Особенности применения биокатализа в медицине и науке

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Биокатализ и его основы

2. Применение биокатализа в науке

3. Применение биокатализа в медицине

Заключение

Литература



Введение

Биокатализ или ферментативный катализ это ускорение биохимических реакций под действием белковых макромолекул - энзимов.

Биокатализ известен издревле, хотя его природа была раскрыто лишь в конце XIX века. С раскрытием природы ферментативных реакций стали появляется способы применения биокатализа в различных отраслях промышленности. Биокаталитические процессы имеют широкое применение в изготовлении тканей, молочных продуктов, кормовых добавок, в кожедубильной и деревообрабатывающей промышленности. Большое значение ферментативные реакции имеют в тонконаправленном химическом синтезе. Биокатализ имеет большое значение в развитие медицины, где его применяют для разнообразных целей. Невозможно переоценить вклад биокатализаторов, который они вносят в лечение и диагностику многих заболеваний (например, рибозимы для лечения СПИДа, абзимы в качестве каталитических вакцин, различные регуляторы) в исследование патобиохимических процессов и роли в них тех или иных веществ. Немалую роль биокатализ играет и в науке: ферментативный катализ часто используется для раскрытия природы биохимических реакций, для катализа химических реакций, для получения соединений с точно заданной конфигурацией. С ферментативным катализом связаны перспективы развития иммуноферментного и биолюминесцентного анализа, применения биосенсоров. С развитием науки и медицины возрастает количество направлений и способов применения биокаталитических процессов в них.

Методы генной инженерии и химической энзимологии позволяют получать ферменты с заданной каталитической активностью, способные катализировать нужную реакцию с получением заранее известных продуктов, что является большим плюсом для их применения в медицине и науке.



1. Биокатализ и его основы

Ферментативный катализ разновидность химического катализа, происходящий под действием природных макромолекул как в живой клетке так и вне её.

Первое исследование ферментативного катализа как химического процесса было выполнено К. Кирхгофом, который в 1814 продемонстрировал ферментативную конверсию крахмала в растворимые углеводы. В конце ХIX века Э. Фишер высказал гипотезу о специфичности ферментативных реакций и тесном стерическом соответствии между субстратом и активным центром фермента. Основы кинетики ферментативных реакций были заложены в работах Л. Михаэлиса (1913).

В ХХ веке происходит интенсивное изучение химических основ ферментативного катализа, получение ферментов в кристаллическом состоянии, изучение структуры белковых молекул и их активных центров, исследование большого числа конкретных ферментативных реакций и ферментов.

В простейшем случае уравнение реакции с участием фермента имеет вид: биокатализ генный макромолекула химический

где E фермент, S субстрат, ES фермент-субстратный комплекс (т), Pпродукт реакции. Часто субстрат образует ковалентные связи с функциональным группами активного центра, в том числе и с группами кофермента. Большое значение в механизмах ферментативных реакций имеет основной и кислотный катализ, реализуемый благодаря наличию имидазольных групп остатков гистидина и карбоксильных групп дикарбоновых аминокислот.

Важнейшие особенности биокатализа эффективность, специфичность и чувствительность к регуляторным воздействиям. Ферменты увеличивают скорость химического превращения субстрата по сравнению с нефермен-тативной реакцией в 109-1012 раз. Так, если процесс под действием какого-либо фермента протекает в течение одной секунды, та же реакция под действием «классического» химического катализатора иона водорода будет протекать 200 тысяч лет! Столь высокая эффективность обусловлена особенностями строения активного центра.

Большинство ферментов обладает высокой субстратной специфичностью, то есть способностью катализировать превращение только одного или нескольких близких по структуре веществ. Специфичность определяется топографией связывающего субстрат участка активного центра.

Ферментативные реакции чувствительны к внешним условиям, в частности к ионной силе раствора и рН среды, температуре, и регулируются многочисленными ингибиторами и активаторами, присутствующими в организме. Ингибиторами и активаторами могут служить сами субстраты, продукты реакции, а также конечные продукты в цепи последовательных превращений вещества. Фундаментальные исследования и практические работы последних десятилетий привели к тому, что ферменты стали наиболее распространенными, наиболее доступными и наиболее изученными катализаторами, обеспечивающими развитие многих направлений химии, медицины, экологии, возобновляемой энергетики.

Преимущества биокатализа:

§ Мягкие условия

§ Высокая специфичность

§ Стериои региоелективность

§ Биокатализаторы из возобновляемого сырья

§ Отсутствие побочных продуктов

§ Экологическая безопасность.



2. Применение биокатализа в науке

Основными направлениями применения биокатализа в науке являются: применение ферментов в качестве катализаторов и регуляторов в химическом синтезе; и применение ферментов и ферментативных реакций биологических исследованиях

Биокатализ в тонком органическом синтезе.

Одним из ярких примеров применения биокатализа является его использование ‚в тонком ‚органическом синтезе. Уникальная специфичность и стереоспецифичность действия ферментов, возможность проведения процессов в «мягких» условиях, протекание реакций с высокой скоростью при использовании незначительных количеств катализатора, практическое отсутствие побочных реакций--все это делает биокаталитические процессы чрезвычайно привлекательными и перспективными с технологической точки зрения. На сегодняшний день перечисленные преимущества технологических процессов с использованием ферментов особенно наглядны при создании лекарственных препаратов (антибиотики, стероиды, простагландины и т.д.), получении энантиомеров аминокислот и ряда других органических соединений, пептидов, производстве реагентов для научных исследований и меченых веществ.

Для осуществления биокаталитического процесса необходимо решить целый комплекс научно-исследовательских и технологических задач:

1. Провести поиск фермента необходимой специфичности или стереоспецифичности.

2. Изучить основные свойства исходных веществ. и продуктов реакций и их возможные превращения.

З. Выявить факторы, определяющие эффективность биокаталитического превращения.

4. Создать на основе феррмента подходящий катализатор для

технологического процесса.

5. Провести аппаратурное оформление масштабного биотехнологического процесса.

В связи с тем, что решение всех перечисленных задач требует комплексного похоца и широкого взаимодействия представителей различных специальностей, на сегодняшний день имеется ограниченное число реализованных биокаталитических процессов в области тонкого органического синтеза.

Достоинства существующих биокаталитических процессов велики, что в скором времени произойдет внедрении ряда новых технологий с использованием ферментов.

Биокатализа в химическом синтезе применяется в двух направлениях. 1) Альтернативные процессы получения химических соединений, в том числе крупнотоннажных продуктов тяжелого органического синтеза. По некоторым прогнозам 10-20% промышленных химикатов скоро будет производиться биотехнологическим путем.

2) Разработке гибридных процессов, в которых одной из ключевых стадий является биохимическая конверсия субстрата, а также модернизации традиционных химических производств введением в производственный процесс биокаталитической стадии с участием ферментов или бактериальных клеток.

Альтернативные процессы. Одно ведущих мест в промышленном освоении биокаталитических процессов занимают процессы окислительной биотрансформации органических соединений, в том числе, углеводородного сырья. Наиболее яркий пример альтернативного процесса производство оптических изомеров эпоксидов непредельных углеводородов которые, как известно, применяются в тонком органическом синтезе при производстве биологически активных веществ. Процессы селективного окисления легких газообразных углеводородов в ценные окси-продукты являются ключевыми для химических производств переработки газа и нефти. Широко используемые в данных процессах гетерогенные катализаторы оксидной природы обладают достаточно ограниченными возможностями: максимальная селективность по желаемому продукту, равная 80-95%, достигается только при малых степенях превращения исходного углеводорода, не превышающих 5%. Более высокие результаты по селективности (до 70%) при конверсии более 5% достигаются либо при участии закиси азота в качестве окислителя, либо при использовании для приготовления катализаторов драгоценных металлов (золота, паладия, рутения).

Использование биокатализа и биотехнологии для производства химикатов нетрадиционный подход к решению проблем основного органического синтеза. Биокаталитические процессы привлекают внимание своими уникальными характеристиками: малой энергоемкостью вследствие мягких условий протекания реакций (температуры не выше 40оС); высокой селективностью, близкой к 100%, которая, что очень важно, не зависит от степени превращения исходного субстрата; а также стереоспецифичностью, заключающейся в образовании хиральных соединений. По основным параметрам (активность, выход) биокатализаторы находятся на уровне лучших гетерогенных катализаторов химический природы.

Еще одним методом альтернативныго катализа может служить ферментативное восстановление окиси углерода при катализе экстрактами клеток сульфатредуцирующих бактерии? в рамках стабильнои? реакционнои? системы. Экстракты клеток Desulfovibrio desulfuricans В-1388 катализируют восстановление окиси углерода молекулярным водородом . Реакция проходит при комнатнои? температуре в неи?тральных буферных растворах. Продуктами реакции являются парафиновые углеводороды от С8 до С24, Активность фермента сохраняется в присутствии октана с добавлением ПАВ.

Гибридные процессы. Как отмечалось выше, гибридный процесс представляет собой многостадийный синтез конечного коммерческого продукта, при этом одна из стадий получения промежуточного вещества, требующая региоили стерео-селективности, осуществляется биокатализаторами ферментами или микроорганизмами, обладающими необходимой ферментативной активностью.

Наибольшее применение в практике пока нашли гидролитические ферменты.

Гидролазы энантиоселективны, избирательны к типу катализируемой реакции и часто проявляют широкую субстратную специфичность в реакции данного типа. Хотя для них характерно ингибирование продуктами реакции и даже подавление ферментативной активности при высоких концентрациях субстрата, эти факторы чаще всего не ограничивают использования ферментов этого класса. Так как микроорганизмы содержат значительные количества различных гидролаз, ферменты этого класса весьма доступны и могут быть получены в необходимых количествах.

Ферментативная модификация В--паитамных антибиотиков

Особенно ярко возможности и достоинства гидролаз были продемонстрированы при модификации самых эффективных и широко применяемых антибиотиков пенициллинов и цефалоспоринов.

Получение новых, более эффективных аналогов пенициллина связано с изменением его боковой цепи при сохранении целостности остальной части, так называемого «ядра» антибиотика 6-аминопенициллановой кислоты:

Самым простым путем проведения необходимого превращения является отщепление боковойцепи биосинтетического пенициллина, выделение 6-аминопенициллановой кислоты и последующее ацилирование ее аминогруппы с получением ‹полусинтетического» аналога. Такая модификация представляет собой сложную задачу, поскольку при удалении боковой цепи необходимо расщепить весьма устойчивую амидную связь и сохранитьзначительно более лабильную связь в В-лактамном кольце пеиициллина ее разрушение ведет к необратимой инактивации антибиотика. Провести такую химическую реакцию в обычных условиях не удается, так как при щелочном гидролизе пенициллинов выход 6-аминопенициллановой кислоты не превышает 1%. Поэтому для удаления бокового радикала в молекуле антибиотика химическим путем необходим специальный подход, например получение его иминоэфира и последующий гидролиз иминоэфира при низкой температуре (от -25 до -40°С). Такой процесс многостадийный, энергоемкий и требует использования больших объемов органических растворителей.

Подобное избирательное превращение может быть проведено в одну стадию в самых обычных условиях при 10--40°С в водной среде с использованием спефического фермента пенициллинамидазы. Переход к биокаталитической технологии существенно упрощает процесс, позволяет значительно поднять выход целевого продукта и увеличить объем производства. Внедрение масштабного метода производства 6-аминопенициллановой кислоты привело к существенному увеличению выпуска полусинтетических пенициллинов и снижению их себестоимости.

С использованием иммобилизованной пенициллинамидазы связан еще один процесс инженерной энзимологии получение 7-аминодезацетоксицефало-спорановой кислоты, ключевого соединения для синтеза новых цефалоспоринов. Он также основан на свойстве пенициллинамицазы катализировать гидролиз весьма устойчивой связи в молекуле исходного соединения 7-фенилацетамидодезацетоксицефало-спорановой кислоты при сохранении целостности лабильного В-лактамного кольца.

Ферментативное превращение рацематов : энантиомеры

Примером практического использования биокатализа служит ферментативное превращение рацематов в энантиомеры аминокислот. Поскольку скорости ферментативного расщепления энантиомеров исхоцного соединения, как правило, сильно различаются, это позволяет получить энантиомеры аминокислот чрезвычайно высокой оптической чистоты.

При помощи ацилаз можно разделить рацемические смеси большинства аминокислот. Ацилазы аминокислот широко распространенные ферменты, они соцержатся в тканях животных у растений и микроорганизмов. Ферменты из различных источников различаются по своей субстратной специфичности. Разделять рацемические смеси аминокислот можно, используя не только ацилазы, но также и рял протеолитических ферментов, обладающих высокой стереоспецифичностью в реакции гидролиза сложных эфиров аминокислот. И в этом случае соотношение скоростей гидролиза Lи D-формы исходного субстрата может составлять десятки тысяч раз. В принципе возможно получение энантиомеров аминокислот из рацемических смесей и при помощи энантиоселективного ферментативного декарбокейлирования, хотя в результате подобной реакции теряется половина исходного вещества. При использовании оксидаз LD-аминокислот из рацемата можно получить а-кетокислоту и Dили L-амннокислоту.

К перспективному способу получения оптически чистых аминокислот относится энантиоселективное ферментативное превращение в аминокислоты ряда циклических производных, химический синтез рацематов, который представляет собой более легкую задачу, чем получение рацемата самой аминокислоты. При помощи а-аминокапролактамгидролазы L изомер а-аминокапролактама может быть превращен в L-лизин. Остающийся L а-аминокапролактам можно подвергнуть рацемизации либо под действием D-a-аминокяпролактамрацемазы, либо химически возвращать в процесс. Указанные стадии могут быть,оформлены в эффективный метод получения L-лизина.

Важным путем синтеза а-аминофенилуксусной кислоты, необходимой для производства L-лактамных антибиотиков, является использование гидантоиназы (дигидропиримидиназы), катализирующей превращение 5-фенгидантонна в N-карбамоил-L-а-аминофенилуксусную кислоту, которая в дальнейшем либо химически, либо при помощи специфического фермента превращается в необходимую О-аминокислоту.

Подобно тому как амнноацилазы и некоторые протеазы используются для получения энантиомеров аминокислот, многие другие гидролитические ферменты могут идти на получение различных оптических изомеров сложных органических соединений.

Такие методы синтеза характеризуются помимо высокоточности, большим выходом, например, ферментативный синтез цефалотина из тиенилуксусной и 7-аминоцефалоспорановой кислот при концентрациях реагентов 50и 5 ммоль/л протекает с выходом 94%. Прямой синтез даже в термодинамически оптимальных условиях идет с выходом, недостаточным для практического применения.

Применение биокатализа в биологических исследованиях

Применение в биолюминесценции

В качестве тест-объектов можно использовать реакции, катализируемые люциферазой, биферментной системой: НАДН:ФМН-оксидоредуктаза - люцифераза. Тесты на основе многозвенных цепей сопряжения ферментов с люциферазами позволили значительно расширить круг веществ, анализируемых биолюминесцентным методом и включить в него соединения, не принимающие непосредственного участия в биолюминесценции. Использование ферментативных реакций в качестве индикаторных систем реакции антиген антитело привело к созданию различных вариантов гомогенных и гетерогенных иммуноферментных методов, в которых в качестве ферментов маркеров наряду с пероксидазой хрена и щелочной фосфатазой используются люциферазы. Иммунобиолюминесцентные методы решают проблему избирательного анализа для веществ, не участвующих прямо или опосредованно в процессе биолюминесценции ксенобиотиков, ингибиторов биологической активности и токсикантов. В иммуноферментном биолюминесцентном анализе апробированы люциферазы почти всех светящихся организмов, причем наибольшей популярностью пользуется биолюминесцентная система светляков. Биолюминесцентный анализ используется в гистохимии для получения трехмерной картины распределения метаболитов в срезах тканей мозга, в "аутолюмографии" для определения локализации ферментов на фотопленку в полиак¬риламидном геле при электрофорезе и изоэлектрофокусировании. В последнее время для контроля популяций насекомых в сельском хозяйстве используют в качестве приманок их феромоны.

На основе ферментов люминесцентной реакции: люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы производятся комплекты реактивов для биолюминесцентного анализа. Комплект реактивов для аналитической биолюминесценции (КРАБ) используется как многокомпонентный реагент, иммобилизованный в крахмальном геле, разработаны методы определения активности NAD-зависимых дегидрогеназ лактатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, протеаз и антипротеаз в плазме и сыворотке крови, биопсийном материале, платиноидов, и т.д. На основе КРАБа и гидрогеназы водородных бактерий разработаны методы определения активности гидрогеназы и концентрации растворенного водорода. Отличительной особенностью ферментативных биотестов по сравнению, с биотестами, выполненными на живых организмах, является возможность варьирования их чувствительностью, изменяя условия проведения анализа, а именно состав реакционной смеси (количество ферментов и субстратов, объем добавляемой токсической смеси) и последовательность добавления компонентов реакции (использование прямой или обратной ADH-реакции и т.д.). В экологических исследованиях биолюминесцентные тесты in vivo и in vitro взаимодополняют друг друга. Совместное использование биотестов позволяет расширить круг анализируемых токсикантов. В люциферазных биотестах действие токсических веществ происходит непосредственно на люциферазу ключевой фермент метаболизма светящихся бактерий. В случае светящихся бактерий прямое влияние токсикантов на люциферазу ограничено клеточной стенкой и мембраной бактерий, препятствующих свободному проникновению любых посторонних веществ в клетки, однако происходит влияние на другие важные процессы жизнедеятельности клетки, так или иначе связанные с биолюминесценцией, например, дыхание. Совместное использование биолюминесцентных биотестов in vivo и in vitro позволяет получать разностороннюю информацию о механизмах воздействия токсических веществ. Использование нескольких биотестов одновременно гарантирует полное обследование водоемов и водозаборов на токсичность независимо от структуры и физико-химических свойств токсикантов, токсичных как для целого организма, так и для клеток и ферментов. При этом в присутствии токсических веществ свечение может как уменьшаться, так и увеличиваться. Показателем наличия в среде токсичности служит изменение интенсивности исследуемого образца в сравнении со свечением в контроле.

Биосенсоры и их устройство

Биосенсоры находят все более широкое применение в целом ряде отраслеи? науки, промышленности, сельского хозяи?ства, медицины и здравоохранения, так как позволяют быстро и качественно анализировать сложные, многокомпонентные смеси веществ.Биосенсоры состоят из двух компонентов: системы биохимического распознавания и преобразователя первичного сигнала (трансдъюсера). Как правило, в качестве биораспознающего реагента используют ферменты и другие специфические биологические объекты антитела или антигены, отдельные клетки, микроорганизмы, срезы тканеи? в иммобилизованном состоянии. Элемент биологического распознавания должен находиться в прямом контакте с преобразователем.

Уникальнои? особенностью биосенсоров, в отличие от химических датчиков, является высокая специфичность биораспознающего элемента, а также его способность осуществлять узнавание без дополнительных затрат энергии. Высокая специфичность позволяет количественно определять индивидуальное вещество либо группу родственных веществ в смеси .Для преобразования первичного сигнала в биосенсорах наиболее часто используются электрохимические методы. Электрохимические биосенсоры представляют собои? хорошую альтернативу традиционным аналити-ческим системам благодаря высокои? селективности и простоте регистрирующих устрои?ств. Электрохимические методы детекции отклика имеют ряд преимуществ перед другими методами, в частности, по сравнению со спектрофотометриеи?, а именно: быстрое получениевыходного сигнала, возможность анализа окрашенных и суспендированных образцов, возможность многократного использования биокатализатора. Все эти качества в сочетании с относительно простым аппаратурным оформлением электрохимических биосенсоров вызывают повышенныи? к ним интерес -развиваются работы по их усовершенствованию и созданию устрои?ств для практического применения.

Теоретические аспекты функционирования электрохимических биосенсоров

Электрохимическая детекция в прямых (безмедиаторных) биосенсорах основана на прямом каталитическом переносе электронов между поверхностью чувствительного элемента сенсора электрода и активным центром биораспознающего реагента. Перенос электронов может происходить непосредственно на поверхности электрода либо на предварительно модифицированнои? его поверхности, обеспечивающеи? прямои? перенос электрона.

К медиаторам, обеспечивающим работу биосенсоров, предъявляются следующие основные требования:

1) медиатор должен быстро реагировать с восстановленнои? формои? биораспознающего фермента;

2) гетерогенные реакции с участием медиатора должны быть обратимы;

3) перенапряжение процесса регенерации окисленного медиатора должно быть низким и не зависеть от рН;

4) медиатор должен быть устои?чивым как в окисленнои?, так и в восстановленнои? форме;

5) восстановленныи? медиатор не должен реагировать с кислородом;

6) медиатор должен быть нетоксичным.

Выбор медиатора с учетом указанных требовании? осуществляется, исходя из окислительно-восстановительных свои?ств активного центра биохимического реагента.

Биосенсоры -- это система на основе амперометрических ферментных электродов, которые генерируют сигнал, пропорциональныи? концентрации субстрата и независимыи? от содержания медиатора или кофермента. Из биосенсоров наибольшее развитие и применение получили системы на основе ферментов в качестве биораспознающего компонента. При адсорбции ферментов на твердых поверхностях (металлы, керамика, полимеры) они частично или полностью сохраняют свою структуру и каталитическую активность, которая в ферментных биосенсорах проявляется в ускорении процесса обмена электронами между субстратом и поверхностью электрода.

Одним из ферментов, которые используются в биосенсорах непосредственно в качестве биокатализатора или в качестве метки, является пероксидаза хрена.

Структура и механизм деи?ствия пероксидазы хрена:

Пероксидаза -- один из наиболее распространенных ферментов, содержащии?ся в растениях, микробах, тканях животных. Этот фермент катализирует окисление широкого спектра органических соединении? перокси водорода с образованием токсичных пероксидов, удаляющихся из живых организмов. Пероксидаза представляет собои? гликопротеид, состоящии? из полипептиднои? цепи, формирующеи? двухдоменную глобулу, и гемовои? простетическои? группы с атомом железа, располагающеи?ся между доменами.

Основнои? отличительнои? особенностью в структуре пероксидазы хрена по сравнению с другими растительными пероксидазами является наличие участка длинои? в 34 аминокислотных остатка между спиралями остатков фенилаланина (F) и глицина G (рис. 1) . Эта область, которая является частью канала для доступа субстрата, не встречается у пероксидаз других классов, более того она имеет отличия даже в пределах своего класса, например, в сравнении с арахисовои? пероксидазои?. Для пероксидазы С хрена, характеризующеи?ся большеи? F-G-вставкой. Изофермент С пероксидазы хрена уникален тем, что имеет кольцо из трех периферии?ных остатков Phe142, Phe68 и Phe179, которое защищает подход к подвергающемуся воздеи?ствию краю гема. Эта ароматическая область важна для реализации способности пероксидазы связывать ароматические субстраты.

Особенностью процессов пероксидазного катализа является образование ряда спектрофотометрически различимых комплексов. В реакции пероксидазного окисления, помимо пероксида водорода, в качестве окислителя (первого субстрата) могут выступать органические субстраты -- алкилгидропероксиды, пероксибензольные кислоты и др. По отношению ко второму субстрату пероксидаза проявляет меньшую специфичность, поэтому целыи? ряд электронодонорных соединении? могут использоваться в качестве субстратов пероксидазы и являться основои? детектирующих систем в методах аналитическои? биохимии и клиническои? медицины.

Важным направлением в развитии ферментативных методов анализа является использование сопряженных реакции?, катализируемых различными ферментами. Сопряженными называются ферментные системы, в которых продукты первои? ферментативнои? реакции служат субстратами для второи? реакции и так далее. Используя сопряженные реакции, можно существенно повысить чувствительность анализа, а также упростить детектирование определяемого вещества. В биосенсорах, основанных на использовании сопряженных систем, на поверхности электродов иммобилизуют совместно два разных фермента; конечные продукты реакции определяют электрохимическими методами.

На основе сопряженных полиферментных систем разработан ряд биосенсорных устрои?ств для определения L-аминокислот, глюкозы, лактата, оксалата и множества других соединении?. Классическим примером таких устрои?ств являются биосенсоры для определения глюкозы. В этих биосенсорах на поверхности электродов совместно иммобилизованы глюкозооксидаза и пероксидаза. Окисление глюкозы сопровождается образованием пероксида водорода, ферментативное восстановление которого с участием пероксидазы детектируется электрохимически. ованных меркаптоэтиламином.

Иммунобиосенсоры с пероксидазои? хрена в качестве метки

Пероксидаза применяется в качестве метки одного из биокомпонентов в биосенсорах, основанных на принципах иммунохимического распознавания. В этих биосенсорах осуществляется реакция антиген-- антитело, что существенно улучшает специфичность распознавания определяемого вещества в образцах сложного состава, а использование фермента значительно повышает чувствительность метода. Благодаря относительно невысокои? стоимости пероксидазы в сравнении с флуоресцентными или радиоактивными метками, биосенсоры с пероксидазои? в качестве метки получили широкое распространение.

Иммуносенсоры имеют преимущество при выполнении анализов, когда требуется высокая чувствительность определения. Это необходимо в медицинскои? практике для диагностики различных биологически активных соединении?, для контроля качества продуктов питания, экологического контроля объектов окружающей среды на наличие остаточных количеств загрязнителеи? и токсикантов. Иммуносенсоры особенно перспективны для проведения медицинских исследовании?, так как они обеспечивают необходимую чувствительность и специфичность при анализе сложных по составу биологических жидкостеи?. Недостаточно широкое внедрение биои иммуносенсоров в медицинскую практику связано с тем, что они не позволяют, как правило, определять несколько соединении? одновременно

Очень интересен и перспективен ДНК-сенсорныи? метод, основанный на способности пероксидазы окислять производные тирамина с образованием промежуточных высокоактивных радикальных частиц, которые затем могут ковалентно связываться с поверхностью белковои? глобулы фермента в непосредственнои? близости от активного центра фермента -- источника их образования. Радикальные частицы, иммобилизованные на поверхности вблизи фермента, могут быть также выявлены конъюгатом стрептавидинпероксидаза. Таким образом, на поверхность вводятся дополнительные молекулы пероксидазы, что обеспечивает расширение диапазона аналитического сигнала.

В настоящее время потребность в биосенсорах огромна, поскольку они не требуют сложного или дорогого оборудования, могут использоваться в полевых условиях и даже быть имплантированы в человеческии? организм для непрерывного мониторинга различных биологически активных соединении?.

Основное ограничение использования биосенсоров в области медицины и охраны окружающеи? среды связано с необходимостью применения одного типа сенсора для определения только одного соединения.Развитие принципов биосенсорного анализа направлено на решение задачи определения нескольких веществ одновременно. В мультибиосенсорных устрои?ствах пероксидаза хрена сохраняет свои преимущества как компонент сопряженных ферментных систем, так и в качестве метки биораспознающего элемента.

Биосенсоры на основе уреазы для обнаружения тяжёлых металлов использовались для количественной оценки общего загрязнения воды ионами тяжёлых металлов.

3. Применение биокатализа в медицине

Биокатализ и ферментые реакции в медицине могут применяться в двух целях:

лечение болезней (“ферментнотерапия”)

Диагностика заболеваний

Применение ферментов для лечения

Использование ферментов в качестве терапевтических средств имеет много ограничений вследствие их высокой иммуногенности. Тем не менее энзимотерапию активно развивают в следующих направлениях:

заместительная терапия - использование ферментов в случае их недостаточности;

элементы комплексной терапии - применение ферментов в сочетании с другой терапией.

Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при ахилии, гипои анацидных гастритах. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приёмом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезим-форте и др.).

В качестве дополнительных терапевтических средств ферменты используют при ряде заболеваний. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин) применяют при местном воздействии для обработки гнойных ран с целью расщепления белков погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Ферментные препараты стали широко применять при тромбозах и тромбоэмболиях. С этой целью используют препараты фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы.

Фермент гиалуронидазу (лидазу), катализирующий расщепление гиалуроновой кислоты, используют подкожно и внутримышечно для рассасывания рубцов после ожогов и операций (гиалуроновая кислота образует сшивки в соединительной ткани).

Ферментные препараты используют при онкологических заболеваниях. Аспарагиназа, катализирующая реакцию катаболизма аспарагина, нашла применение для лечения лейкозов.

Предпосылкой антилейкемического действия аспарагиназы послужило обнаружение в лейкозных клетках дефектного фермента аспарагинсинтетазы, катализирующего реакцию синтеза аспарагина.

Лейкозные клетки не могут синтезировать аспарагин и получают его из плазмы крови. Если имеющийся в плазме аспарагин разрушать введением аспарагиназы, то в лейкозных клетках наступит дефицит аспарагина и в результате - нарушение метаболизма клетки и остановка прогрессирования заболевания.

Применение иммобилизованных ферментов вместо растворимых оказалось в ряде случаев предпочтительным при использовании в качестве медицинских препаратов. Такие препараты в силу большей устойчивости дольше удерживаются в организме (обладают пролонгированным действием). Кроме того, можно создавать разнообразные, удобные для применения формы таких ферментов. Например, иммобилизация протеаз на целлюлозепозволяет получать обладающее протеолитической активность повязки и тампоны, что удобно при использовании таких ферментов для заживлении ран, язв и прочих поражений тканей .

Препараты иммобилизованных ферментов могут найти применение в медицине

· в терапевтических целях, так как целый рад заболеваний человека обусловлен специфической ферментной недостаточностью.

· для проведения различных клинических анализов, позволяющих быстро и количественно установить содержание интересующих клиницистов соединений в соответствующем объекте анализа.

Применение нативных ферментов в терапевтических целях осложняется их антигенными свойствами, а также малым временем жизни фермента в организме. Их применение также неоправданно из-за их малой стабильности и дороговизны.

В области терапии можно выделить следующие основные направления применения иммобилизованных ферментов:

1. Введение в организм иммобилизованных ферментов для покрытая специфической ферментной недостаточности.

2. Введение в организм или использование в соответствующих аппаратах типа "искусственной почки" или "искусственной печени "иммобилизованных ферментов для удаления избыточных количеств вредных метаболитов, в первую очередь из крови.

3. Покрытия дефицита пищеварительных ферментов, возникшего в результате хирургического удаления части желудка Оли пищевода.

4. Использование иммобилизованных ферментов для борьбы с накоплением эндотоксинов в процессе заживления ран и ожогов.

5. Применение некоторых иммобилизованных ферментов для лечения определенных злокачественных новообразований.

Имеющиеся на сегодняшний день данные по применению нативных ферментов свидетельствуют о том, что из-за быстрого разложения вводимого в организм фермента и из-за вызываемой им, как чужеродным белком, сильной иммунологической реакции заметного успеха добиться не удается, хотя известны примеры лечения некоторых злокачественных новообразований, в частности лимфосаркомы, нативной аспарагиназой.

Еще одним классом ферментов применяемых как лекарственное средство являются бензимидазолы, такие как албендазол и фенбендазол. Они являются антигельминтными препаратами, механизм деи?ствия которых состоит в ингибировании перестроек тубулина. В организме человека они претерпевают окисление и расщепление с помощью FAD-содержащих моноокисгеназ, окисляющих серу до сульфона.

Энзимодиагностика

Энанзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;

количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;

активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени и отличается от нормальных значений;

ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);

существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

Для диагностики также применяют иммобилизованные ферменты. В клинических анализах применяют метод определения содержания глюкозы в крови с помощью глюкозооксидады, включенной в акриламидный гель. Другой пример такого рода это определение содержания мочевины в различных биологических жидкостях, например в моче или плазме крови, с помощью иммобилизованной уреазы. При этом содержание мочевины может быть определено как по количеству выделенного аммиака, так и по изменению значения рН исследуемого раствора. Подобные системы могут функционировать как непрерывно действующие.

При некоторых заболеваниях, в частности при опухолях пищеварительной системы, наблюдается заметное изменение концентрации в моче хотя бы одного из дисахаридов лактозы или сахарозы. С целью определения концентрации лактозы в моче предложено использовать иммобилизованную лактозу и сахаразу. В последнее время для определения концентраций некоторых соединений разработаны так называемые ферментные электроды, получаемые из обычных селективных электродов покрытием их гелевой пленкой со связанным в ней ферментом.



Заключение

Ферментативный катализ в настоящее время бурно развивается и широко применяется в различных областях промышленности, науки и медицины. Роль его с каждым днём возрастает, появляются все новые и новые способы исследования связанные с ферментами и биокатализом. Возросла роль биокатализаторов в медицине. Многие заболевания начали лечить с применением достижений инженерной энзимологии. Все чаще ферментативный катализ стали применять при синтезе лекарственных веществ. Начиная от применения пепсина для пищеварения и заканчивая диагностированием микробной токсикации биосенсорами ферментативный катализ охватывает все новые области в фармации и медицины.



Литература

1.https://estestvoznanie.academic.ru/181/Биокатализ дата обращения 10.10.2017

2. Биокатализ:концепция и практическое использование/ Г.Н.Румянцева/ ДеЛи принт 2010 / 120с.

3.Коваленко Г.А. “Проникновение бтокатализа в химическую индустрию” //Химия и жизнь в ХХI веке// №10 /1999

4. Биокаталитические процессы в органическом синтезе. /Яненко А.С. /2014

5.Биотехнология/ Н.С. Егоров, В.Д. Самуилов /143с. 1991 /Высшая школа

6. Прикладная биолюминесценция bl.ibp.ru

7.Г.В. Преснов, М.Ю. Рубцова, А.М. Егоров “Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена” /Российский химический журнал/2008/ m.LII №2.

8.А.А.Захарянц, А.А.Полозников, Т.А.Осипова “Бензимидазолы конкуретные ингибиторы FADсодержащей монооксигеназы” Вестник Московского университета Серия 2 Химия Т.56 №6

9. “Биохимия” под редакцией Северина 2003,ГЭОТАР-Медиа/ 779с.

10. Курс лекций по биохимии/ проф. В.В. Лелевич, доц. Е.В. Леднева/ Гродно/2009 110с.

Размещено на Allbest.ru

...