Розробка методики кількісного визначення дигідрокверцетину

Размещено на http://www.allbest.ru/

РОЗРОБКА МЕТОДИКИ КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ ДИГІДРОКВЕРЦЕТИНУ

О.Ю. Владимиров, О.А. Здорик,

В.А. Георгіянц, Г.О. Бур'ян, А.І. Абу Шарк,

Л.О. Петрушова, Т.В. Алексеева,

І.А. Данилова, В.В. Гриненко

Анотація

На сьогодні помітно зростає науковий інтерес до вивчення флавоноїдів в рослинних об'єктах, що пов'язано з їх високою біологічною активністю. У зв'язку з цим актуальним завданням аналітичної хімії є розробка доступних аналітичних методик визначення флавоноїдів в рослинних об'єктах.

Мета. Метою роботи була розробка специфічної методики кількісного визначення дигідрокверцетину і визначення її валідаційних характеристик.

Методи. Розроблена фотоколориметрична методика кількісного визначення ДКВ, яка базувалась на специфічній реакції утворення ціанідинхлориду при додаванні до розчину дигідрокверцетину цинкового порошку у кислому середовищі.

Результати. Розроблено фотоколориметричну методику визначення флавоноїдів в перерахунку на ДКВ, визначені її основні валідаційні характеристики. Отримані метрологічні характеристики фотоколори- метричної методики визначення ДКВ не перевищували критерії прийнятності відповідно до вимог Державної фармакопеї України.

Висновки. За результатами статистичної обробки експериментальних даних встановлено, що розроблена методика може бути використана для кількісного визначення ДКВ. Отримані метрологічні данні свідчать, що методика відтворювалась в умовах двох різних лабораторій, з довірчою вірогідністю 95 % відхилення одиничного значення складало 101,85±2,54 %

Ключові слова: фотоколориметричний метод, кількісне визначення, валідаційні характеристики, Державна фармакопея України, дигідрокверцетин

Today is markedly increasing scientific interest in the study of flavonoids in plant objects due to their high biological activity. In this regard, the urgent task of analytical chemistry is in developing available analytical techniques of determination for flavonoids in plant objects.

Aim. The aim was to develop specific techniques of quantitative determination for dihydroquercetin and determination of its validation characteristics.

Methods. The technique for photocolorimetric quantification of DQW, which was based on the specific reaction of cyanidine chloride formation when added zinc powder to dihydroquercetin solution in an acidic medium has been elaborated.

Results. Photocolorimetric technique of determining flavonoids recalculating on DQW has been developed, its basic validation characteristics have been determined. The obtained metrological characteristics of photocolorimetric technique for determining DQW did not exceed admissibility criteria in accordance with the requirements of the State Pharmacopoeia of Ukraine.

Conclusions. By the results of statistical analysis of experimental data, it has been stated that the developed technique can be used for quantification of DQW. Metrological data obtained indicate that the method reproduced in conditions of two different laboratories with confidence probability 95 % unit value deviation was 101,85±2,54 %

Keywords: photocolorimetric method, quantitative determination, validation characteristics, the State Pharmacopoeia of Ukraine, dihydroquercetin

Вступ

Захисна роль поліфенолів і біофлавоноїдів обумовлена їх антиоксидантними властивостями. Крім того, деякі біофлавоноїди мають антибактеріальні і фунгіцидні (протигрибкові) властивості. В ході лабораторних і епідеміологічних досліджень було доведено, що флавоноїди мають цінні хімічні, біологічні і біохімічні якості, важливі для захисту здоров'я і запобігання захворюванням.

Флавоноїди впливають на діяльність багатьох ферментів і перебіг біохімічних процесів, тому їх застосування має комплексний вплив на весь організм. Сьогодні флавоноїдвмісна лікарська рослинна сировина і препарати на її основі використовують як у традиційній, так і народній медицині [1-3].

Постановка проблеми у загальному вигляді, актуальність теми та її зв'язок із важливими науковими чи практичними питаннями

На сьогодні помітно зростає науковий інтерес до вивчення флавоноїдів в рослинних об'єктах, що пов'язано з їх високою біологічною активністю. Флавоноїди застосовують у складі профілактичних і лікувальних засобів, а також функціональних харчових продуктах [4-6].

Аналіз останніх досліджень і публікацій, в яких започатковано розв'язання даної проблеми і на які спирається автор

Відомі спектрофотометричні методики визначення вмісту флавоноїдів, засновані на реакціях утворення комплексів з іонами алюмінію або заліза (III), обмежено придатні для виконання масових аналізів, оскільки лежать в їх основі фотометричні реакції є кінетично уповільненими [7-10].

Виділення невирішених раніше частин загальної проблеми, якій присвячена стаття

У зв'язку з цим актуальним завданням аналітичної хімії є розробка методик визначення флавоноїдів в рослинних об'єктах. При цьому для фармацевтичних лабораторій найбільший інтерес являють методики, засновані на принципах широкодоступних аналітичних методів, зокрема фотоколориметричного методу.

Формулювання цілей (завдання) статті

Метою роботи була розробка специфічної методики кількісного визначення ДКВ і визначення її валідаційних характеристик.

Виклад основного матеріалу дослідження (методів та об'єктів) з обґрунтуванням отриманих результатів

Розробка фотоколориметричної методики кількісного визначення ДКВ базувалась на специфічній реакції утворення ціанідинхлориду при додаванні до розчину ДКВ цинкового порошку у кислому середовищі, за допомогою якої можна відрізнити ДКВ від інших БАР (рис. 1) [7, 11].Методика кількісного визначення. У колбу на 25 мл відвішували 0.40 г цинкового пилу, потім вносили 10.0 мл модельного розчину ДКВ, перемішували та додавали 2.0 мл розчину суміші кислот (суміш концентрованої хлористоводневої кислоти, льодяної оцтової кислоти та води у співвідношенні 3:3:1 (об.%)). Не перемішуючи, колбу поміщали на водяну баню (50 °С) і витримували 1 хв, після чого виймали і інтенсивно струшували 1 хв. Розчин відстоювали протягом 3 хв, потім вміст колби декантували у пробірку і через 2 хв фотометрували при 550 нм. Як розчин порівняння використовували розчин, що містив 2.0 мл суміші кислот і 10.0 мл спирту етилового 96 %. Паралельно проводили вимірювання поглинання розчину робочого стандартного зразка ДКВ аналогічно за методикою. Вимірювання оптичних густин аналітичних розчинів і розчину робочого стандартного зразка проводили з використанням кювети з товщиною шару 3 см при температурі (20±2) °С за одних і тих самих умов з мінімальним інтервалом у часі. Розрахунок вмісту ДКВ у г/мл здійснювали за формулою для методу стандарту.

Приготування модельних розчинів ДКВ. Готували п'ять модельних розчинів ДКВ у спирті етиловому 96 % наступних концентрацій Ы0-5, 2-10-5, 3-10-5, 4-10-5, 5-10-5 г/мл. Для кожного з розведень вимірювання оптичної густини проводили тричі за методикою наведеною вище, таким чином сумарна кількість випробувань становила n=15.

Розчин суміші кислот: суміш концентрованої хлористоводневої кислоти, льодяної оцтової кислоти та води у співвідношенні 3:3:1 (об.%).

Основні завдання, які вирішувалися при розробці методики кількісного визначення ДКВ:

- визначення умов перебігу реакції;

- підбір розчинника, співвідношень реактивів та створення рН середовища, які б давали змогу стабілізувати забарвлення аналітичних розчинів;

- вибір аналітичної довжини хвилі.

Експериментально було встановлено, що при відновленні ДКВ цинковим порошком в середовищі концентрованої хлористоводневої кислоти, стабільність ціанідинхлориду незначна. При використанні суміші розведеної хлористоводневої та льодяної оцтової кислоти у співвідношенні 1:1 (об.%) стійкість продукту реакції дещо збільшувалась, але не перевищувала 5 хв. Відновлення спиртового розчину ДКВ в ацетоні 10 % хлористоводневою кислотою призводило до появи забарвлення тільки через 60 хв. Оптимальним варіантом виявилося відновлення ДКВ цинковим порошком та сумішшю, що складалася із концентрованої хлористоводневої кислоти, льодяної оцтової кислоти та води у співвідношенні 3:3:1 (об.%). Маса цинкового порошку (0,4 г), що використана для відновлення, була визначена, виходячи з достатньої її кількості для відновлення ДКВ і суттєво не впливала на утворення забарвленого продукту. Максимум поглинання продукту відновлення ДКВ спостерігався при 550 нм, спектр поглинання представлений на рис. 2. Слід зазначити, що спиртовий розчин ДКВ у діапазоні 500-600 нм не поглинав, що було доведено відтворенням досліду для розчину робочого стандарту за методикою без додавання цинкового порошку - Ablank=0,001; оптична густина робочого стандартного зразку за методикою АРСЗ=0,372, отже 5exc=100 %-0,001/0,372=0,27 %, що підтверджувало специфічність методики.

Розчин робочого стандартного зразка ДКВ: 0. 3000 г ДКВ поміщали у мірну колбу місткістю 100 мл, додавали 70 мл спирту етилового 96 %, після повного розчинення доводили об'єм до мітки та знову перемішували. 1 мл отриманого розчину поміщали у мірну колбу місткістю 100 мл та доводили об'єм до мітки тим самим розчинником.

В якості розчинників були випробувані ацетон, спирт етиловий 96 % та водно-спиртові розчини, ДКВ добре розчинявся в усіх із вказаних, однак за результатами досліджень, стабільність оптичної густини у часі відрізнялась.

Розчинення ДКВ в ацетоні, водно-спиртових розчинах та подальше проведення хімічної реакції приводило до появи малинового забарвлення розчину, але інтенсивність забарвлення і, відповідно, оптична густина були нестабільними. Оптимальним розчинником ДКВ для проведення колориметричної реакції виявився спирт етиловий 96 %. Отриманий в результаті реакції продукт відновлення мав достатнє забарвлення та стабільність у часі (табл. 1).

За результатами визначення стабільності було встановлено, що за даною методикою більш точні результати можна отримати при фотометру- ванні аналітичних розчинів через 15 хв після дека- нтування.

Використовуючи підхід одночасного визначення валідаційних характеристик, правильність, лінійність та збіжність визначали за отриманими результатами для 15 проб модельних зразків різних концентрацій. Вивчення валідаційних характеристик методики проводили у концентраційному діапазоні 1^10“5--5 * 10-5 г/мл (табл. 2-7). Дослідження впливу міжлабораторних варіацій (різне обладнання, різні аналітики) проводили у двох різних лабораторіях.

Таблиця 1

Дослідження оптичної густини в часі

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2 Спектр поглинання продукту відновлення ДКВ

Таблиця 2

Розрахунок правильності і прецизійності методики визначення кількісного вмісту флавоноїдів в перерахунку на ДКВ (лабораторія 1)

Таблиця 3

Розрахунок правильності і прецизійності методики визначення кількісного вмісту флавоноїдів в перерахунку на ДКВ (лабораторія 2)