Информационная технология прогноза фармакологической активности химических соединений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Информационная технология прогноза фармакологической активности химических соединений

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

ВАСИЛЬЕВ Павел Михайлович

Волгоград - 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» и ГУ «Волгоградский научный центр Российской академии медицинских наук и Администрации Волгоградской области»

Научный консультант: член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Спасов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, кандидат физико-математических наук, профессор Поройков Владимир Васильевич заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Резников Константин Михайлович доктор химических наук, профессор Озеров Александр Александрович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН»

Защита состоится «____»________________2009 г. в _____ ч. на заседании Диссертационного Совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Автореферат разослан «____»_________________ 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор медицинских наук,

профессор А. Р. Бабаева



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фундаментальная проблема соотношения биологической активности и структуры химических соединений и поиск на этой основе новых высокоактивных лекарственных веществ имеет принципиальное значение для современной фармакологии. На 01 марта 2008 г. получено свыше 34 млн. химических соединений [CAS^®, 2008], выявлено более 5,6 тыс. видов рецепторов и ионных каналов [IUPHAR, 2008; EMBL-EBI, 2008] и почти 4,7 тыс. видов ферментов [IUBMB, 2008], а число видов биологической активности превысило 7,5 тыс. [Poroikov V. V. et al., 2005; Лагунин А. А., 2001]. Для поиска фармакологически активных веществ используются разные подходы, например, нейрохимические [Закусов В. В., 1973; Вальдман А. В. и др., 1987; Петров В. И. и др., 1997, 2001, 2003; Воронина Т. А., Середенин С. Б., 1998, 2002], биофизические [Пирузян Л. А., Ландау М. А., 1998], методы протеомики [Archakov A. I. et al., 2003], классический QSAR [Кабанкин А. С., 2004], математическое моделирование физиологических процессов [Ataullakhanov F. I. et al., 2005]. Выявление одного перспективного лекарственного вещества требует изучения не менее 10 тыс. соединений [Kubinyi H., 2001], разработка нового лекарства длится 12 - 15 лет, а затраты на это составляют от 500 млн. до 1,9 млрд. долл. [Chemoinformatics, 2003; Кубиньи Г., 2006]. Поэтому в настоящее время начальным этапом поиска фармакологически активных веществ, как правило, является использование доэкспериментальных методов in silico, предваряющих экспериментальные исследования in vitro и in vivo. Для этих целей разработаны специализированные информационные технологии и на их основе созданы интегрированные системы и программные среды [SYBYL^®, 2008; Discovery Studio^®, 2008; Flex* Software Library, 2008; Poroikov V. et al., 2005; Palyulin V. A. et al., 2000]. Российской академией наук на период с 2007 по 2011 гг. утверждены как приоритетные следующие направления фундаментальных исследований: математические модели в биологии, биоинформатика; химические проблемы создания фармакологически активных веществ нового поколения; в информационных технологиях - системный анализ, системы распознавания образов, принятие решений при многих критериях [Распоряжение Президиума РАН …, 2007]. Российская академия медицинских наук определила в качестве одного из перспективных направлений развития медицинской науки на период до 2025 г. разработку на основе технологий биоинформатики и компьютерного конструирования лекарств методов оценки безопасности и эффективности лекарственных препаратов [Прогноз развития медицинской науки …, 2008].

Таким образом, разработка и внедрение информационных технологий прогноза фармакологической активности химических соединений и компьютерного поиска новых лекарственных веществ является перспективным приоритетным направлением современной науки и имеет высокую степень актуальности.

Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ государственной регистрации 01200116045). Тема утверждена на заседании Ученого Совета ВолГМУ (протокол № 7 от 09 марта 2005 г.) и включена в план НИР.

Цель исследования. Создание информационной технологии компьютерного прогноза фармакологической активности химических соединений на основе комплексного подхода к прогнозу; использование этой технологии для направленного поиска веществ с высокой фармакологической активностью, прогноза их взаимодействия с сайтами связывания биомишеней и оценки их токсических эффектов.

Основные задачи исследования.

1. Разработать теоретические основы новой информационной технологии - комплексную методологию компьютерного прогноза фармакологической активности химических соединений.

2. В рамках комплексного подхода создать специализированный язык описания структуры химических соединений; разработать на основе теории распознавания образов и теории принятия решений математические методы, стратегии и алгоритмы прогноза; создать комплекс компьютерных программ для прогноза биологической активности химических соединений.

3. Сформировать банки и базы данных: а) по структуре и различным видам активности известных лекарственных и биологически активных веществ; б) по структуре, фармакологической активности и острой токсичности новых производных конденсированных азотсодержащих гетероциклов, адамантана, ГАМК и пирролидона; в) по структуре и канцерогенной опасности известных химических соединений.

4. Исследовать применение новой информационной технологии для прогноза наличия/отсутствия и уровня рецепторного, пострецепторного, мембранного и иных видов фармакологической активности структурно-разнородных и структурно-сходных соединений разных химических классов, взаимодействующих с различными типами биомишеней, а также солей, молекулярных комплексов и смесей индивидуальных веществ - с экспериментальной проверкой результатов прогноза.

5. Исследовать применение новой информационной технологии для анализа механизмов взаимодействия лигандов с сайтами связывания биомишеней и построения моделей этих сайтов.

6. Исследовать применение новой информационной технологии для прогноза наличия/отсутствия и уровня токсических эффектов соединений разной химической природы, с экспериментальной проверкой результатов прогноза.

7. Провести с использованием новой информационной технологии направленный поиск новых высокоактивных веществ по актуальным видам фармакологической активности среди неиспытанных соединений.

Научная новизна.

Cформировано научное направление в решении фундаментальной проблемы соотношения химической структуры и биологической активности на основе комплексного подхода к прогнозу фармакологической активности химических соединений. Впервые создана принципиально отличающаяся от существующих QSAR-подходов новая комплексная методология прогноза, основанная на совместном использовании различных по физико-химическому смыслу способах описания химической структуры, различных по сложности уровней этого описания и расширяющейся по параметрам избыточности такого описания; разных по математическому содержанию методов классификации; концептуальных по результату схем принятия решений. Разработаны основные теоретические концепции новой методологии. лиганд токсический химический

Созданное научное направление расширяет представления о взаимодействии биологически активных веществ с живыми системами и открывает дополнительные возможности построения новых концепций, моделей и подходов, которые могут быть использованы для решения задач, связанных с проблемой «структура - активность». Комплексный подход к прогнозу и составляющие его теоретические концепции являются методологической основой для создания новых методов, компьютерных систем и информационных технологий прогноза биологической активности химических соединений.

Впервые создана новая информационная технология компьютерного прогноза фармакологической активности химических соединений (ИТ «Микрокосм»), основанная на комплексном подходе к прогнозу. Создан новый специализированный мультидескрипторный иерархический многоуровневый язык описания химической структуры QL. На основе теории распознавания образов разработаны четыре метода прогноза в коррелированных пространствах сверхбольшой размерности. На основе теории принятия решений созданы три стратегии прогноза - способы формирования интегральных решающих правил по спектру промежуточных прогнозных оценок. Разработаны соответствующие алгоритмы, создан специализированный программный комплекс.

С применением новой информационной технологии выполнен эффективный прогноз наличия и уровня различных видов фармакологической активности структурно-разнородных и структурно-сходных соединений разных химических классов.

Доказана возможность эффективного использования ИТ «Микрокосм» для прогноза наличия и уровня различных видов фармакологической активности простых и сложных солей и молекулярных комплексов структурно-разнородных и структурно-сходных химических соединений.

Впервые с помощью новой информационной технологии выполнен прогноз фармакологической активности смесей индивидуальных веществ, с учетом синергизма компонентов.

На основе 2D-фармакофоров-образов в ИТ «Микрокосм» выполнен анализ механизмов взаимодействия лигандов с сайтами связывания H₁-, H₂- и H₃-гистаминовых рецепторов и построены их содержательные модели.

Доказана эффективность использования разработанной информационной технологии для прогноза острой токсичности и канцерогенной опасности соединений различных химических классов.

Научно-практическая значимость.

Созданная информационная технология используется: а) для направленного поиска новых высокоактивных веществ среди рассмотренных классов соединений по изученным видам фармакологической активности; б) для планирования синтеза новых высокоактивных веществ путем прогноза уровня заданного вида фармакологической активности предполагаемых к синтезу соединений; в) для оптимизации поиска высокоактивных соединений других химических классов и прогноза иных видов фармакологической активности, помимо рассмотренных в настоящем исследовании; г) для исключения соединений, обладающих нежелательными токсическими эффектами.

Технология позволяет оптимизировать вид солеобразующих остатков в органических солях, число и химическую структуру образующих молекулярные комплексы соединений, количественный состав смесей и химическую структуру входящих в них индивидуальных веществ - с целью достижения максимального уровня изучаемой фармакологической активности; она может быть применена для создания с использованием явления синергизма высокоэффективных и низкотоксичных многокомпонентных лекарственных средств.

ИТ «Микрокосм» позволяет проводить на основе языка QL анализ фармакофоров испытанных соединений и использовать выявленные признаки высокой активности для модификации структуры веществ-лидеров с целью повышения их активности, а также для выработки мотивированных заключений о возможных механизмах действия изучаемых соединений и построения моделей сайтов связывания взаимодействующих с этими соединениями биомишеней.

Созданы банки и базы данных: а) по структуре и 33 видам активности 10,3 тыс. известных лекарственных и биологически активных веществ; б) впервые по структуре и уровню 33 видов фармакологической активности и острой токсичности новых химических соединений - 1312 производных конденсированных азотсодержащих гетероциклов, 123 производных адамантана, 52 производных ГАМК и пирролидона; в) по структуре и канцерогенной опасности 492 известных соединений.

Впервые с помощью новой информационной технологии проведен эффективный направленный поиск новых высокоактивных соединений: среди производных азотсодержащих гетероциклов найдено 48 веществ с высокой антиагрегантной активностью, 35 веществ с высокой антиаритмической активностью, 24 вещества с высокой антиоксидантной активностью, 23 вещества с высокой гемореологической активностью, 18 веществ с высокой P2Y₁-антипуринергической активностью, 22 вещества с высокой к-опиоидной агонистической активностью, 2 вещества с высокой 5-HT₃-антисеротониновой активностью; среди производных адамантана найдено 3 вещества с потенциально высокой антиортовирусной активностью, 3 вещества с ноотропной активностью и 1 вещество с высокой антиоксидантной активностью; среди производных ГАМК и пирролидона найдено 3 вещества с высокой противоишемической активностью. Применение новой информационной технологии в направленном поиске новых высокоактивных веществ позволяет существенно, в несколько раз, сократить временные, финансовые и материальные затраты на поиск таких соединений. Тридцать наиболее активных из найденных в результате компьютерного прогноза веществ рекомендованы для углубленного изучения.

Реализация результатов исследования. Разработанная информационная технология и полученные с ее помощью методические рекомендации используются: в направленном поиске и при планировании синтеза новых химических соединений с высокой фармакологической активностью на кафедре фармакологии ВолГМУ, в НИИ фармакологии ВолГМУ, в Волгоградском НЦ РАМН и АВО, Волгоградском государственном техническом университете, Волжском политехническом институте ВолгГТУ, Кубанском государственном медицинском университете, НИИ физической и органической химии Южного федерального университета; в научно-производственной деятельности ОАО «Волжский оргсинтез». Наиболее существенные результаты работы легли в основу элективного курса «Молекулярные аспекты создания лекарственных препаратов» кафедры фармакологии ВолГМУ, включены в лекционные курсы на кафедрах фармацевтической и токсикологической химии, фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ, в учебно-методические материалы на кафедрах технологии органического и нефтехимического синтеза ВолгГТУ, химии и общей химической технологии ВПИ ВолгГТУ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Комплексный подход к прогнозу и составляющие его теоретические концепции являются методологической основой для разработки компьютерных систем прогноза биологической активности химических соединений. В рамках комплексной методологии создана ИТ «Микрокосм» - высокоэффективная информационная технология прогноза фармакологической активности химических соединений.

2. Новая информационная технология позволяет с высокой точностью проводить прогноз наличия и уровня 33 видов фармакологической активности структурно-разнородных соединений и 30 видов фармакологической активности структурно-сходных соединений и осуществлять на этой основе эффективный направленный поиск высокоактивных веществ с заданным фармакологическим действием - в том числе, для солей и молекулярных комплексов этих соединений.

3. Разработанная информационная технология успешно использована для прогноза наличия и уровня фармакологической активности смесей индивидуальных веществ, с учетом синергизма компонентов.

4. На основе созданной информационной технологии проведен анализ механизмов взаимодействия лигандов с сайтами связывания H₁-, H₂- и H₃-гистаминовых рецепторов и построены содержательные модели этих сайтов.

5. С помощью новой информационной технологии с высокой достоверностью выполнена оценка канцерогенной опасности производных сульфенамидов и уровень острой токсичности производных конденсированных азотсодержащих гетероциклов.

6. С применением новой информационной технологии среди производных конденсированных азотсодержащих гетероциклов, адамантана, ГАМК и пирролидона в эксперименте найдены 182 вещества с высоким уровнем следующих видов активности: к-опиоидной агонистической, P2Y₁-антипуринергической, 5-HT₃-антисеротониновой, антиагрегантной, гемореологической, антиаритмической, антиоксидантной, антиортовирусной, ноотропной, противоишемической; из них 30 соединений рекомендованы для углубленных экспериментальных фармакологических исследований.

Апробация работы. В 2000 - 2009 гг. материалы диссертации докладывались и обсуждались на V традиционной научно-технической конференции стран СНГ «Процессы и оборудование экологических производств», Волгоград, 2000; 13-й Международной научной конференции «Математические методы в технике и технологиях», Ростов-Великий, 2000; 1-й Российской электронной конференции по биоинформатике, Москва, 2000; Международном экологическом конгрессе «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности», Санкт-Петербург, 2000; Международной научно-технической конференции «Современные информационные технологии», Пенза, 2000; Международной научно-практической конференции «Компьютерные технологии в науке, производстве, социальных и экономических процессах», Новочеркасск, 2000; Международной научно-практической конференции «Современная техника и технологии в медицине и биологии», Новочеркасск, 2001; Международной научно-практической конференции «Развивающиеся интеллектуальные системы автоматизированного проектирования и управление», Новочеркасск, 2001; Международной научной конференции «Химия и технология каркасных соединений», Волгоград, 2001; Первой Национальной конференции «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины», Москва, 2002; Международных научно-технических конференциях «Информационные технологии в образовании, технике и медицине», Волгоград, 2000, 2004; I и II Российских школах-конференциях «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине», Саратов, 2002, 2004; Третьей Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения, Москва, 2004; 16-th International Congress of Chemical and Process Engineering, Praha, 2004; 1-м Международном форуме «Актуальные проблемы современной науки», Самара, 2005; X и XI Международных научно-технических конференциях «Наукоемкие химические технологии», Волгоград, 2004, Самара, 2006; II и III Всероссийских конференциях с международным участием «Новые информационные технологии в медицине», Волгоград, 2006, 2008; 2-й, 3-й, 4-й, 5-й и 6-й Всероссийских конференциях «Молекулярное моделирование», Москва, 2001, 2003, 2005, 2007, 2009; Fourth International Symposium on Computational Methods in Toxocology and Pharmacology Integrating Internet Recources, Moscow, 2007; III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007; IX, XI, XIV, XV и XVI Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2002, 2004, 2007, 2008, 2009.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 152 печатные работы, в том числе 1 монография, 9 авторских свидетельств, 1 депонированная рукопись и 67 статей, из которых 15 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 428 страницах, иллюстрирована 84 таблицами и 56 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2 - 6), обсуждения результатов (глава 7), выводов, приложения и приложения на CD-ROM. Список литературы включает 218 отечественных и 404 зарубежных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Банки данных по структуре и активности химических соединений

По доступным первоисточникам сформированы 4 банка данных по структуре и биологической активности известных веществ: 1) 11629 лекарственных соединений, 1110 видов активности; 2) 275 соединений, испытанных на ноотропную активность; 3) 1992 соединения, испытанные на 7 видов антивирусной активности; 4) 1033 канцерогенных соединения. Исходные данные верифицировались по разработанной методике, включающей перекрестную проверку по разным первоисточникам структурных формул соединений и значений их активности. Химическая и фармакологическая информация вводилась в память компьютера с помощью редакторов GRR ИТ «Микрокосм» [Кочетков А. Н. и др., 1991], MDL® ISIS/Draw [Symyx^® MDL, 2008] и ACD/ChemSketch Freeware [ACD/Labs, 2008]. Всего в созданных банках данных содержатся сведения о 14929 веществах по 1119 видам активности.

На основе банков данных сформированы рабочие базы данных (обучающие выборки) по 34 видам активности: нейролептическая, транквилизирующая, антидепрессантная, ноотропная, анальгетическая наркотическая, местноанестезирующая, спазмолитическая, антиангинальная, кардиотоническая, гипогликемическая, анаболическая, антисептическая, лепростатическая, туберкулостатическая, фунгицидная, анти-ВИЧ, антигерпесвирусная, антипарамиксовирусная, антипикорнавирусная, антиреовирусная, антиортовирусная, противолейкозная, противоопухолевая, антиоксидантная, к-опиоидная агонистическая, 5-HT₂-антисеротониновая, 5-HT₃-антисеротониновая, H₁-антигистаминная, H₂-антигистаминная, H₃-антигистаминная, H₃-агонистическая, P2Y₁-антипуринергическая, канцерогенная. Экспертная оценка уровня активности проводилась по следующим градациям: 1) «высокоактивно» - вещество проявляет длительный выраженный эффект в малых дозах/концентрациях (в сравнении с другими подобными соединениями), либо превосходит по активности общепринятый препарат сравнения; 2) «умеренноактивно» - вещество проявляет длительный выраженный эффект в больших дозах/концентрациях или кратковременный выраженный эффект в малых дозах/концентрациях, либо менее активно, чем препарат сравнения, но сопоставимо по активности с другими препаратами этой группы; 3) «активно» - оценка уровня активности вещества затруднительна из-за недостатка информации; 4) «неактивно» - вещество достоверно не имеет данной активности. Всего в 34 базах данных содержится 10703 структур соединений.

В ВолГМУ исследованы 1487 новых химических соединений (производных конденсированных азотсодержащих гетероциклов, адамантана, ГАМК и пирролидона), которые были выборочно изучены на 36 видов фармакологической активности: антирадикальную, антиоксидантную, антирадиомиметическую, влияние на фосфодиэстеразу цАМФ, антикальмодулиновую, 5-HT₂-антисеротониновую, 5-HT₃-антисеротониновую, H₁-антигистаминовую, H₂-антигистаминовую, H₃-гистаминовую агонистическую, P2Y₁-антипуринергическую, к-опиоидную агонистическую, блокирование кальциевых каналов, антиагрегантную, гемореологическую, спазмолитическую, антиаритмическую, миокардиальную антигипоксическую, противоишемическую, местноанестезирующую (поверхностную, инфильтрационную и проводниковую), гипотензивную, гипогликемическую, антисекреторную, противоязвенную, антидепрессантную, ноотропную, церебропротекторную, общую антигипоксантную, влияние на общую физическую работоспособность, острую токсичность (при двух способах введения), мутагенную. Эксперименты выполнены научными коллективами кафедры фармакологии ВолГМУ, НИИ фармакологии ВолГМУ, ВНЦ РАМН и АВО, кафедры фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ, НИИ по биологическим испытаниям химических соединений (Купавна, Московской обл.), НИИ кардиологии Томского НЦ СО РАМН, кафедры фармакологии Кубанского государственного медицинского университета (Краснодар).

На основе этого массива информации сформированы 4 банка данных, содержащие структурные формулы новых соединений и экспериментальные данные по их фармакологической активности: 1) 1312 производных 17-ти типов конденсированных азотсодержащих гетероциклов, 32 вида активности; 2) 112 адамантил-производных имидовых кислот; 3) 11 адамантил-производных биологически активных веществ; 4) 52 производных ГАМК и пирролидона, 1 вид активности. Дополнительно в банки были включены полуколичественные оценки экспериментальных показателей активности веществ. Границы классов активности определялись: 1) в результате кластерного анализа непрерывных показателей двумя методами - гистограмм и расстояний [Мандель И. Д., 1988]; 2) на основе активности препаратов сравнения; 3) формальным способом. Всего в созданных банках данных содержатся сведения о 1487 соединениях по 33 видам активности.

На основе этих банков данных по каждому виду активности и каждому градированному ее показателю для испытанных соединений сформированы 43 рабочие базы данных (обучающие выборки) общим объемом 5881 структура.

По всем 77 базам данных созданы рабочие наборы файлов для последующей обработки в ИТ «Микрокосм». Структурные формулы всех соединений и оценки их активности приведены в CD-приложении к диссертации.

Новые химические соединения

По прогнозу были испытаны следующие существующие и вновь синтезированные вещества: 213 производных конденсированных азотсодержащих гетероциклов (синтезированы в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, Ростов-на-Дону) - имидазола (5 веществ), индола (20 веществ), бензимидазола (14 веществ), N⁹-имидазо[1,2-a]бензимидазола (130 веществ), N¹-имидазо-[1,2-a]бензимидазола (27 веществ), N⁹-2,3-дигидро-имидазо[1,2_a]бензимидазола (5 веществ), 2,3,4,10-тетрагидро-пиримидо-[1,2_a]бензимидазола (3 вещества), пиразоло[1,5-a]бензимидазола (2 вещества), пирроло[1,2-a]бензимидазола (3 вещества), 1,2,4-триазоло[1,5-a]бензимидазола (1 вещество), перимидина (1 вещество), имидазо[2,1-a]изохинолина (1 вещество), 1,2,4-триазино[3,2-a]бензимидазола (1 вещество); четыре 1-адамантил-производных имидовых кислот (синтезированы в Волгоградском государственном техническом университете); одно 1-адамантил-производное биологически активных соединений (синтезировано в Волжском политехническом институте ВолгГТУ); три производных 4-фенил-пирролидона-2 (синтезированы в Российском государственном педагогическом университете им. А. И. Герцена, Санкт-Петербург). Изучаемые вещества представляют собой соли с неорганическими и органическими кислотами и основаниями, либо соединения без солеобразующих компонентов. Они являются порошками белого или желтого цвета, большинство растворимы в воде, на воздухе в твердом виде и в растворе устойчивы. Подтвержденная чистота образцов составляла не менее 98 %. Строение установлено современными методами хромато-масс-, ИК- и ЯМР-спектроскопии.

Методы экспериментального изучения фармакологической активности

Эксперименты выполнены на 750 половозрелых неинбредных белых мышах обоего пола массой 18 - 22 г, 482 половозрелых неинбредных белых крысах обоего пола массой 180 - 300 г, 21 половозрелой неинбредной морской свинке обоего пола массой 350 - 550 г, образцах крови 45 кроликов породы «Шиншилла» массой 4,0 - 4,5 кг, 15 беспородных кошках обоего пола массой 4,0 - 4,5 кг, 516 высевах индикаторных штаммов TA100, TA98 и TA97 Salmonella typhimurium. Животные содержались в условиях вивария ВолГМУ с естественным световым режимом на стандартной диете [ГОСТ Р 50258_92], с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [2007] и правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ [ГОСТ Р 51000.3_96, ГОСТ Р 51000.4_96]. Забой животных проводился согласно требований «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» [2007].

Следующие эксперименты были проведены in vitro. Антиоксидантные свойства веществ исследовали на модели аскорбат-индуцируемого ПОЛ гомогенатов печени крыс [Ланкин В. З. и др., 1975]. Исследование 5-НТ₃-антисеротониновой активности проводили на изолированных предсердиях морских свинок [Nishio H. et al., 1996]. Действие на P2Y₁-рецепторы оценивали на модели АДФ-индуцированной активации тромбоцитов кролика методом малоуглового светорассеяния [Деркачев Э. Ф. и др., 1998]. Влияние на к-опиоидные рецепторы определяли на модели активации тромбоцитов кролика методом малоуглового светорассеяния [Деркачев Э. Ф. и др., 1998]. Антиагрегантную активность определяли на тромбоцитах кролика методом [Born G., 1962] в модификации [Габбасов З. А. и др., 1989]. Гемореологическую активность изучали на модели гипертермического воспроизведения нарушений реологических свойств крови [Плотников М. Б. и др., 1996]. Спазмолитическую активность определяли по методу [Хаджай Я. И. и др., 1966] в модификации [Бобков Ю. Г. и др., 1967] на изолированной тонкой кишке крыс. Антиаритмическую активность оценивали на изолированном предсердии крыс по методу [Зайдлер Я. И., 1967]. Мутагенную активность проверяли в тесте Эймса [Maron D. M. et al., 1983; Оценка мутагенности …, 1994] на индикаторных штаммах Salmonella typhimurium.

Следующие исследования были проведены in vivo. Противоишемическую активность веществ изучали на кошках по методу [Голдштейне Г. Х. и др., 1984] в модели ишемии миокарда. Антидепрессантную активность исследовали на крысах-самках с использованием комплекса поведенческих тестов [Ковалев Г. В., 1990; Буреш Я. и др., 1991]. Ноотропную активность оценивали на крысах-самках в модели обучения животных по методу выработки условной реакции пассивного избегания [Ковалев Г. В., 1990]. Острую токсичность определяли на мышах по общепринятой методике [Беленький М. Л., 1963].

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили в пакете прикладных программ «Statistica 6.0» (StatSoft, США) с использованием стандартных параметрических и непараметрических методов.

Компьютерные программы прогноза фармакологической активности химических соединений

Использовались следующие оригинальные программы ИТ «Микрокосм». ActUtil - присваивает метки уровня активности соединениям обучающей или тестовой выборки и формирует рабочие файлы для прогноза заданного вида активности. MixUtil - формирует смеси разного качественного и количественного состава по структурам индивидуальных химических соединений. TranQL2 - транслирует структуры соединений обучающей или тестовой выборки в базовые дескрипторы языка QL. MakeData - разворачивает базовое QL-описание структуры соединений в полную матрицу данных, содержащую упакованное описание структуры всех соединений по всем 11 типам QL-дескрипторов. Testing - рассчитывает по обучающей выборке параметры решающих правил для различных стратегий прогноза; производит четырьмя способами автотестирования оценку распознающей и прогностической способностей трех стратегий и четырех методов прогноза; выполняет прогноз активности неиспытанных соединений с использованием любой стратегии или метода. TestPrognResult - проверяет спектр прогнозных оценок активности на непротиворечивость. FarmFor - проводит оценку по гипергеометрическому критерию статистической достоверности QL-признаков наличия/отсутствия заданного уровня активности (рассчитывает фармакофоры).

Всего программный комплекс ИТ «Микрокосм» (версия 4.3, сентябрь 2007 г.) состоит из 16 программ общим объемом более 43 тыс. строк.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Новая информационная технология была всесторонне апробирована на различных молекулярных системах. Это структурно-разнородные синтетические и природные соединения самых разнообразных химических классов; структурно-сходные синтетические производные 22 химических рядов; соли органических соединений с неорганическими и органическими кислотами и основаниями; смеси соединений; молекулярные комплексы; сайты связывания биомишеней. Впервые был выполнен прогноз активности солей с учетом влияния солеобразующего остатка и активности смесей с учетом синергизма компонентов.

Теоретические основы и методы компьютерного прогноза фармакологической активности химических соединений

Информационная технология прогноза свойств органических соединений «Микрокосм» есть совокупность теоретических концепций, математических методов и правил и основанных на них компьютерных алгоритмов и программ, позволяющих расчетным способом оценивать свойство химического соединения по его структурной формуле. Основой методики прогноза являются полученные методами ТРО закономерности, связывающие между собой факт наличия/отсутствия активности (в том числе, для полуколичественных градаций) и структуру соединений, представленную в виде матрицы структурных дескрипторов [Васильев П. М., Спасов А. А. и др., 2004, 2005]. При прогнозе модель образа соединения сравнивается с моделями обобщенных образов классов активных/неактивных соединений и по результатам такого сравнения рассчитывается спектр прогнозных оценок активности.

Парадигма ИТ «Микрокосм». Биологическая активность химического соединения обусловлена комплексным воздействием этого соединения, как единого целого, на все компоненты биологической системы через множество характеристик его структуры. В парадигму входят восемь теоретических концепций.

1. Химическая динамическая система высокой сложности - совокупность очень большого числа химических соединений, находящихся в пространстве ограниченного объема, которые взаимодействуют между собой и внешней средой и отделены от нее и друг от друга полупроницаемыми поверхностями. Активность (свойство) химического соединения - способность вызывать изменение внешних параметров сложной химической системы при взаимодействии с ней соединения.

2. Обобщенный образ класса соединений с заданным свойством - совокупность всех соединений, проявляющих данное свойство, описанных совокупностью всех параметров, характеризующих эти соединения. Обобщенный образ является абстрактным объектом, число соединений и параметров в нем стремится к бесконечности. Можно построить модель этого образа, рассматривая как можно большее число активных соединений и их параметров. Для этого в ИТ «Микрокосм» используется специальный язык описания структуры химических соединений QL.

3. Мультидескрипторное иерархическое многоуровневое описание заключается в использовании для представления структуры соединений разных по физико-химическому смыслу способов описания - групп параметров, с одновременным разделением этих групп на несколько возрастающих по сложности уровней описания; каждый последующий уровень описания порождается из предыдущего. Расширяющаяся по параметрам избыточность описания (добавление новых групп параметров) обеспечивает увеличение мощности формируемой модели обобщенного образа. В ИТ «Микрокосм» язык QL обеспечивает 11 уровней описания химической структуры дескрипторами разной сложности и физико-химического смысла.

4. Концепция контекстно-зависимых локальных метрик предполагает, что каждый объект существует в собственном пространстве признаков, свойства которого определяются самим этим объектом [Дюк В., 1997]. Индивидуально сконструированные локальные метрики обеспечивают каждому объекту максимально возможную «область применимости», чего нельзя достигнуть при использовании общего пространства признаков и одинаковой метрики для всех объектов.

5. Мегамерное пространство - нелинейное пространство с переменной кривизной сверхбольшой размерности. Такое пространство является дискретно-непрерывным, сильно коррелированным, не ортогональным и не нормируемым.

6. Взаимодополнение решающих правил предполагает совместное использование для прогноза нескольких существенно различных математических методов, в результате чего происходит взаимная компенсация ошибок. В ИТ «Микрокосм» применяются четыре метода классификации: Байеса, расстояния, ближайшего соседа и локального распределения. Для каждого соединения каждый из методов дает 11 прогнозных оценок активности (по числу уровней QL-описания).

7. Стратегия прогноза - интегральное правило принятия решения об итоговой активности соединения по совокупности промежуточных прогнозных оценок его активности. В ИТ «Микрокосм» определены три стратегии: а) консервативная - учитывает наиболее устойчивые, характерные именно для данного вида свойств, закономерности и применяется для поиска новых высокоактивных, но типичных соединений; б) нормальная - учитывает как стандартные, так и специфические зависимости и используется для прогноза активности нетипичных структур; в) рисковая - учитывает наиболее тонкие, нестандартные закономерности, в частности, связанные с механизмом действия, максимально отражает особенности строения и степень новизны прогнозируемых соединений.

8. Комплексная методология прогноза свойств химических соединений. Адекватный прогноз активности химических соединений возможен только путем обобщения спектра прогнозных оценок, полученных несколькими существенно различающимися по математическому формализму методами для различных по сложности уровней и различных по физико-химическому смыслу способов описания структуры, с использованием всех доступных переменных описания и расширяющейся по параметрам избыточности такого описания, на основе нескольких концептуальных по результату схем принятия решений [Васильев П. М., Спасов А. А. и др., 2004]. Это центральная концепция ИТ «Микрокосм», которая представляет собой синтез всех предыдущих теоретических концепций и служит основой для построения прикладных составляющих технологии.

Данной концепции соответствует следующая схема построения прогнозных зависимостей: 1) формирование обучающей выборки из достоверно активных и неактивных соединений; 2) создание моделей обобщенных образов классов этих соединений на основе мегамерного многоуровневого описания их структуры группами параметров разного физико-химического смысла; 3) расчет ансамбля решающих правил с использованием нескольких существенно различающихся методов распознавания, отдельно для каждого уровня описания каждой группы параметров, по всем параметрам описания, без выявления «значимых» переменных; 4) вычисление спектра прогнозных оценок активности соединений обучающей выборки с применением всех полученных правил классификации; 5) построение с помощью различных стратегий по спектру прогнозных оценок интегральных многомодельных решающих правил и оценка их прогностической способности.

Использование комплексной методологии позволяет получать решающие правила, контекстно-независимые от состава обучающей выборки, способов описания структуры соединений и методов выявления зависимостей. В ИТ «Микрокосм» это реализовано посредством обобщения для каждого соединения с помощью трех стратегий прогноза спектра из 44 промежуточных прогнозных оценок активности, полученных четырьмя методами для 11 типов QL-дескрипторов.

Язык QL. Представляет собой специализированный мультидескрипторный иерархический многоуровневый язык описания структуры химических соединений с подструктурной нотацией [Васильев П. М., Спасов А. А., 2006].

Алфавит QL постулирован и задается тремя типами элементарных дескрипторов. 1. Структурный дескриптор (СД) - фрагмент структуры соединения c лабильной электронной системой. Определено 4352 вида СД: 378 гетероатомных (напр., -NH₂), 11 углеродных (напр., -CH₃) и 3963 циклических (напр., CycAr06). 2. Дескриптор длины (ДД) - число связей между двумя СД или число общих атомов у циклического дескриптора и другого СД. Определено 197 значений ДД: от 1 до 99 и от -1 до _98. 3. Дескриптор связи (ДС) - тип электронной системы на ДД. Включает 4 индекса наличия кратных (p, P), ароматических (a, A), нековалентных (n, N) связей и индекс сопряжения (0, 1). Определено 54 вида ДС (напр., pAn0).

Всего в QL определены 11 типов дескрипторов: 3 типа 1-го ранга (СД, ДД, ДС), 4 типа 2-го ранга (СД-ДД, СД₁-СД₂, СД-ДС и ДД-ДС), 3 типа 3-го ранга (СД₁-ДД-СД₂, СД₁-ДД-ДС и СД₁-СД₂-ДС), 1 тип 4-го ранга (СД₁-ДД-СД₂-ДС). Структура соединения описывается совокупностью входящих в нее QL-дескрипто-ров. Модели обобщенных образов классов активных/неактивных соединений формируются по обучающей выборке в виде матрицы, каждым элементом которой является число QL_дескрипторов данного вида в структуре конкретного соединения.

Методы прогноза. Разработаны четыре высокоточных метода распознавания, устойчиво работающие в мегамерных пространствах.

Метод Байеса. Логарифм вероятности принадлежности соединения C к классу k = {a, n} при наличии в нем d_i дескрипторов i-го типа j-го вида B_ij

,

где P(B_ij | C ? k) - априорная вероятность дескриптора B_ij в классе k. Соединение C по дескрипторам i-го типа принадлежит к тому классу, вероятность которого больше.

Метод расстояния. Взвешенное L₁-расстояние Пирсона в пространстве дескрипторов i-го типа от соединения C до центра класса k

,

где c_ij - координаты соединения C по дескриптору ij; z_ijk - координаты центра класса k по дескриптору ij; w_ij = (z_ija + z_ijn)^-1 - весовой коэффициент для дескриптора ij. Соединение C по дескрипторам i-го типа принадлежит к тому классу, расстояние до центра которого меньше.

Метод ближайшего соседа. Расстояние Евклида в пространстве дескрипторов i-го типа от соединения C до каждого соединения H_l обучающей выборки

, ,

где h_ijl - координаты соединения H_l по дескриптору ij; N - число соединений в обучающей выборке. По дескрипторам i-го типа соединение С принадлежит к тому классу, активность которого имеет ближайшее к нему соединение обучающей выборки.

Метод локального распределения. Коэффициент сходства соединения C и каждого соединения H_l обучающей выборки в пространстве дескрипторов i-го типа

, ,

где B_ijC - число дескрипторов ij в соединении С; B_ijl - число дескрипторов ij в соединении H_l. Для каждого класса k формируется подмножество соединений, имеющих по дескрипторам i-го типа коэффициент сходства Q_i(H_l) ? 0.8. На полученной локальной обучающей выборке производится классификация методом Байеса. Соединение C относят к тому классу, для которого больше локальная вероятность принадлежности соединения C к структурно сходному с ним подклассу.

Стратегии прогноза. Разработаны три концептуально разных стратегии для принятия решения об итоговой активности соединения.

Консервативная стратегия. Использует процедуру простого голосования, в которой все 44 прогнозных оценки считаются равнозначными, а решение принимается по большинству в 27 и более совпадающих оценок.

Нормальная стратегия. Основана на выборе по результатам автотестирования лучшего по точности метода прогноза, с обобщением 11 вычисленных каждым методом оценок с помощью взвешенного голосования с использованием Байесовского бинарного классификатора [Голендер В. Е. и др., 1978]

, .

Весовые коэффициенты и ,

где p_kli = (n_kli + 1)/(n_ail + n_nli + 2) - априорная вероятность классификации соединения C по дескриптору i-го типа методом l в класс k; n_kli - число соединений в классе k обучающей выборки, классифицированных методом l по дескриптору i-го типа как активные. В рамках метода l соединение C считается активным по всему QL_описанию, если L(д_l) ? 0, и неактивным, если L(д_l) < 0.

Рисковая стратегия. Основана на выборе по результатам автотестирования, отдельно по каждому из 11 уровней QL_описания, лучшего по точности метода прогноза с учетом типа дескрипторов. Процедуры итогового голосования нет, каждое из 44 прогнозных множеств рассматривается как самостоятельное информационное пространство. Классификационная метрика для соединения C рассчитывается по той формуле, которая соответствует выбранному методу.

Точность решающих правил оценивалась способами автопрогноза, скользящего, перекрестного и двойного скользящего контролей. Для повышения надежности прогноза итоговые оценки по всем трем стратегиям обобщались; для полуколичественных градаций активности результаты проверялись на непротиворечивость.

Фармакофоры-образы. Являются новым классом QSAR-объектов, каждый из которых включает в себя множество традиционных фармакофоров. Построение фармакофоров-образов происходит в два этапа [Спасов А. А. и др., 2007]: 1) рассчитываются списки статистически значимых по гипергеометрическому критерию QL-признаков активности; 2) формируются фармакофоры-образы путем пошагового объединения значимых QL_признаков, имеющих структурно близкие особенности.

Прогноз и экспериментальная проверка вида и уровня фармакологической активности структурно-разнородных соединений

Разработанная технология была проверена в прогнозе наличия/отсутствия 34 видов активности на базе данных из структурно-разнородных известных лекарственных и биологически активных веществ. В скользящем контроле точность прогноза по консервативной стратегии изменяется от 65 до 100 %; по нормальной стратегии - от 69 до 100 %; по рисковой стратегии - от 67 до 100 %. При использовании консервативной стратегии найдена 31 адекватная прогнозная зависимость (точность прогноза не менее 60%). В случае нормальной стратегии все 34 зависимости достоверны. Для рисковой стратегии получены 33 адекватных прогнозных зависимости. При использовании лучшей из трех стратегий адекватный прогноз возможен для всех 34 видов активности.

Полученные решающие правила были проверены на 815 испытанных производных бензимидазола, ГАМК и пирролидона при прогнозе наличия/отсутствия 10 видов фармакологической активности - адекватно прогнозируются 8 видов. В частности, для H₁-антигистаминной активности точность прогноза составила 73,7 %, а для 5-HT₂-антисеротониновой активности - 71,0 %.

Указанные решающие правила использованы для направленного поиска в ряду 112 адамантил-производных имидовых кислот соединений с психотропной активностью. При прогнозе совместно по трем стратегиям 76 % этих веществ с высокой достоверностью должны проявлять ноотропную активность. В результате последовательного применения рисковой стратегии и метода ближайшего соседа, совместно с правилом Липински [Lipinski C. A. et al., 1997], по прогнозу для испытаний было отобрано 4 соединения. После их экспериментального изучения оказалось, что три из них проявляют ноотропную активность, причем одно превосходит по активности препарат сравнения пирацетам. Следовательно, точность поиска производных адамантана с ноотропной активностью составила 75 %.

С помощью этих же решающих правил выполнен направленный поиск соединений с антивирусной активностью среди десяти адамантил-производных биологически активных веществ. При прогнозе 19 видов активности по трем стратегиям оказалось, что наиболее перспективной для изучения в данном ряду является антиортовирусная активность (83,3 % положительных оценок). По результатам прогноза совместно по трем стратегиям, с последующей оценкой 2D- и 3D-структурного сходства к реперному препарату тромантадину, к испытанию на антиортовирусную активность рекомендованы три вещества.

По этой же базе данных структурно-разнородных соединений для 19 видов активности была также проведена проверка точности прогноза высокого уровня активности, как наиболее интересного в практическом отношении. В скользящем контроле точность прогноза по консервативной стратегии изменяется от 83 до 99 %; по нормальной стратегии - от 72 до 97 %; по рисковой стратегии - от 73 до 99 %. При использовании консервативной стратегии получено 9 адекватных прогнозных зависимостей. Для нормальной и рисковой стратегий выявлено по 14 адекватных прогнозных зависимостей. При использовании лучшей из трех стратегий адекватный прогноз высокого уровня возможен для 16 из 19 видов активности.

С помощью найденных решающих правил выполнен направленный поиск производных адамантана с высокой антиоксидантной активностью. Среди десяти адамантановых аналогов биологически активных веществ только в структуре 3-(1-адамантиламино)-1H-пиразол-5-ола присутствует оксиароматическая группа, которая часто встречается в веществах-антиоксидантах. В связи с этим был выполнен прогноз уровня антиоксидантной активности этого соединения совместно по рисковой стратегии, методом ближайшего соседа и методом 2D-сходства к структурам трех известных антиоксидантных веществ. Оказалось, что данное производное адамантана должно проявлять выраженную антиоксидантную активность. В последующих экспериментах установлено, что это вещество превосходит по активности препараты сравнения: в 1,12 раза ионол и в 1,28 раза тролокс С.

Такая характеристика моделей обобщенных образов, как число видов QL-дескрипторов на одно соединение, является показателем химического разнообразия веществ различных фармакологических групп. Например, рассчитанное по обучающей выборке известных 5_HT₂_антагонистов значение этого параметра равно 141,8. Данные соединения являются весьма структурно-разнородными, поэтому при поиске новых веществ с указанным видом активности лучше использовать рисковую стратегию прогноза, максимально учитывающую новизну химической структуры. Намного менее структурно-разнородными являются соединения-нейролептики, для которых найденный по обучающей выборке показатель разнообразия равен 14,1. При поиске новых веществ с этим видом активности рациональнее применять консервативную стратегию. Таким образом, уже на стадии предварительного анализа обучающих выборок можно определить принципиальные особенности поиска новых соединений с различными видами активности.

Прогноз и экспериментальная проверка вида фармакологической активности структурно-сходных соединений

Поскольку скрининг всегда планируется, большинство производных одного химического ряда в первичных испытаниях показывают наличие активности. В этом случае класс «активные» составляют соединения с выраженной активностью, т. е. очень высокоактивные, высокоактивные и умеренноактивные, а класс «неактивные» - вещества низкоактивные, неактивные и с инверсным эффектом. Процент найденных в первичном скрининге активных (высокоактивных) соединений является оценкой точности некомпьютерного, интуитивного поиска.

Проверка прогноза выраженной активности среди структурно-сходных производных конденсированных азотсодержащих гетероциклов была проведена для 29 видов фармакологической активности. В скользящем контроле точность прогноза по консервативной стратегии колеблется от 47 до 95 %; по нормальной стратегии - от 61 до 90 %; по рисковой стратегии - от 61 до 93 %. При использовании разных стратегий найдено адекватных прогнозных зависимостей: для консервативной - 14, для нормальной - 15, для рисковой - 18. В случае применения лучшей из трех стратегий адекватный прогноз возможен для 22 из 29 видов активности.

...