Люминол-зависимое свечение, сопровождающее реакцию Фентона

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Люминол-зависимое свечение, сопровождающее реакцию Фентона

Аристова Н.А.

Иванова И.П.

Трофимова С.В.

Князев Д.И.

Пискарев И.М.

В современной биологии большую роль играет наблюдение свечения, возникающего в исследуемых объектах. Свечение обусловлено протеканием свободно-радикальных процессов. Следом, оставшимся от протекания свободно-радикальных процессов, является накопление гидроперекисей. Для определения содержания гидроперекисей в образец вводят инициатор разложения перекиси, в качестве которого используют металлы переменной валентности. Чаще всего, двухвалентное железо. При введении Fe2+ в образце начинается реакция Фентона. Продукты, образующиеся в этой реакции, вызывают свечение. Для усиления свечения в образец вводят люминол. Биологические пробы имеют рН ~ 6-7. В этих условиях введение люминола если и увеличивает свечение, то очень слабо. Изменение рН биологической пробы недопустимо, т.к. это может сильно исказить условия протекания процессов в изучаемом объекте. Интересующие исследователя процессы сопровождаются большим фоном, поэтому для улучшения соотношения сигнал/шум регистрацию излучения нужно проводить в то время, пока идёт реакция Фентона. Сведений о времени протекания реакции Фентона в литературе нет, поэтому исследователи выбирают время наблюдения произвольно [1].

Представляет интерес получить сведения о времени реакции Фентона при разных концентрациях реагентов и рассмотреть причины малой эффективности люминола в нейтральной среде. С этой целью составлена кинетическая модель реакции Фентона, рассчитаны характеристики реакции в кислой, нейтральной и щелочной среде. Результаты расчёта сравниваются с экспериментом. Отсюда делаются выводы об особенностях использования люминола в биологических системах.

Методика эксперимента. Световое излучение регистрировалось прибором БХЛ-06 по методике [1]. Калибровку прибора осуществляли по эталонному источнику света известной интенсивности. Объём пробы составлял 1,2 мл. Кювета с пробой располагалась почти вплотную к фотокатоду ФЭУ, что обеспечивало высокую эффективность регистрации. Раствор перекиси водорода требуемой концентрации готовился предварительно, раствор FeSO4 - непосредственно перед началом эксперимента. Регистрация излучения начиналась через 2 секунды после смешивания растворов перекиси и FeSO4. Использовались реактивы ЧДА, дважды дистиллированная вода (рН = 6). Измерения проводились в кислой среде (рН = 2), нейтральной (рН = 6) и щелочной (рН = 12). Значение рН = 2 раствора получали добавлением серной кислоты, рН = 12 - NaOH. При регистрации излучения коррекцию фона, который вычитался автоматически, проводили непосредственно перед и сразу после каждого измерения. Кислая среда использовалась в связи с тем, что в ней исходное двухвалентное железо стабильно, а образующееся трёхвалентное железо не выпадает в осадок. Чистота растворов, состав продуктов реакции на разных стадиях контролировался путём наблюдения УФ-спектров с помощью прибора Флюорат-02 Панорама. В частности, концентрация трёхвалентного железа измерялась по пику поглощения при = 304 нм, коэффициент экстинкции = 2200 моль/(л.см).

Спектральные характеристики излучения качественно оценивались с помощью светофильтров из синих и красных пластиковых плёнок толщиной 0,5 мм. Спектр пропускания плёнок измерялся прибором Флюорат-02 Панорама. Полоса пропускания синего фильтра на уровне не менее 10% от 410 до 590 нм, красного - от 590 до 750 нм. Отбирались плёнки, не дающие вторичного излучения в видимой области спектра.

Результаты и обсуждение.

Кинетическая модель процесса. Модель процесса в кислой среде включает реакции (1-17), приведённые в таблице 1. Концентрации ионов OH и H+ (рН раствора) задавались в виде коэффициентов. Модель включает взаимодействие двухвалентного железа с перекисью водорода и последующее образование радикалов OH, HO2, O2- и синглетного кислорода, диссоциацию перекиси водорода H2O2 HO2 + H+, pKa = 11,5 (реакции 12, 13) и равновесие HO2 H+ + O2, pKa = 4,8 (реакции 7, 8). Синглетный кислород включён в схему реакций в связи с тем, что на его образование расходуются активные частицы. Значения констант скорости реакций взяты из работы [2]. Решение системы уравнений химической кинетики осуществлялось с помощью пакета MathCad 11.

Рассчитывалось количество актов окисления двухвалентного железа N(Fe2+ Fe3+), которое включало как количество первично окисленных молекул Fe2+, вводимых с реактивом, так и молекулы Fe2+, восстановленные в реакции (11) из ионов Fe3+.

Предполагалось, что в нейтральной и щелочной среде трёхвалентное железо выпадает в осадок после реакции Fe3+ + 3OH- Fe(OH)3. В расчёте учитывалось время жизни ионов трёхвалентного железа в растворе. Наблюдая время появления окрашенного осадка в нейтральной среде после смешивания реагентов авторы заключили, что время жизни иона Fe3+ порядка 1 секунды. Тогда, предполагая, что скорость образования Fe(OH)3 пропорциональна концентрации гидроксильных радикалов, время жизни ионов Fe3+ при рН = 12 будет в 106 раз меньше и составит примерно 10-6 секунды.

Таблица 1. Константы скорости реакций в растворе Фентона

Кинетика окисления Fe2+. Рассчитанная зависимость количества актов окисления N(Fe2+ Fe3+) в кислой среде (рН = 2) для случая [Fe2+] > [H2O2] при [H2O2] = 10-6 моль/л от времени представлена на рисунке 1. Из графика видно, что для всех концентраций Fe2+ от 10-2 до 10-5 моль/л величина C = N(Fe2+ Fe3+) достигает предельного значения 210-6 моль/л. Величина предельной концентрации определяется тем, что одна молекула перекиси распадается на два гидроксильных радикала, каждый из которых окисляет одну молекулу двухвалентного железа. Процесс окисления прекращается, когда перекись оказывается полностью израсходованной.

В схеме реакций лимитирующая стадия - взаимодействие двухвалентного железа с перекисью, т.к. константа скорости этой реакции минимальна. Остальные реакции имеют большие константы скорости и происходят практически мгновенно. Сокращать время реакции могло бы взаимодействие перекиси с радикалами. Константа скорости этой реакции большая, но концентрация радикалов мала, [OH]<<[Fe2+], поэтому определяющей всё равно остаётся реакция перекиси с железом. Оценим время реакции при [Fe2+] > [H2O2]. Скорость реакции (1) равна: w = k1 [Fe2+] [H2O2]

Время реакции будет определяться расходованием перекиси:

Т.е. время реакции определяется только концентрацией двухвалентного железа.

Кинетика окисления Fe2+ при разных концентрациях перекиси, меньших концентрации железа, представлена на рисунке 2. Видно, что при всех концентрациях перекиси от 10-4 до 10-8 моль/л за 60 секунд успевает произойти число актов окисления, равное количеству образующихся при распаде перекиси гидроксильных радикалов, т.е. 2х[H2O2].

Рисунок 1. Кинетика окисления Fe2+ при рН = 2. Случай [Fe2+] > [H2O2]. Концентрация перекиси [H2O2] = 10-6 моль/л; двухвалентного железа:

1 - 10-2 ; 2 - 10-3 ; 3 - 10-4;

4 - 10-5 моль/л. По осям:

t - время, секунды;

С - количество актов окисления к моменту времени t, моль/л.

Рисунок 2. Кинетика окисления Fe2+ при рН = 2. Концентрация [Fe2+] = 10-3 моль/л. Концентрация перекиси водорода:

1 - 10-4, 2 - 10-5, 3 - 10-6,

4 - 10-7, 5 - 10-8 моль/л.

С - количество актов реакции N(Fe2+ Fe3+) к моменту времени t (моль/л), t - время, секунды.

При [Fe2+] < [H2O2] пренебречь вкладом других реакций, кроме (1), нельзя. Первично введённое двухвалентное железо быстро расходуется. Трёхвалентное железо будет восстанавливаться обратно в двухвалентное (реакция 11), и процесс будет идти до полного расходования перекиси, а его скорость определяется скоростью восстановления Fe3+.

Зависимость количества актов окисления C = N(Fe2+ Fe3+) в кислой среде (рН = 2) для случая [Fe2+] < [H2O2] при [Fe2+] = 10-6 моль/л от времени представлена на рисунке 3. Из рисунка видно, что число актов окисления существенно превышает количество молекул Fe2+, первоначально введённых в раствор. Это обусловлено протеканием цепных реакций, на поддержание которых расходуется перекись. Время, за которое количество актов реакции окисления могло бы приблизиться к количеству молекул перекиси водорода, при всех условиях больше 5000 секунд.

Рассчитанная кинетика подтверждается спектрофотометрическими измерениями пика поглощения при = 304 нм, связанного с образованием трёхвалентного железа. Сравнивая рисунки 1-3 можно понять, что определить концентрацию накопленных гидроперекисей в кислой среде можно только для случая [Fe2+] > [H2O2], когда есть возможность регистрировать всё излучение, сопровождающее реакцию. Из этих данных следует важный для практической работы вывод. Регистрировать излучение, непосредственно сопровождающее реакцию, при [Fe2+] = 10-3 моль/л следует в течение 60 секунд после приготовления смеси, введения в раствор железа. При условии [Fe2+] > [H2O2] время реакции определяется концентрацией железа и составляет 6 секунд, 60, 600 и 6000 секунд для [Fe2+] = 10-2, 10-3, 10-4 и 10-5 моль/л соответственно.

Концентрации активных частиц, возникающих в растворе Фентона при [Fe2+] = 10-3, и [H2O2] = 10-4 моль/л, рН = 2 за время до 60 секунд с начала реакции, представлены на рисунке 4. Видно, что основной активной частицей являются гидроксильные радикалы, однако в начале реакции, когда ещё не наработаны ионы Fe3+, концентрация супероксидных радикалов О2 намного больше. Ионы трёхвалентного железа расходуют супероксидные радикалы, и когда Fe3+ ещё нет, радикалы О2 быстро накапливаются. С появлением трёхвалентного железа концентрация супероксидных радикалов сильно падает.

Рисунок 3.

Случай [Fe2+] < [H2O2]. Количество актов окисления двухвалентного железа C (моль/л) при концентрации

[Fe2+] = 10-6 моль/л,

рН = 2 к моменту времени t (секунды). Концентрации перекиси водорода: 1 - 10-2;

2 - 10-3; 3 - 10-4;

4 - 10-5 моль/л.

В нейтральной среде (рН = 6) начинает играть роль окисление двухвалентного железа кислородом, растворённым в воде, и выпадение в осадок трёхвалентного железа. Однако за время до 600 секунд влияние этих процессов не существенно, и справедливы оценки, сделанные для кислой среды. В сильно щелочной среде (рН = 12) эти процессы ускоряются, однако на начальной стадии реакции предложенная можель может быть применена для оценки особенностей кинетики.

Рисунок 4. Зависимость логарифма концентрации радикалов и активных частиц

lg R (моль/л) в момент времени t (с) при [Fe2+] = 10-3 моль/л и [H2O2] = 10-4 моль/л,

рН = 2. 1 - OH; 2 - O2; 3 - HO2; 4 - HO2.

Люминол-зависимое свечение. Рассмотрим случай определения концентрации перекиси путём регистрации излучения, возникающего в процессе реакции. В принципе, желательно зарегистрировать всё свечение. Эта величина определяется интенсивностью свечения и длительностью процесса. Судить о концентрации перекиси по одной только интенсивности свечения нельзя, так как длительность свечения является независимым параметром. Экспериментально можно определить число испущенных фотонов за ограниченное время, но если время реакции будет составлять недели, сосчитать все испущенные фотоны практически невозможно.

Для усиления свечения раствора в него вводят люминол. Механизм образования возбуждённых состояний, излучающих фотоны, рассмотрен в работе [3]. На первой стадии люминол Lum взаимодействует с гидроксильными радикалами (реакция 15, табл. 1), образуя радикалы LOOH. Дальнейшие превращения радикалов LOOH могут привести к образованию продуктов, непосредственно испускающих фотоны. Механизмы реакций высвечивания могут быть различными, поэтому рассмотрим сначала кинетику образования LOOH. Если высвечивание будет происходить мгновенно, тогда интенсвность свечения будет пропорциональна скорости образования LOOH, а полное число испущенных фотонов - количеству образовавшихся радикалов LOOH.

Возьмём случай [Fe2+] > [H2O2]. При этом время реакции будет определяться концентрацией двухвалентного железа. Оценим удобные для экспериментатора концентрации железа и люминола. Зависимость скорости образования LOOH в течение 1000 секунд для [Fe2+] = 10-3, 10-4 и 10-5 моль/л приведена на рисунке 5.

Рисунок 5. Скорость образования радикалов люминола LOOH dN, моль/(л с) при рН = 2 и разных концентрациях двухвалентного железа, t - время наблюдения, с. 1 - [Fe2+] = 10-3 моль/л, 2 - [Fe2+] = 10-4 моль/л, 3 - [Fe2+] = 10-5 моль/л. Концентрация [H2O2] = 10-5 моль/л, концентрация люминола 10-4 моль/л.

Исходя из того, что свечение нужно регистрировать в течение всего времени реакции, измерить световыход при [Fe2+] = 10-3 моль/л за 60 секунд не представляет проблемы. При [Fe2+] = 10-4 моль/л регистрировать свечение за время реакции 600 секунд также возможно, однако интенсивность свечения уменьшится в 10 раз. При этом время измерения, в течение которого будет регистрироваться эффект + фон возрастёт также в 10 раз, т.е. в полученной светосумме соотношение сигнал/шум будет намного хуже. Регистрировать излучение 6000 секунд за время реакции при [Fe2+] = 10-5 моль/л уже затруднительно, соотношение сигнал/шум ещё ухудшится.

Расчёт показывает, что при [Fe2+] = 10-5, 10-4 и 10-3 моль/л, количество образовавшихся за полное время реакции радикалов LOOH будет одинаково. Однако, если регистрировать излучение ограниченное время, например, 60 секунд, то при [Fe2+] = 10-3 моль/л мы можем зарегистрировать всё свечение, в остальных случаях - только его часть. Какая часть излучения зарегистрирована, сказать из эксперимента нельзя, так как время реакции зависит не только от [Fe2+], как при [Fe2+] > [H2O2], но и от [H2O2], если [H2O2] > [Fe2+]. Значение концентрации перекиси, которое нужно найти, мы не знаем, поэтому результат может быть неоднозначным.

Зависимость концентрации молекул [LOOH], образовавшихся за время наблюдения 120 секунд (N), от концентрации перекиси для разных условий эксперимента представлена на рисунке 6. Концентрация [Fe2+] выбрана равной 10-5 моль/л, концентрации люминола от 10-3 до 10-7 моль/л. Такие концентрации реактивов часто используются при практических анализах [3]. Оказалось, что значения N не зависят от концентрации люминола в пределах [Lum] от 10-3 до 10-5 моль/л (значения при этих концентрациях совпадают и ложатся на одну кривую (1). Для кривой (2) при концентрациях перекиси от 10-3 до 10-5 моль/л люминол (его концентрация 10-6 моль/л) расходуется практически весь, поэтому зависимость N от [H2O2] в этих пределах слабая. Аналогично для кривой (3) при [H2O2] от 10-3 до 10-6 моль/л.

Рисунок 6. Суммарная концентрация радикалов LOOH (N, моль/л), образовавшихся за первые 120 сек реакции.

P = [H2O2], моль/л.

Концентрация [Fe2+] = 10-5 моль/л,

концентрация люминола: 1 - 10-5 [Lum] 10-3, 2 - 10-6 и 3 - 10-7 моль/л.

Сложный и нелинейный характер зависимостей на рис. 6 свидетельствует о том, что измеренная концентрация [LOOH] при одном наборе концентраций ]Fe2+] и [Lum] не позволяет однозначно определить не только абсолютное значение [H2O2], но и соотношение концентраций для разных растворов. В частности, для кривой 3 видно, что при [Lum] = 10-7 моль/л и [Fe2+] = 10-5 моль/л зависимость [LOOH] от [H2O2] очень слабая, и концентрация [LOOH] может даже уменьшаться с ростом [H2O2].

Одним из возможных путей дальнейших превращений LOOH является взаимодействие с супероксидным радикалом O2 (реакция 16). Получается возбуждённая молекула Г*. Время высвечивания фотона, согласно работе [3], много меньше 1 секунды. Молекулы примесей могут это время увеличивать, но в чистом растворе Фентона таких примесей нет. Поэтому в дальнейшем примем, что высвечивание Г* происходит мгновенно, а константу скорости реакции 16, положим равной 1.

Образующийся продукт Г* может излучать фотоны в синей области спектра [3]. Скорость образования Г* определяется соотношением:

.

Зависимость скорости образования Г* при [Fe2+] = 10-3 моль/л, рН = 2, [H2O2] = 10-4 моль/л и [Lum] = 10-4 моль/л от времени за первые 12 секунд с начала реакции представлена на рис. 7 (кривая 1).

Рисунок 7. Скорость образования продукта Г*, моль/(л с), распадающегося с испусканием фотонов.

1 - рН = 2

2 - рН = 12

Сильное уменьшение скорости со временем обусловлено уменьшением концентрации [O2] (см. рис. 4). Из рисунка 7 видно, что за первые 0,7 секунды скорость образования Г* уменьшается больше, чем в 1000 раз. Это связано со скоростью образования супероксидного радикала, которая максимальна в начале реакции. Суммарная концентрация образовавшихся молекул Г* за первые 0,7 секунды составляет 5,15 10-15 моль/л, а за 12 секунд - 5,39 10-15 моль/л. Если высвечивание происходит мгновенно, то, начиная регистрацию через 2 секунды, мы теряем информацию о практически всех испущенных фотонах. Задержка начала регистрации 2 секунды обусловлена временем установки образца в прибор БХЛ-06 и не может быть уменьшена. Качественно такая ситуация подтверждается экспериментально измеренным при рН = 2 световыходом, приведённым на рис. 8. В первые секунды с начала регистрации наблюдается максимальное свечение, которое быстро падает. По всей видимости, такое возрастание свечения - всё, что осталось от мощного всплеска в первую секунду.

Были выполнены измерения свечения для образцов при рН = 2 с люминолом (рис 8, кривая 1), без люминола (2) и с люминолом и синим светофильтром (3). Спектр свечения продукта Г*, образующегося при взаимодействии радикала LOOH и супероксидного ион-радикала, лежит в синей области спектра [3]. Светосумма без люминола - 1,4 мВ (относительные единицы), с люминолом - 3,4 мВ, с люминолом и синим фильтром - 0,63 мВ.

Сравнение светосумм показывает, что люминол увеличивает выход свечения в 2,5 раза, но синий фильтр подавляет излучение люминола почти в 5 раз. Следовательно, основное люминол-зависимое свечение при рН = 2 происходит не в синей области спектра, и механизм образования возбуждённых молекул отличается от рассмотренного в работе [3]. Этим объясняется и малый квантовый выход излучения, порядка 10-10 (см. таблицу 2).

В таблице 2 сравниваются экспериментально полученные значения светосумм при [Fe2+] = 10-3 моль/л и разных концентрациях люминола и перекиси водорода. Из таблицы 2 видно, что при увеличении [H2O2] в 100 раз экспериментальная светосумма увеличивается в 13,8 раза, а концентрация LOOH - в 13,6 раза. Т.е. наблюдается корреляция между светосуммой и расчётной концентрацией LOOH.

Таблица 2. Сравнение экспериментального и расчётного выхода фотонов. [Fe2+] = 10-3 моль/л, [Lum] = 10-5 моль/л, рН = 2

Иная ситуация при рН = 12 (см. рисунок 7, кривая 2), когда образующееся в реакции трёхвалентное железо практически мгновенно выпадает в осадок. В этом случае железо не успевает заметно расходовать супероксидные радикалы, их концентрация сильно не уменьшается, количество продуктов Г*, распадающихся с испусканием фотонов, сильно увеличивается. Измеренный экспериментально световыход в щелочной среде при рН = 12, [Fe2+] = 10-3 моль/л и [H2O2] = 10-4 моль/л увеличивается примерно в 105 раз по сравнению с выходом при рН = 2.

Рисунок 8. Экспериментально измеренный световыход от образца объёмом 1,2 мл, рН = 2. (S, мВ/с, относительные единицы), t - время, секунды. [Fe2+] = 10-3, [H2O2] = 10-4, [Lum] = 10-4 моль/л. 1 - с люминолом; 2 - без люминола; 3 - с люминолом и синим светофильтром.

Ионы железа могут содержаться в самой биологической пробе. Если процессы в образце приводят к образованию перекиси, то реакция Фентона будет осуществляться без дополнительного введения реактивов. Она может сопровождаться свечением, доступным регистрации. С увеличением [Fe2+] скорость реакции Фентона возрастает, и фоновое излучение становится интенсивнее. Введение люминола в этом случае может усилить хемилюминесценцию. Однако с увеличением [Fe2+], и соответственно, концентрации Fe3+ хемилюминесценция люминола уменьшается. Поэтому в данном случае наблюдение хемилюминесценции с люминолом может исказить информацию о соотношении скоростей реакции Фентона в разных образцах.

Время реакции Фентона при [Fe2+] > [H2O2] составляет 6, 60, 600 и 6000 секунд для [Fe2+] = 10-2, 10-3, 10-4 и 10-5 моль/л и не зависит от концентрации перекиси.

Свечение раствора Фентона в кислой и нейтральной среде после введения люминола превышает фоновое свечение, однако основная информация о числе фотонов теряется из-за малой длительности вспышки, которая меньше 1 секунды, если задержка начала регистрации превышает это время.

Ионы трёхвалентного железа подавляют свечение люминола, поэтому люминол не целесообразно применять в случае, когда инициатором свободно-радикальных процессов является железо.

Присутствие в образце железа или других металлов переменной валентности, которые расходуют супероксидные радикалы, может сильно искажать связь свечения после введения люминола с интенсивностью свободно-радикальных процессов. Эта ситуация характерна для биологических образцов, где присутствует кровь.

Литература

гидроперекись фентон свечение реагент

1. Кузмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенников М.К. Применение индуцированной хемилюминесценции для оценки свободно-радикальных реакций в биологических субстратах. / Е.И. Кузмина, А.С. Нелюбин, М.К. Щенников. //Межвузовский сборник биохимии и биофизики микроорганизмов. Горький.-1983. - с. 179-183.

2. Пикаев А.К., Кабакчи С.А. Реакционная способность первичных продуктов радиолиза воды. Справочник. 1982. М.: Энергоатомиздат. С. 201.

3. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. 1989. М.: Высшая школа.

Размещено на Allbest.ru