Новые подходы в разработке и стандартизации фитопрепаратов из эфирномасличного сырья

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность темы.

Лекарственные препараты растительного происхождения имеют важное значение в терапии многих заболеваний. В настоящее время сложилась серьезная ситуация с проблемой рационального использования культивируемого эфирномасличного лекарственного растительного сырья, которая связана с реализацией новых подходов в создании фитопрепаратов, внедрением современных физико-химических методов стандартизации.

В современной фармацевтической науке создалась противоречивая ситуация. С одной стороны, далеко продвинутые научные исследования химического состава растений показывают широкие возможности получения веществ или лекарственных препаратов с различной фармакологической активностью. С другой стороны, используемая технология переработки растительного сырья, как правило, ориентирована на получение одного целевого продукта. Иначе говоря, сложившаяся на сегодняшний день практика промышленной переработки сырья очень часто не отражает степень его изученности. Преодоление этого противоречия, на наш взгляд, возможно путем внедрения новых подходов в оценке качества сырья и предусматривающих его комплексное использование при ресурсосберегающей технологии. Предпосылкой для внедрения такой технологии является изучение не только химического состава лекарственных растений, но и основных физико-химических свойств биологически активных соединений.

Примером нерационального использования сырья являются эфирномасличные растения. Ближайшее рассмотрение химического состава таких растений и используемой технологии их переработки наглядно подтверждают указанное выше противоречие. Технологические процессы, в которых оно участвует, нередко связаны или с потерей летучих компонентов эфирного масла или с полным удалением липофильных веществ в ходе, так называемой, стадии обезжиривания. Недооценка роли липофильного комплекса растения, включающего, кроме эфирного и жирного масел, еще большой спектр малополярных веществ, приводит к тому, что он почти полностью остается невостребованным. В то же время, высокая биодоступность этих соединений и наличие выраженной разносторонней фармакологической активности делают обоснованными и актуальными исследования по созданию новых лекарственных препаратов на основе липофильного комплекса эфирномасличного сырья.

Внедрение новых подходов в оценке качества исходного растительного сырья и разработке комплексной технологии его переработки требует установления таких взаимосвязей, как состав - технология, технология - фармакологическое действие. По нашему мнению, изменение технологии переработки лекарственного растительного сырья может привести к изменению не только качественного и количественного состава, но и фармакологического действия конечного продукта. Несомненно, что развитие новых технологий требует разработки и использования новых методов анализа при стандартизации сырья и целевых лекарственных препаратов.

Поэтому фармакогностическое обоснование, то есть глубокое химическое исследование состава и физико-химических свойств биологически активных веществ (БАВ) сырья, как и обоснование внедрения новых технологий комплексной переработки эфирномасличного сырья, является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы является обоснование новых подходов к созданию лекарственных препаратов из эфирномасличного сырья, на примере листьев шалфея лекарственного, эвкалипта прутовидного и травы полыни эстрагон при их комплексной промышленной переработке с учетом современных требований стандартизации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Изучить современное состояние исследований в области фармакогностического анализа видов эфирномасличного сырья, используемых в отечественной фармацевтической практике, и методов стандартизации лекарственных препаратов, разработанных на их основе.

2. Провести фармакогностическое исследование трех видов эфирномасличного сырья, найти новые подходы для стандартизации сырья и лекарственных препаратов по ведущим и анализируемым группам БАВ. Обосновать возможности применения сырья шалфея лекарственного и полыни эстрагон, выращиваемых в культуре в различных регионах Северного Кавказа, и сырья эвкалипта прутовидного, широко используемого в фармацевтической практике, для получения лекарственных препаратов.

3. Предложить новые или модифицированные методики стандартизации сырья шалфея, эвкалипта и полыни эстрагон, и лекарственных препаратов, разработанных на их основе, определить показатели и нормы качества для проектов фармакопейных статей.

4. Провести сравнительное изучение химического состава липофильных комплексов из сырья шалфея, эвкалипта и полыни эстрагон, полученных различными методами; изучить использование сжиженного углерода (IV) оксида как экстрагента для комплексной ресурсосберегающей переработки сырья.

5. Усовершенствовать технологию и стандартизацию лекарственных препаратов, разработанных на основе изучаемых видов лекарственного растительного сырья. Привести в соответствие с современными требованиями нормативную документацию, необходимую для их внедрения в производственную практику.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

На основании экспериментальных исследований в работе впервые предложены подходы к решению основных проблемных направлений по рациональному использованию, совершенствованию и унификации методов стандартизации сырья и разработанных на его основе фитопрепаратов.

На основании химического изучения терпеноидов и сопутствующих им БАВ эфирномасличных растений: шалфея лекарственного, полыни эстрагон и эвкалипта прутовидного, доказано, что существующие в настоящее время технологии их переработки не учитывают физико-химические свойства ведущих и анализируемых групп веществ и поэтому не могут быть признаны рациональными. Это позволило обосновать новые пути комплексной переработки эфирномасличного сырья.

Проведенные фармакогностические исследования изучаемых видов эфирномасличного сырья впервые показывают значение других, помимо эфирного масла, классов соединений в развитии новых ресурсосберегающих технологий комплексного использования сырья при его промышленной переработке.

Фракционное изучение терпеновых соединений шалфея лекарственного показало, что ведущей группой веществ в их составе являются дитерпеновые кислоты. Установлено, что сырье шалфея лекарственного, выращенного в различных регионах Северного Кавказа, содержит от 3,13 до 8,89% суммы дитерпеновых кислот и может служить источником липофильных лекарственных препаратов. На основании результатов фитохимического исследования предложен новый фитопрепарат - экстракт шалфея лекарственного жидкий, для которого определены методики стандартизации, основные показатели и нормы качества.

На основании фармакогностического исследования полыни эстрагон, культивированного в Республике Дагестан, выявлены некоторые закономерности накопления и распределения основных БАВ в растении, определен их качественный и количественный состав в сырье. Данные фармакологического скрининга и фитохимических анализов послужили обоснованием для разработки нового лекарственного препарата «Экстракт полыни эстрагон жидкий», для которого определены методики стандартизации, основные нормы качества, предложена рациональная технология.

На основании фитохимического анализа сырья и лекарственных препаратов эвкалипта прутовидного, доказано, что существующая в настоящее время оценка качества по содержанию эфирного масла не достаточна для стандартизации промышленного сырья эвкалипта, используемого для получения лекарственных препаратов «Хлорофиллипт, экстракт густой» и «Эвкалимин». В работе впервые для стандартизации листьев эвкалипта прутовидного предложено осуществлять качественный и количественный анализ фенолоальдегидов, как ведущей и анализируемой группы биологически активных веществ. Для стандартизации лекарственного препарата «Хлорофиллипт, экстракт густой» также предложено осуществлять качественный и количественный анализ фенолоальдегидов. Установлено, что их содержание в данном лекарственном препарате составляет более 40% в пересчете на ГСО эвкалимина.

Одним из современных и прогрессивных методов промышленной переработки эфирномасличного сырья является экстракция сжиженными газами. В исследованиях, посвященных использованию данного метода, очень важным направлением является изучение химического состава извлечений и оценка их биоэквивалентности известным лекарственным препаратам. В проведенных нами исследованиях впервые изучен химический состав СО2-экстрактов, полученных из сырья шалфея, полыни эстрагон и эвкалипта сверхкритическим флюидным углерода (IV) оксидом. В экстракте шалфея лекарственного обнаружено 59 соединений, относящихся в основном к монотерпенам, сесквитерпенам и дитерпенам; в экстракте полыни эстрагон идентифицировано 45 соединений, из которых значительная часть относится к ароматическим производным; в экстракте эвкалипта прутовидного обнаружено 58 индивидуальных соединений, в основном моно- и сесквитерпены. Проведенные сравнительные исследования химического состава эфирных масел и СО2-экстрактов полыни эстрагон и эвкалипта прутовидного позволили оценить влияние технологии на химический состав извлечения. Установлено, что качественный состав эфирного масла и СО2-экстракта, полученного из одного сырья, практически одинаковый, а основные отличия между ними заключаются в соотношении компонентов. В частности, обнаружено, что в составе СО2-экстрактов больше содержится сесквитерпенов, дитерпенов и насыщенных углеводородов, что повышает их фармакологическую активность.

Впервые, в целях реализации комплексного подхода в промышленной технологии лекарственных препаратов эвкалипта прутовидного, предложена схема глубокой переработки сырья, которая включает две основные стадии:

1) получение СО2-экстракта с последующим фракционированием лекарственного препарата «Эфирное масло эвкалипта»; 2) выделение из оставшегося шрота суммы фенолоальдегидов с получением лекарственных препаратов «Хлорофиллипт, экстракт густой» или «Эвкалимин».

Практическая значимость работы.

Экспериментально подтверждены новые подходы к созданию лекарственных препаратов из эфирномасличного сырья.

Исследована и усовершенствована технология лекарственного препарата «Сальвин, экстракт густой». Предложены новые технологические схемы, позволяющие в одном случае полностью удалять остатки экстрагента (ацетона) из готового продукта, без термического воздействия на лекарственный препарат, в другом - заменить ацетон на 95% спирт этиловый. На основании фитохимического исследования листьев эвкалипта прутовидного исследована и усовершенствована технология лекарственного препарата «Хлорофиллипт, экстракт густой». Переработана существующая нормативная и техническая документация на лекарственные препараты сальвина и хлорофиллипта: разработаны проекты фармакопейных статей предприятия (ФСП), опытно-промышленный регламент и промышленные регламенты. Результаты исследований внедрены на фармацевтическом предприятии ЗАО «Вифитех» (Моск. обл., п. Оболенск).

Материалы внедрения:

1. ФСП 42-8556-07 «Хлорофиллипт, экстракт густой»;

2. Проект ФС «Листья эвкалипта прутовидного» (на согласовании в ГУ ВИЛАР);

3. Проект ФСП «Хлорофиллипт, раствор для приема внутрь и местного применения спиртовой 1 %» (находится на экспертизе в ФГУ «НЦ ЭСМП»);

4. Проект ФСП «Сальвин, экстракт густой» (находится на экспертизе в ФГУ «НЦ ЭСМП»);

5. Проект ФСП «Хлорофиллипт, раствор для местного применения масляный 2 %» (находится на экспертизе в ФГУ «НЦ ЭСМП»);

6. Проект ФСП «Сальвин-ВИФ, раствор для местного и наружного применения спиртовой 1 %» (находится на экспертизе в ФГУ «НЦ ЭСМП»);

7. Проект ФСП «Шалфея лекарственного экстракт жидкий 1:1» (на согласовании в ОАО «МФФ»);

8. Промышленный регламент на производство хлорофиллипта (утвержден ВИЛАР, используется в производстве ЗАО «Вифитех»);

9. Промышленный регламент на производство сальвина (утвержден в ГУ ВИЛАР, используется в производстве ЗАО «Вифитех»);

10. Промышленный регламент на производство хлорофиллипта раствора масляного 2% (утвержден в ГУ ВИЛАР, используется в производстве ЗАО «Вифитех»);

11. Опытно-промышленный регламент на производство сальвина раствора спиртового 1% (на согласовании в ГУ ВИЛАР).

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы были доложены на следующих конференциях: региональные научно-практические конференции по фармакологии, фармации и подготовке кадров (г. Пятигорск, 1997 - 2002 гг.); Международная конференция «Фазовые переходы и нелинейные явления в конденсированных средах» и IV Междунар. семинар «Физика магнитных фазовых переходов» (Дагестанский НЦ РАН, г. Махачкала, 2001 г.); 1 и 2 Всероссийские научно-практические конференции «Химия в технологии и медицине» (Дагестанский госуниверситет, г. Махачкала, 2001 - 2002 гг.); 16 Научно-практическая конференция по охране природы Дагестана (Махачкала, 2001); 8, 9 и 10 Международные съезды «Фитофарм»: «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Миккели, Финляндия - С.-Пб., 2004 - 2006 гг.); 7 Междунар. симпозиум по химии природных соединений (16-18 октября 2007, Ташкент).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательский работ ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» (номер государственной регистрации 01200112164).

Положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование разработки ресурсосберегающих технологий при создании фитопрепаратов из эфирномасличного лекарственного растительного сырья с учетом химического состава и современных принципов стандартизации.

2. Теоретическое и экспериментальное обоснование исследования лекарственных растений, содержащих эфирные масла, в том числе уже используемых в медицинской практике, с целью снижения эксплуатационной нагрузки на природные ресурсы, более глубокой их промышленной переработки.

3. Результаты исследования зависимости химического состава липофильных извлечений от метода экстракции, показывающие возможность применения сжиженных газов при разработке лекарственных препаратов из эфирномасличного сырья.

4. Оптимизация технологических параметров при получении лекарственных препаратов шалфея лекарственного и эвкалипта прутовидного при рассмотрении дитерпеновых производных в качестве целевых веществ на примере лекарственных препаратов сальвин и хлорофиллипт.

5. Результаты фармакогностических и фитотехнологических исследований сырья шалфея лекарственного и полыни эстрагон, выращиваемых в культуре в различных регионах Северного Кавказа.

6. Результаты сравнительных исследований компонентного состава эфирных масел и СО2-экстрактов, полученных из исследуемых растительных объектов, экспериментальные данные по усовершенствованию технологии фитопрепаратов из эфирномасличного сырья.

7. Результаты исследований по усовершенствованию методов стандартизации и промышленной технологии липофильных лекарственных препаратов - сальвина, получаемого из листьев шалфея, и хлорофиллипта, получаемого из листьев эвкалипта прутовидного.

8. Результаты усовершенствования и переработки нормативной и технической документации на растительное сырье и лекарственные препараты, содержащие дитерпеновые кислоты и фенолоальдегиды.

1. Материалы и методы исследований

Объектами исследования являлось лекарственное растительное сырье, содержащее эфирные масла: листья шалфея лекарственного [Salvia officinalis L., сем. Lamiaceae], трава полыни эстрагон [Artemisia dracunculus L., сем. Asteraceae] и листья эвкалипта прутовидного [Eucalyptus viminalis Mill., сем. Myrtaceae], достоверные образцы карнозоловой кислоты, олеаноловой кислоты, эвкалимина, метилхавикола (эстрагола) и анетола. Исследовались также извлечения водные, водно-спиртовые, спиртовые, ацетоновые и др., полученные из исследуемых видов сырья, СО2-экстракты, эфирные масла, полученные перегонкой с водяным паром, препараты сальвин, хлорофиллипт и эвкалимин, полученные традиционным и усовершенствованным способами, а также шрот листьев эвкалипта прутовидного после гидродистилляции и СО2-экстракции. Фитохимические исследования проводились с использованием современных физико-химических методов: хроматография колоночная, тонкослойная (ТСХ), газо-жидкостная (ГЖХ); фотоэлектроколориметрия, УФ- и ИК- спектрофотометрия, атомно-адсорбционная спектрофотометрия и др. Скрининговые микробиологические и фармакологические исследования включали изучение антибактериальной, противовоспалительной, антигипоксической и др. видов специфической активности промежуточных и конечных продуктов.

2. Результаты исследования

Фармакогностическое исследование сырья шалфея лекарственного и полыни эстрагон.

Проведены фармакогностические исследования образцов сырья шалфея лекарственного, выращенного в специализированных хозяйствах различных регионов Северного Кавказа (в Ставропольском и Краснодарском краях, Республиках Кабардино-Балкария и Дагестан), полыни эстрагон, выращенной в культуре в Республике Дагестан.

Фармакогностическое исследование листьев шалфея лекарственного.

Основными направлениями при изучении сырья шалфея лекарственного были сравнительные фитохимические исследования и оценка возможности использования сырья шалфея, выращенного на Северном Кавказе, для получения лекарственных препаратов. Стандартизация сырья, проведенная нами в объеме предварительных испытаний, показала, что качество всех исследуемых образцов соответствовало требованиям ГФ XI. Результаты фитохимического анализа, представленные в таблице 1, показали, что, исследованные образцы можно отнести к подгруппам со сравнительно высоким содержанием дитерпеновых кислот (образцы, выращенные в Республике Дагестан и в Краснодарском крае) и низким их содержанием (образцы, выращенные в Ставропольском крае и Республике Кабардино-Балкария).

Установлено также, что в листьях шалфея лекарственного, выращенного в горных условиях Гунибского плато Республики Дагестан (Горный ботанический сад ДНЦ РАН (ГорБС ДНЦ РАН)) содержание основных БАВ (дитерпеновых кислот и флавоноидов) больше, чем в сырье из других регионов. Причиной этому может быть генетическая принадлежность шалфея лекарственного к нагорным ксерофитам, и на опытных участках ГорБС ДНЦ РАН он выращивался в благоприятных для него условиях.

Таблица 1 - Результаты сравнительного фитохимического анализа листьев шалфея лекарственного, выращенных в культуре в различных регионах Северного Кавказа

Примечание: РД - Республика Дагестан; КБР - Кабардино-Балкарская Республика, СК - Ставропольский край; КК - Краснодарский край.

При изучении возможности использования исследуемого сырья для получения лекарственных препаратов мы провели анализ фракций дитерпеновых кислот, выделенных и очищенных нами из сырья. Присутствие дитерпеновых соединений исследовали также в извлечениях, полученных водно-спиртовыми смесями различной концентрации и сжиженным углерода (IV) оксидом. Анализ фракций, который осуществлялся с использованием достоверного образца карнозоловой кислоты, показал, что карнозоловая кислота, как основной представитель дитерпеновых кислот шалфея лекарственного, присутствует во всех проанализированных образцах. Было также обнаружено совпадение УФ-спектров поглощения у растворов выделенных фракций и раствора карнозоловой кислоты (максимумы при 285 ±5 нм, 315 ± 5 нм и 408 ± 5 нм).

В ходе исследования физико-химических свойств карнозоловой кислоты и полученных извлечений, были разработаны методики количественного определения суммы дитерпеновых кислот в сырье шалфея и его лекарственных препаратах. Подобранные условия выделения и очистки фракции дитерпеновых кислот позволяют достоверно и точно устанавливать их содержание УФ-спектрофотометрическим методом. Расчет предлагается проводить с помощью установленного нами с использованием стандартного образца карнозоловой кислоты удельного показателя поглощения (= 40,92). Оценка основных валидационных параметров предлагаемой методики позволяет сделать вывод о ее соответствии критериям линейности, селективности, правильности (отсутствие систематической ошибки) и воспроизводимости (tрассч. < tтабл.).

В результате проведенных исследований нами предложено осуществлять стандартизацию сырья шалфея лекарственного, наряду с определением эфирного масла, по содержанию дитерпеновых кислот (Таблица 2).

Фармакогностическое исследование травы полыни эстрагон.

В образцах травы полыни эстрагон (выращивается в Дагестанской зональной опытной станции ВИР), заготовленных в период массового цветения (основная заготовка) и на различных фазах вегетации, мы определяли основные числовые показатели, химический состав, накопление БАВ по фазам развития, а также их распределение по различным надземным органам. Результаты фитохимического анализа показывают, что листья и соцветия полынь эстрагон характеризуются высоким содержанием эфирного масла, кумаринов, флавоноидов и водорастворимых полисахаридов (Таблица 3).

Таблица 2 - Показатели и нормы качества листьев шалфея лекарственного

Примечание: жирным шрифтом в таблице выделены показатели, которые для данного вида лекарственного растительного сырья разработаны впервые.

Таблица 3 - Содержание биологически активных веществ в надземных органах полыни эстрагон, выращиваемой в культуре в Республике Дагестан

Примечание: - показатель не определялся; - вещества не обнаружены.

Изучение динамики распределения БАВ в траве полыни эстрагон показало, что наибольшее содержание флавоноидов и кумаринов, выбранных нами в качестве анализируемых групп веществ, происходит в фазу массового цветения, высокий уровень их содержания сохраняется и в фазу плодоношения (Рисунок 1).

Установлено также, что на стадиях массового цветения и плодоношения содержание эфирного масла в траве не менее 1,0%. Для сырья полыни эстрагон подобраны оптимальные условия заготовки, сушки и предварительной обработки. Для листа и стебля изучены анатомо-диагностические признаки (железки, секреторные вместилища и др.), позволяющие подтверждать подлинность данного вида сырья.

Фитохимический анализ и совершенствование методов стандартизации листьев эвкалипта прутовидного.

В настоящее время известно несколько видов сырья эвкалипта прутовидного: листья высушенные (ГФ XI), побеги свежие, предназначенные для получения эфирного масла и побеги высушенные, предназначенные для получения липофильного лекарственного препарата «Эвкалимин». Для производства другого липофильного препарата - хлорофиллипта, используют листья высушенные, поэтому они явились основным сырьем эвкалипта в наших исследованиях. Основным результатом проведенных фитохимических исследований является экспериментальное обоснование стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, предназначенных для производства хлорофиллипта, по содержанию целевых действующих веществ, а именно суммы фенолоальдегидов, что нашло отражение в разработанном нами проекте ФС «Листья эвкалипта прутовидного» (взамен ст. 15, ГФ XI).

Для подтверждения подлинности и доброкачественности сырья мы предлагаем ввести в ФС раздел «Качественные реакции», включающий метод ТСХ для обнаружения фенолоальдегидов. В раздел «Количественное определение» включена методика определения суммы фенолоальдегидов УФ-спектрофотометрическим методом в пересчете на ГСО эвкалимина. Разработанные методики анализа содержат стадию пробоподготовки, в которой предусмотрена очистка суммы фенолоальдегидов от сопутствующих веществ. Эти методики были апробированы на образцах листьев эвкалипта прутовидного от нескольких партий, отобранных из архива ЗАО «Вифитех» (Таблица 4).

Таблица 4 - Результаты количественного определения суммы фенолоальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного

В таблице 5 представлены основные показатели и нормы качества листьев эвкалипта прутовидного цельных, предлагаемые в проекте ФС.

Таблица 5 - Показатели и нормы качества листьев эвкалипта прутовидного

Оценка основных валидационных параметров методики количественного определения фенолоальдегидрв, проведенная нами в использованием ГСО эвкалимина, позволяет сделать вывод о ее соответствии критериям линейности, селективности, правильности (отсутствие систематической ошибки) и воспроизводимости (tрассч. < tтабл.).

Исследование липофильных извлечений шалфея лекарственного, полыни эстрагон и эвкалипта прутовидного.

Из литературных данных известно, что экстракция сжиженными газами - процесс интенсивный, позволяющий извлечь уже на второй ступени от 80% до 90% и более суммы экстрактивных веществ. Также известно, что на динамику процесса и состав извлечений большое влияние оказывают условия экстракции, в основном давление и температура. Исследование липофильных извлечений, полученных из исследуемых видов сырья, проводилось с целью оценить влияние метода экстракции на состав извлечений и включало анализ компонентного состава эфирных масел и СО2-экстрактов.

Экстракция листьев шалфея сверхкритическим углерода (IV) оксидом была проведена в три ступени при температуре +31,5 оС и давлениях 10 МПа (фракция 1), 20 МПа (фракция 2) и 30 МПа (фракция 3). Динамика выхода экстрактивных веществ, представлена на рисунке 2.

Химический анализ полученных фракций проводился методом газо-жидкостной хроматографии с масс-спектральной детекцией. Химический анализ показал, что в качественном составе фракций различий практически нет, основное различие между фракциями наблюдается в количественном соотношении компонентов. В химическом составе фракции 1 доминируют моно- и сесквитерпены (суммарно около 63%). Фракция 2 характеризуется примерно равным соотношением терпенов и высокомолекулярных спиртов. Во фракции 3, наряду с терпенами и спиртами, заметно возрастает количество насыщенных углеводородов. В составе исследуемых образцов идентифицировано 59 соединений, основные компоненты по фракциям представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Фракционный состав основных компонентов СО2-экстракта шалфея