Пробоподготовка QuЕChERS при определении пестицидов различных химических классов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ПРОБОПОДГОТОВКА QuЕChERS ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ПЕСТИЦИДОВ РАЗЛИЧНЫХ ХИМИЧЕСКИХ КЛАССОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ

Войкина Анна Владимировна канд. биол. наук

Бугаев Леонид Анатольевич канд. биол. наук, доцент

Аннотация

Разработан способ одновременного определения действующих веществ пестицидов различных химических классов в биологическом материале (печень рыб) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием с использованием быстрой методики подготовки проб QuEChERS. Подобран оптимальный состав и объем реагентов для экстракции, время центрифугирования и обработки ультразвуком, природа и состав сорбентов, обеспечивающие максимальные значения степеней извлечения исследуемых веществ из матрицы и их очистку от мешающих веществ. В качестве экстрагента использовали ацетонитрил. Экстрагирование проводили в присутствии буферирующей смеси - натрия лимоннокислого трехзамещенного (двойной гидрат) и натрия лимоннокислого двухзамещенного (полуторный гидрат). Для очистки полученного экстракта от соэкстрагируемых веществ (жиров, белков, сахаров, органических и жирных кислот, пигментов и других примесей) использовали насыпные сорбенты Bondesil PSA (алкилированный амин, содержащий две аминовые функциональные группы -- вторичную и первичную) и С18Е (обращено-фазовый сорбент на основе силикагеля с привитыми октадецилсилановыми группами). Степень извлечения анализируемых действующих веществ пестицидов из печени рыб составила ? 79 %. Диапазоны определяемых содержаний пестицидов составил от 0,4 до 0,97 мг/кг. Величина относительного стандартного отклонения результатов анализа составляла 0,01-0,14

Ключевые слова: ПЕСТИЦИДЫ, QUECHERS, СОРБЕНТЫ, ВЭЖХ, СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ, ПРОБОПОДГОТОВКА

The method has been developed of simultaneous determination of active ingredients of different kinds of pesticides in biological tissues (fish liver) by applying HPLC with ultra-violet detection and the rapid method of QuEChERS sample preparation. We defined optimum volume and composition of the reagents for the extraction, time of centrifugation and ultrasound treatment, the origin and composition of sorbents that ensure maximum extraction of the substances studied and further cleanup of interfering substances. Acetonitrile was used as a solvent. The extraction was carried out in the presence of a buffering mixture - trisodium citrate dihydrate and disodium citrate hemihydrate. Bondesil PSA bulk sorbents (alkylated amine containing two amine functional groups - secondary and primary) and C18E (reversed-phase sorbent based on silica gel with grafted octadecylsilane groups were used to purify the extract from coextractable substances (fats, proteins, sugars, organic and fatty acids, pigments and other impurities). The degree of extraction of the analyzed active ingredients of pesticides from the liver of fish was 79%. The detectable pesticide concentrations ranged from 0,4 to 0,97 mg/kg. The relative standard deviation of the analysis results amounted to 0,01-0,14

Keywords: PESTICIDES, QUECHERS, BIOMATERIAL, HPLC, DEGREE OF EXTRACTION, SAMPLE PREPARATION

Применение пестицидов строго регламентировано через систему государственной регистрации, которая предусматривает разработку регламентов их применения. Эти мероприятия сопровождаются системой мониторинга остаточных количеств пестицидов в объектах окружающей среды и продуктах питания, которая позволяет собирать обширные данные по загрязнённости остатками пестицидов, проводить их анализ и оперативно реагировать на обстановку. Для осуществления таких программ необходимы высокочувствительные методы анализа остаточных количеств пестицидов, позволяющие детектировать и количественно оценивать уровни остаточных концентраций пестицидов ниже официально установленных по требованиям безопасности. В настоящий момент, в России в исследованиях по осуществлению мониторинга остаточных количеств пестицидов в основном используются индивидуальные методы их определения (конкретно для каждого вещества), что значительно повышает стоимость анализов и снижает производительность лабораторий [1].

При разработке новых методов определения веществ предпочтение в настоящее время отдается методикам, позволяющим идентифицировать максимально широкий круг аналитов в одной пробе для использования всех аналитических возможностей новых приборов. В итоге сформировалась схема анализа, основанная на экстракции матрицы органическим растворителем, очистке методом твердофазной экстракции, идентификации и количественном определении хроматографическими методами. Такая схема успешно применяется в настоящее время для анализа некоторых антибиотиков, сульфаниламидов и микроколичеств пестицидов в продуктах питания. Разработчики назвали этот метод пробоподготовки “Кэтчерс” (QuEChERS - абрeвиатура от основных достоинств метода: быстрый, простой, дешевый, эффективный, точный, надежный). До настоящего времени этот метод не применялся для токсикологических анализов биологического материалы гидробионтов. Хотя принцип подготовки проб универсален, необходимо оптимизировать только условия экстракции и очистки, тип и количество сорбента для стадии очистки [2].

В данной работе нами предложен экономичный способ одновременного определения действующих веществ пестицидов с использованием предварительной подготовки образцов биологического материала (печень рыб) по методу QuEChERS. Это универсальный метод пробоподготовки проб позволяет извлечь остаточные количества пестицидов, принадлежащих к различным классам химических соединений, за один прием в несколько простых этапов.

Материалы и методы исследования

В работе использовали жидкостной хроматограф фирмы «Applied Biosystems» (США), снабженный детектором спектрофотометрическим Applied Biosystems Kratos 757 с дейтериевой лампой. Рабочий диапазон от 190 до 360 нм, максимальная чувствительность 0,005 AUFS. Колонка Reprosil-PUR ODS (размер 4Ч150 мм, зернение-5,0 мкм). Для удаления пузырьков воздуха в подвижной фазе использовали дегазатор DG-18. Обработку данных производили с помощью программного обеспечения Мультихром 1,5. Ультразвуковая ванны с механическим таймером и подогревом VBS-3H (Вилитек, Россия), Центрифуга DSC-302SD с ротором AR-1512 (Hsiang, Китай).

Использовали стандартные образцы пестицидов фирмы «Bayer Crop-Science», Германия (чистота >98 %): имазапир, имидаклоприд, имазетапир, ципросульфамид, метрибузин, фенмедифам, флумиоксазин, хизалофоп-П-этил, этофумезат, ипродион, флуфенацет, флубендиамид, фамоксадон, пенцикурон, дифлуфеникан. Стандартные растворы пестицидов с концентрацией 100 мкг/мл готовили из сухих образцов, используя в качестве растворителя ацетонитрил. Градуировочные растворы пестицидов хранили в рабочей камере холодильника при температуре +3-5°С в герметично закрытых стеклянных емкостях не более 3 месяцев. Перед использованием растворы выдерживали при комнатной температуре не менее 20 мин. Рабочие растворы смеси пестицидов готовили путем разбавления стандартных растворов индивидуальных пестицидов ацетонитрилом непосредственно перед использованием. Использовали ацетонитрил «осч.» 1 сорт («Криохром», Россия), воду бидистиллированную (ТУ 6-09-2502-77), кислоту ортофосфорную («х.ч.»), сорбент Bondesil PSA 40 мкм («Varian», США), сорбент С18Е 40-63 мкм («Биохиммак», Россия), магний сернокислый, безводный («х.ч.»), натрий лимоннокислый двузамещённый 1,5-водный («х.ч.»), натрий лимоннокислый трехзамещённый 2-водный («х.ч.»).

Экстракцию пестицидов из печени рыб и очистку экстрактов осуществляли по методу QuEChERS. Навеску образца массой 5 г гомогенизировали при низкой температуре и помещали в центрифужные пробирки на 50 мл. Добавляли в пробирки 5 г сульфата магния () для поглощения влаги и тщательно растирали. Добавляли 0,6 г соли натрия лимоннокислого двухзамещенного (полуторный гидрат) и 0,5 г соли натрия лимоннокислого трехзамещённого (двойной гидрат), приливали 8 мл ацетонитрила, слегка встряхивали и подвергали обработке ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 1 минуты, затем оставляли при комнатной температуре на 30 минут. Далее пробирки помещали в центрифугу и центрифугировали в течение 5 минут (4000 об/мин). Жидкость над осадком декантировали в заранее приготовленные центрифужные пробирки объемом 15 мл с 1,2 г сульфата натрия (), 0,05 г Bondesil PSA (сорбент) и 0,05 г С18Е (сорбент), перемешивали вручную в течение 1 минуты и оставляли при комнатной температуре на 40 минут. Пробирки помещали в центрифугу и центрифугировали в течение 5 минут (4000 об/мин). Полученный экстракт декантировали в роторные колбы для вакуумного испарителя и выпаривали до объёма 1 мл и проводили хроматографическое разделение.

Результаты исследования и их обсуждение

Комплексный подход к объединенному применению экстракции, разделения, и очистки экстракта дают возможность проводить пробоподготовку с минимальными потерями аналита на лабораторной посуде, на фильтре, при концентрировании на ротационных испарителях, на сорбентах или обезвоживающих реагентах. Использование современных методов идентификации и количественного определения остатков пестицидов делают QuEChERS общим методом анализа множественных остатков пестицидов и иных ксенобиотиков, что соответствует современным тенденциям аналитической химии пестицидов [3].

Размещено на Allbest.ru