2.6 Определение количества патулина в экстракте

Количество патулина в экстракте определяют сравнением интенсивности флюоресценции пятна патулина из экстракта с пятнами патулина из стандартного раствора при облучении пластинки длинноволновым ультрафиолетовым светом. Пятно патулина из экстракта ищут на пересечении перпендикулярных линий, соединяющих пятна патулина из стандартного раствора. Если интенсивность флуоресценции пятна патулина из 0,020 см³ экстракта выше интенсивности флюоресценции пятен патулина из стандартного раствора, экстракт разводят этилацетатом и повторяют процедуру ТСХ-анализа по 3.2.3.5.2. Если интенсивность флуоресценции пятна патулина из экстракта сравнима с интенсивностью флюоресценции одного из пятен патулина из стандартного раствора, то концентрация патулина в анализируемой пробе составляет 25 мкг/дм³ либо 50 мкг/дм³ соответственно.

При проведении анализа описанным методом достигается полное отделение патулина от оксиметилфурфурола (ОМФ), поэтому последний не влияет на результаты анализа.

4.2.7 Обработка результатов

Содержание патулина в продукте с_р, мкг/дм³, вычисляют по формуле

, (3.2)

где V₀ -- конечный объем, до которого доведен очищенный экстракт, см³;

V₁ - объем экстракта из пробы, нанесенный на пластинку, см³;

V₂ - объем стандартного раствора патулина (3.2.2.5), соответствующий пятну той же интенсивности флюоресценции, что и пятно патулина из экстракта, см³; с_ps - концентрация патулина в стандартном растворе, мкг/см³ ;

50 - объем пробы, взятый для экстракции, см³.

4.2.8 Точность метода

Сходимость результатов

r = 33,4 мкг/дм³; S_r = 29,4 мкг/дм³,

где r - предел сходимости;

S₂ - среднее квадратическое отклонение сходимости.

Воспроизводимость результатов

R = 41,0 мкг/дм³; S_r = 35,8 мкг/дм³.

где R - предел воспроизводимости;

S_r - среднее квадратическое отклонение воспроизводимости.

4.2.9 Протокол испытаний

В протоколе испытаний указывают.

метод испытаний;

результат испытаний;

- окончательный результат с оценкой сходимости, если была проверена сходимость результатов.

Также следует отметить особенности проведения испытаний, не указанные в стандарте или рассматриваемые как несущественные, с побочными обстоятельствами, способными повлиять на результат испытаний.

Протокол испытаний должен содержать информацию, необходимую для полной идентификации образца [5].

Список использованной литературы

1 Глоба, И. И. Хроматографические и спектральные методы анализа: учеб. пособие для студентов специальности «Физико-химические методы и приборы контроля качества продукции» и химико-технологических специальностей / И. И. Глоба, С. А. Ламоткин. - Минск: БГТУ, 2008. - 352 с.

2 Хроматографические методы анализа // Хроматография [Электронный ресурс]. - 2010. - Режим доступа: http: //www.eurolab.ru/hromatograficheskie_meto-dy_analisa.html. - Дата доступа: 15.03.2010.

3 Васильев, В. П. Теоретические основы физико-химические методов анализа: учеб. пособие / В. П. Васильев. - Минск: Высш. шк., 1978. - 182 с.

4 Отто, М. Современные методы аналитической химии (в 2-х томах). Т. 2 / М. Отто. - Москва: Техносфера, 2004. - 288 с.

5 Шаповалова, Е. Н. Хроматографические методы анализа: методическое пособие для специального курса / Е. Н. Шаповалова, А. В. Пирогов; под. ред. О. А. Шпигуна. - Москва: МГУ им. Ломоносова, 2007. - 205 с.

6 Продукты переработки плодов и овощей. Методики определения сорбиновой и бензойной кислот при их совместном присутствии спектрофотометрическим и хроматографическим методами: СТБ 1181-99. - Введ.01.03.2000. - Минск, 2000. -13 с.

7 Качество воды. Определение некоторых хлорорганических инсектицидов полихлорных бифенилов и хлорбензолов методом газовой хроматографии после экстракции жидкость-жидкость: СТБ ИСО 6468-2003. - Введ. 01.05.2004. - Минск: БелГИСС, 2004. - 26 с.

8 Комбикорма, зерно и продукты его переработки. Метод определения содержания дезоксиваленола (валитоксина): СТБ ГОСТ Р 51116-2002. - Введ. 01.01.2003. - Минск: БелГИСС, 2003. - 8 с.

9 Сок яблочный, сок яблочный концентрированный и напитки, содержащие яблочный сок. Метод определения содержания патулина с помощью тонкослойной хроматографии: СТБ ГОСТ Р 51440-2006. - Введ.01.06.2007. - Минск: БелГИСС,2007. - 5 с.

10 Водка и спирт этиловый. Газохроматографический экспресс-метод определения содержания токсичных микропримесей: СТБ ГОСТ Р 51698-2001. - Введ. 01.01.2001. - Минск: БелГИСС,2001. - 10 с.

11 Продукты переработки плодов и овощей. Газохроматографический метод определения содержания бензойной кислоты: ГОСТ 30699-2000. - Введ. 01.11.2000. - Минск: БелГИСС,2000. - 7 с.

12 Соки цитрусовые. Метод определения массовой концентрации гесперидина и нарингина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии:ГОСТ Р 51427-99. - Введ. 01.01.2001. - Москва: Издательство стандартов, 2002. - 7 с.

13 Соки фруктовые. Метод определения содержания винной кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии: ГОСТ Р 51428-99. - Введ. 01.01.01. - Москва: Издательство стандартов, 2002. - 7 с.

Размещено на Allbest.ru