Свободнорадикальные процессы в крови и слюне больных в развитии и лечении желчнокаменной болезни

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.00.04 - биохимия

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В КРОВИ И СЛЮНЕ БОЛЬНЫХ В РАЗВИТИИ И ЛЕЧЕНИИ ЖЕЛЧНОКАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ

Питерская Елена Анатольевна

Ростов - на - Дону - 2007

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Желчнокаменная болезнь (ЖКБ) - заболевание гепатобилиарной системы, обусловленное нарушением обмена холестерина (cholelithiasis, от греч.chole - желчь и lithos - камень) и / или билирубина, которое характеризуется наличием конкрементов разной этиологии и состава в желчном пузыре и / или желчных протоках с возможным развитием опасных осложнений (Минушкин и др, 1999; Мараховский, 2003).

В настоящее время ЖКБ занимает одно из ведущих мест среди заболеваний органов пищеварения в мире. В России “болезнь благополучия”, как образно назвали ЖКБ, уступает по статистике лишь атеросклерозу, оставив позади язвенную болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки (Майстренко и др., 1999). В Ростовской области, в связи с низким качеством питьевой воды, хронической ЖКБ страдает каждый второй житель. Кроме того, наблюдается прогрессирующая тенденция к возрастанию заболеваемости холециститом, который поражает все более молодые возрастные группы, охватывая даже эмбриональный период (Колпаков, 1993; Дадвани и др., 2000). В связи с этим, изучение механизмов развития, патогенеза, этиологии ЖКБ, а также лечения данного заболевания, которое многие исследователи обозначили как “болезнь века”, “болезнь цивилизации”, является одной из наиболее важных и актуальных проблем в современной медицине, выводящая ее на новый социальный уровень как проблему общественную, требующую дальнейшего изучения

данной патологии (Miquel et al., 1998; Морозов и др., 2001; Петухов, 2003).

ЖКБ - комплексное заболевание, проявляющееся во множестве разнообразных форм, среди которых можно перечислить острую и хроническую, калькулезную и бескаменную, кроме того, известен газовый холецистит, тифозный, ксантогранулематозный и ряд других форм (Шерлок и др., 1999).

В настоящее время все большее внимание уделяется совершенствованию эндовидеохирургических методов лечения ЖКБ, клиническим формам (диспепсическая, стенокардическая и т. д.) проявления этого заболевания, но остается мало изученным вопрос о состоя-нии свободнорадикальных процессов (СРП) и динамики свободнорадикального и пере-кисного окисления при данной патологии. Изучение системы перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы защиты у пациентов с ЖКБ необходимо для углубления сведений о механизмах развития метаболических нарушений при данном виде патологии, а также для коррекции возможных осложнений этого заболевания.

Наиболее признанным эффективным методом лечения ЖКБ на данный момент является малотравматичное оперативное удаление желчного пузыря посредством лапароскопической холецистэктомии (ЛХЭ) (Шуркалин и др., 2001; Григорьев и др., 2002). Кроме того, в последнее время как один из методов в комплексе мероприятий при лечении ЖКБ часто применяется ГБО-терапия.

Цель работы:

Целью настоящей работы явилась оценка уровня свободнорадикального окисления (СРО) и эффективности антиоксидантных систем крови и слюны больных желчнокамен-ной болезнью в процессе развития заболевания и в процессе лечения с применением лапароскопической холецистэктомии на фоне ГБО - терапии, выявление метаболической взаимосвязи между биохимическими показателями крови и слюны.

Задачи исследования:

1. Исследовать уровень свободнорадикальных процессов и интенсивность перекисного окисления липидов в гемолизате, плазме крови и слюне обследуемых больных.

2. Определить уровень суммарной пероксидазной активности в плазме крови и слюне, а также содержание внеэритроцитарного гемоглобина в плазме крови клинической группы.

3. Исследовать состояние антиоксидантной системы по активности супероксиддисмутазы, каталазы, церулоплазмина и содержанию мочевины и мочевой кислоты в гемолизате, плазме крови и слюне больных.

4. Определить уровень эндогенной интоксикации по содержанию молекул средней мас-сы в плазме крови и слюне, развитие гипоксии по содержанию ксантина и молочной кис-лоты в крови обследуемых больных.

Научная новизна работы.

Впервые показано, что развитие хронической неосложнённой желчнокаменной болез-ни в условиях купированного воспалительного процесса сопровождается угнетением свободнорадикального окисления в крови и слюне больных желчнокаменной болезнью.

В регуляции свободнорадикальных процессов при развитии желчнокаменной болезни первостепенное значение имеют ферментативные антиоксиданты плазмы крови (супероксиддисмутаза, каталаза, церулоплазмин) и мочевая кислота, а также каталаза слюны, являющиеся основными компонентами адаптивно-компенсаторных механизмов.

Лечение больных желчнокаменной болезнью в клинике с применением лапароскопической холецистэктомии и гипербарической оксигенации сопровождается интенсификацией свободнорадикального окисления в крови и слюне.

Во время проведения лапароскопической холецистэктомии с использованием карбоксиперитонеума в крови пациентов наблюдается увеличение содержания ксантина, что сви-детельствует о развитии гипоксии, изначально не свойственной для патогенеза заболевания. Выявлены эффекты последействия карбоксиперитонеума, которые могут иметь как антиоксидантный, так и прооксидантный характер.

При лечении больных желчнокаменной болезнью антиоксидантный статус определяется работой каталазы в эритроцитах, церулоплазмина - в плазме крови, высокой активностью супероксиддисмутазы и каталазы в слюне. Низкомолекулярные азотсодержащие антиоксиданты - мочевина и мочевая кислота имеют важное протекторное значение не только при развитии заболевания, но и в процессе стационарного лечения, в слюне и, особенно, в плазме крови больных, учитывая значительное снижение антиоксидантной роли супероксиддисмутазы и каталазы в результате их инактивации в плазме крови.

Обнаружены признаки эндогенной интоксикации в крови и слюне больных желчнокаменной болезнью, как при развитии заболевания, так и на разных этапах лечения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Развитие хронической неосложненной желчнокаменной болезни сопровождается снижением процессов свободнорадикального окисления и активацией адаптивнокомпенсаторных механизмов.

2. В крови и слюне больных желчнокаменной болезнью наблюдается разнонаправлен-ное изменение активности и содержания ферментативных и неферментативных антиоксидантов.

3. Проведение лапароскопической холецистэктомии с использованием карбоксиперитонеума приводит к развитию гипоксического синдрома, изначально не характерного для патогенеза желчнокаменной болезни.

4. ГБО - терапия приводит к активации антиоксидантной системы на фоне умеренной интенсификации процессов перекисного окисления липидов и способствует ускорению нивелирования гипоксического состояния пациентов.

Теоретическая и практическая значимость. В общетеоретическом плане выполненная работа позволяет расширить существующие представления о патогенезе хронической неосложнённой желчнокаменной болезни, сформулировать целостное представление о роли свободнорадикального окисления, ферментативных и неферментативных антиоксидантов в процессе развития заболевания и в чередовании периодов «мнимого благополучия / обострения», а также о роли адаптивно-компенсаторных механизмов. В работе впервые проведена комплексная биохимическая оценка, включающая показатели интенсивности свободнорадикальных процессов и их регуляции, функционального состояния биомембран, развития гипоксии и уровня эндогенной интоксикации в крови и слюне больных желчнокаменной болезнью при пассивном развитии заболевания до лечения, а также при оперативном удалении желчного пузыря в сочетании с сеансами ГБО - терапии в клинике. Угнетение процессов свободнорадикального окисления действием активированной анти-оксидантной системы и компенсаторными механизмами организма при развитии заболевания является результатом крайне медленного бессимптомного прогрессирования желчнокаменной болезни в течение 10-15 лет. Увеличение “ёмкости” антиоксидантной системы, в основном, за счет низкомолекулярных компонентов в процессе лечения больных в клинике способствует сдерживанию свободнорадикального окисления на разных стадиях, снятию гипоксического состояния и восстановлению пациентов в постоперационный период. Наиболее информативными биохимическими показателями развития патологического процесса, характеризующимися простотой и скоростью определения, такие как интенсивность хемилюминесценции, содержание малонового диальдегида, активность и содержание ферментативных (супероксиддисмутазы, каталазы) и неферментативных антиоксидантов (мочевины, мочевой кислоты), уровень суммарной пероксидазной активности, внеэритроцитарного гемоглобина, ксантина и молекул средней массы, могут быть использованы для прогноза развития заболевания и эффективности проводимого лечения. Кроме того, полученные в процессе проведенного исследования данные можно использовать в клинике как для обоснования использования повышенного парциального давления кислорода, так и для оптимизации параметров давления и экспозиции сеансов гипербарической оксигенации, используемых в процессе лечения больных желчнокаменной болезнью.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации доложены на 3-й, 4-й и 5-й межвузовской международной конференции молодых ученых, специалистов, студентов «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов - на - Дону, 2004 - 2006), на 4-й и 5-й национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005, 2007), на 4-й Всероссийской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005), на 6-й Всеармейской научно-практической конференции «Баротерапия в комплексном лечении и реабилитации раненых, больных и пораженных» (Санкт-Петербург, 2006), на 3-й Всероссийской конферен-ции «Актуальные проблемы клинической гипербарической оксигенации» (Москва, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 1 статья. Личный вклад 80 %, 0, 67 п. л.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики обследуемых больных и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 21 таблицу и иллюстрирована 12 рисунками. Список использованной литературы включает 311 наименований, в том числе 91 зарубежный источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

желчнокаменный лапароскопический холецистэктомия слюна

Для решения поставленных задач нами были обследованы 27 мужчин и женщин в возрасте от 45 до 65 лет с диагнозом хронический калькулёзный холецистит (в неосложнённой форме, без признаков обтурации, воспаления и обострения заболевания, продолжительность болезни - 10-15 лет), направленных на хирургическое удаление желчного пузыря посредством ЛХЭ с применением карбоксиперитонеума и прохождение сеансов ГБО - терапии.

В барокамере «БЛКС - 03» создавали давление 0, 15 МПа О₂ во время первого сеанса и 0, 17 МПа О₂ - во время второго и третьего сеансов гипербарической оксигенации, экспозиция 45 минут. 1-й сеанс оксигенобаротерапии проводили до операции, 2-й и 3-й сеансы - после оперативного вмешательства. 2-й сеанс проводили спустя один день, 3-й - два дня после лапароскопической холецистэктомии.

Забор крови у пациентов проводили утром натощак путём пункции локтевой вены при поступлении больных в клинику, а также после каждого сеанса гипербарической оксигенации. Забор слюны также проводили натощак до приёма пищи, предварительно предложив прополоскать ротовую полость физиологическим раствором, при поступлении в клинику, а также до и после сеансов ГБО. В качестве контроля использовали кровь и слюну практически здоровых людей-доноров в возрасте от 24 до 50 лет (n=15). Забор крови и слюны для последующего определения биохимических показателей проводили согласно представленным в таблице этапам исследования, которые соответствуют общепринятой схеме лечения обследуемого контингента больных.

Таблица 1. Последовательность этапов исследования больных желчнокаменной болезнью

В процессе исследования определяли уровень свободнорадикальных процессов (СРП) по интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) в системе Н₂О₂ - люминол (Шестаков и др., 1979). Определяли интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по содержанию его молекулярных продуктов - диеновых конъюгатов (ДК) (Стальная, 1977), малонового диальдегида (МДА) (Стальная и др, 1977) и шиффовых оснований (ШО) (Bidlack et al., 1973). Для расчётов количества общих липидов (в хлороформном экстракте, который по-лучали по методу Вligh et al., 1959) использовали стандартный клинический набор реактивов производства «La Chema» (Колб и др., 1982), для гемоглобина в гемолизате эритроцитов - «КлиниТест-Гем» (Меньшиков, 1987). О состоянии системы антиоксидантной защиты судили по активности ферментативных антиоксидантов: супероксиддисмутазы (СОД) (Сирота, 1999) (в плазме крови - супероксидустраняющей активности (СУА) (Гуляева и др., 1988)), каталазы (Королюк и др. 1988) и церулоплазмина (ЦП) (Камышников, 2000). Содержание низкомолекулярных неферментативных антиоксидантов мочевины и мочевой кислоты - с помощью стандартного клинического набора реактивов производства «Эко-Сервис», «КлиниТест - Мочевина 200» (Камышников, 2000). Исследовали суммарную пероксидазную активность (СПА) (Покровский, 1969), а также содержание внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) (Меньшиков, 1987). Определяли показатели эндогенной интоксикации по содержанию молекул средней массы (МСМ) в трех фракциях (л = 210 нм, 254 нм, 280 нм) (Камышников, 2000). Об уровне гипоксии судили по содержанию ксантина (ми-крометод Williams J. M. (1950) в модификации Погореловой и соавт., 1983) и молочной кислоты (Меньшиков и др., 1987).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили согласно общепринятым методам. Сравнительную оценку полученных результатов проводили с использованием t - критерия Стьюдента для малых выборок, оценивая резко отклоняющиеся варианты по критерию Шовене. Дополнительно рассчитывали коэффициент корреляции (r) между исследуемыми показателями в крови и слюне больных ЖКБ. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие р < 0, 05 (Лакин, 1980; Владимирский, 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Свободнорадикальные процессы и их регуляция в крови и слюне больных желчнокаменной болезнью

Интенсивность хемилюминесценции исследовали по пяти взаимосвязанным показателям (в относительных единицах), каждый из которых характеризует определенную стадию свободнорадикального окисления: 1) «спонтанный свет» - спонтанная светимость биопробы; 2) «амплитуда быстрой вспышки» (h) - пиковая интенсивность свечения биопробы, получаемая непосредственно после введения инициирующей жидкости (Н₂О₂); 3) «высота медленной вспышки» (H) - максимально возможная интенсивность перекисного окисле- ния липидов после введения Н₂О₂; 4) «светосумма медленной вспышки» (Sm) - количество перекисных радикалов RO₂*, образовавшихся на одну молекулу Н₂О₂; 5) «скорость окисления липидов» (Tg) - скорость нарастания интенсивности свечения биопробы. Интенсивность хемилюминесценции в плазме крови больных ЖКБ уменьшается относительно до-норов по всем пяти показателям от 40% до 60% (рис. 1).

Примечание: на рис. 1-16 представлены только достоверные отличия (р<0, 05).

Угнетение генерации активных форм кислорода (АФК) у больных ЖКБ вероятнее всего обусловлено компенсаторно-приспособительными реакциями организма на прогрессирующий воспалительный процесс, носящий периодический характер в сложном патогенезе данной патологии (Мараховский, 2003; Антонян, 2003). Нивелирование процесса воспаления, обязательное при поступлении больных в стационар, может обуславливать снижение интенсивности ХЛ.

Снижение концентрации ВЭГ на 54% в плазме крови обследуемых (рис. 2) - интегрального показателя состояния мембран эритроцитов и наличия потенциальных железосодержащих прооксидантов ниже уровня данного показателя у здоровых людей - свидетельствует об активации специальных механизмов, препятствующих усилению гемолиза эритроцитов в условиях развития хронической ЖКБ (например, активация специфических гидролаз, таких, как катепсин Д, использующих ВЭГ в качестве своего субстрата (Внуков, 1979)).

Важным этапом СРО является цепной процесс свободнорадикального ПОЛ (Меньщикова и др., 2006). Концентрация ДК в гемолизате клинической группы ниже таковых значений у здоровых людей на 66%, МДА и ШО на 32% в обоих случаях (рис. 2). В плазме крови обследуемых снижение уровня ДК составляет 28%, ШО - 73%, МДА увеличивается на 43% относительно доноров (рис. 2). Снижение концентрации молекулярных продуктов ПОЛ в крови обследуемых является закономерным следствием угнетения генерации АФК (рис. 1) и, по нашему мнению, вполне соответствует патогенезу хронического калькулёзного холецистита в условиях купированного воспалительного процесса. Снижение уровня МДА в гемолизате больных ЖКБ при его увеличении в плазме крови может быть обусловлено тем, что в эритроцитах процессы протекают более специфично по сравнению с другими тканями в связи с большой скоростью обновления этих клеток (Милютина и др., 2005), а также высоким индексом литогенности, характеризующимся повышенным содержанием холестерина в крови данной категории больных. В этих условиях гепатоциты могут секретировать в кровяное русло липопротеиды очень низкой плотности (ЛПОНП), включающие в себя окисленные ЛПНП, которые подвергаются окислительной деструкции с образованием МДА (Серов и др., 1995).

Угнетение генерации АФК (рис. 1) может приводить к изменению процессов регуляции СРО и, как следствие, снижению активности СОД на 19% и каталазы на 24% в эритроцитах клинической группы относительно контроля (рис.3). Возникающий дисбаланс АОС в гемолизате больных ЖКБ, возможно, является результатом недостаточности синтеза СОД и каталазы - основных ферментативных антиоксидантов, максимальная активность которых наблюдается именно в эритроцитах (Kirkman et al., 1999), что говорит о высокой чувствительности белковых молекул к метаболическим изменениям, происходящим в организме при развитии ЖКБ. В плазме крови исследуемого контингента, напротив, уровень СУА, активность каталазы и ЦП оказались выше активности данных ферментов в плазме крови практически здоровых людей на 171%, 53% и 28%, соответственно (рис.3).

Активизацию системы антиоксидантной защиты в плазме крови исследуемых больных можно рассматривать как состояние ее “напряжения”, которое может быть связано с компенсаторными механизмами избыточного синтеза ферментативных антиоксидантов (Сазонтова, 2006) в клетках органов гепатобилиарной системы, вызванных накоплением в плазме крови данных пациентов промежуточных продуктов ПОЛ.

В литературе хорошо описано участие антиоксидантных ферментов в регуляции ПОЛ и их функционально-метаболическая взаимосвязь (Меньщикова и др., 2006). Кроме того, показана возможность интенсификации ПОЛ и активации антиоксидантных ферментов при разных состояниях организма, к которым можно отнести и развитие патологии (Дубинина, 1993; Banerjee et al., 1999). Система антиоксидантной защиты (АОЗ) имеет поликомпонентную сложную и многоступенчатую иерархию, которую хорошо дополняют азотсодержащие антиоксиданты - мочевина и мочевая кислота. Уровень мочевины в плазме крови больных ЖКБ снижается на 37%, мочевой кислоты увеличивается на 31% относительно доноров (рис. 3). Можно предположить существование процессов, которые при данных обстоятельствах приводят к уменьшению содержания мочевины или возможному её увеличению при интенсификации СРО, например, в условиях обострения заболевания. Увеличение уровня антиоксидантов в плазме крови обследуемых по сравнению с контролем (рис.3) в условиях угнетения генерации АФК (рис.1) и уменьшения содержания ДК и ШО может служить косвенным доказательством чередования процессов взаимного усиления и ингибирования СРО и АОЗ: воспаление>активизация СРО>гипергенерация АКМ-ин-дуцирующих агентов и АФК > интенсификация ПОЛ > цитопатогенное действие свободнорадикальных продуктов на организм больного > активация антиоксидантов > снижение концентрации АФК, ингибирование ПОЛ и воспаления > снижение уровня АОЗ и устранение избытка антиоксидантов в течение нескольких дней при отсутствии новых сигналов пускового механизма гиперсекреции кислородных интермедиатов.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Анализ уровня МСМ показывает, что при развитии ЖКБ наблюдаются признаки эндогенной интоксикации, проявляющиеся в усилении окислительной модификации белковых молекул, преимущественно включающих в свой состав ароматические аминокислоты и, возможно, приобретающих свойства “токсинов”, большой вклад в которую вносит нарушение микрофлоры кишечника больных ЖКБ, характерное для данной патологии: содержание МСМ_280нм увеличивается на 105% на фоне снижения МСМ_210нм на 47% относительно контроля (рис. 4). Данные патологически модифицированные соединения могут оказывать цитотоксическое и нейротоксическое действие, участвуя в развитии иммунодепрессии, усилении ПОЛ и повреждении биомембран, ингибировании активности ферментов и ряда процессов (тканевое дыхание, биосинтез белка, эритропоэз и т.д.) приводя к развитию гипоксии тканей, нарушению гуморальной и нервной регуляции (Малахова, 2000; Добротина и др., 2004).

Анализ полученных нами данных по ксантину и молочной кислоте, уровень которых в крови обследуемых снижается на 25% и 22%, соответственно, относительно уровня таковых у доноров (рис. 4), показал, что при хроническом калькулёзном холецистите на фоне купированного хронического воспаления гипоксии не обнаружено.

В настоящее время все большее значение приобретает необходимость разработки новых неинвазивных и безопасных методов оперативного контроля за состоянием пациентов. В связи с этим особый интерес в качестве биологического материала привлекает слюна, имеющая сложный и многокомпонентный биохимический состав. Cуществуют данные о тесной метаболической взаимосвязи между кровью и слюной по большинству биохимических показателей при действии экстремальных факторов среды или развитии патологических процессов.

В слюне больных ЖКБ, так же как и в плазме крови, наблюдали снижение интенсивности всех показателей хемилюминесценции от 42% до 90% по сравнению с таковыми у до-норов (рис. 1), что свидетельствует о снижении процессов СРО. Также однонаправленность полученных изменений в крови и слюне больных ЖКБ наблюдается и по уменьшению содержания молекулярных продуктов ПОЛ: ДК на 78%, МДА на 48% и ШО на 80% относительно доноров (рис. 2), что подчёркивает снижение СРО на всех его этапах.

Высокий уровень СПА (128%) относительно контроля (рис. 2), сохраняющийся даже в периоды “мнимого благополучия” при нивелировании воспалительного процесса, может являться компонентом хронического “следа” и компенсаторной реакции организма на длительно протекающую рецидивирующую ЖКБ, что подтверждает наше предположение о беспрерывно текущих патологических процессах в организме обследуемых больных, даже при отсутствии клинических признаков обострения заболевания, интенсивность прогрессирования которых зависит от степени выраженности ЖКБ и сопутствующих ей патологий, под “маской” которых часто развивается данное заболевание (панкреатит, сахарный диабет, гепатит, цирроз печени, мочекаменная болезнь, патологии щитовидной железы и т.д.).

Основной вклад в реализацию антиоксидантной защиты в слюне больных ЖКБ вносит каталаза, активность которой увеличивается на 124% по сравнению с контролем. Активность ЦП и содержание мочевой кислоты в слюне обследуемых снижается на 46% и 33%, соответственно (рис. 3). Сохранение высокой активности каталазы - важного интегрального показателя в плазме крови и в слюне больных ЖКБ - позволяет выделить данный фермент среди определяемых нами антиоксидантов как наиболее чувствительный и эффективный по отношению к слабовыраженным, но постоянно текущим патологическим процессам. С другой стороны, для плазмы крови и для слюны правильнее говорить не об истиной каталазной активности, а о скорости процессов образования и утилизации Н₂О₂, в которых помимо каталазы принимают участие множество других компонентов.

Исследование уровня МСМ в слюне больных ЖКБ относительно таковых показателей у доноров показало уменьшение модифицированных соединений пептидной природы МСМ_210нм на 38% и МСМ_280нм на 51% (рис. 4), на основании которых можно судить о снижении токсичности патологически изменённых метаболитов в слюне клинической группы. Снижение содержания МСМ_280нм в слюне и МСМ_210нм в слюне и плазме крови больных желчнокаменной болезнью указывает на отсутствие у данной категории больных проявлений острой формы эндогенной интоксикации, что, скорее всего, обусловлено физиологически нормальной работой механизмов связывания и элиминации “модифицированных метаболитов” через кишечник и почки.

Таким образом, развитие хронической длительно протекающей желчнокаменной болезни сопровождается угнетением процессов свободнорадикального окисления, что вероятно связано со спецификой патогенеза заболевания и действием активированной антиоксидантной системы в плазме крови, а в слюне больных желчнокаменной болезнью только активацией каталазы. Данные факторы создают оптимальные условия для медленного пассивного прогрессирования данной патологии. В плазме крови больных ЖКБ обнаружены признаки эндогенной интоксикации, по всей видимости, обусловленные развитием синдрома нарушенного пищеварения и дисбаланса микробной экологии толстой кишки, сопровождающиеся накоплением специфических бактериальных эндотоксинов.

Свободнорадикальные процессы и их регуляция в крови и слюне больных желчнокаменной болезнью в процессе лечения

Сравнение интенсивности хемилюминесценции в плазме крови больных ЖКБ на разных этапах лечебных мероприятий с показателями нулевой точки выявило снижение интенсивности «h» от 23% до 32%, «H» - на 43%-55%, «Tgб» - на 42%-44% (рис. 5).

Исключение составила «Sm», увеличение которой было зарегистрировано после ЛХЭ на 43% по сравнению с фоновым значением и снижение после 2 и 3 сеансов ГБО на 45% и 35%, соответственно (рис. 5). Вероятно, применение ГБО - терапии с учётом сложного патогенеза ЖКБ приводит к активации адаптивно - компенсаторных механизмов в организме данной клинической группы, которые удерживают процессы генерации АФК на уровне ниже контрольного. Большое влияние на увеличение Sm могли оказать ряд факторов, действующих во время проведения операции (наркоз, операционный стресс и травма, рСО₂ и др.), среди которых особое место занимает карбоксиперитонеум, способный вызвать развитие гипоксии и как следствие увеличение светосуммы.

Гипоксия и другие перечисленные факторы могут способствовать усилению гемолиза эритроцитов с последующим выходом гемоглобина, о чем свидетельствует увеличение в плазме крови больных ЖКБ уровня маркеров окислительного стресса, являющихся интегральными показателями состояния мембран эритроцитов: ВЭГ- после проведения операции на 34% и СПА - во время и после ЛХЭ на 54% и 67%, соответственно (рис. 7).

После 1 и 3 сеансов ГБО уровень СПА снижается на 28% и 31%, соответственно (рис. 7), что свидетельствует о сглаживании цитотоксических эффектов комплексного действия факторов (гипоксия, операционный стресс т. д.) применением ППДК.

С другой стороны, ГБО способствует умеренной интенсификации процессов ПОЛ, модифицирующих липидный бислой мембран и тем самым, возможно, запускающих генетические механизмы адаптации к ППДК. После 1 сеанса ГБО наблюдается увеличение концентрации ДК в эритроцитах больных ЖКБ на разных этапах лечения на 192 -144%, в плазме крови от 36% до 52% относительно фоновых значений (рис. 8). В процессе лечебного курса содержание ТБК-активных продуктов в плазме крови больных желчнокаменной болезнью снижается от 18% до 25% (рис. 9) относительно значений нулевой точки на фоне накопления остальных продуктов перекисного окисления липидов (рис. 8, 10).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Данная динамика наблюдается в плазме крови как до лечения обследуемых больных (рис. 2), так и сохраняется в процессе лечебных мероприятий (рис. 9).

Подобные изменения, вероятнее всего, обусловлены действием ряда защитных механизмов в плазме крови больных ЖКБ, среди которых можно назвать высокий уровень низкомолекулярных антиоксидантов (рис. 13-14) и повышенную активность церулоплазмина (рис. 12). Снижению концентрации ТБК-активных продуктов может способствовать регуляторно - метаболическое влияние нейрогуморального эффекта гипербарической оксигенации, осуществляемого через регуляцию гормональнозависимых циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ), которые, активируя или ингибируя внутриклеточные протеинкиназы, регулируют реакционную способность клеточных белков (Демуров и др., 2007).

Содержание ШО увеличивается в гемолизате больных ЖКБ после лапароскопической холецистэктомии и 2 сеанса ГБО на 61% и 30%, соответственно, и снижается после 3 се-анса на 28% относительно фоновых значений (рис. 10), что свидетельствует о том, что процессы перекисного окисления липидов идут не до конца и наблюдается лишь незначительная интенсификация первого этапа данного цепного свободнорадикального процесса. Аналогичная динамика прослеживается в плазме крови обследуемых - увеличение концентрации ШО после ЛХЭ и 2 сеанса ГБО составляет 60% и 41%, снижение после 1 сеанса - на 30% и после 3 сеанса - на 34% относительно нулевой точки (рис. 10).

После ЛХЭ и 2 сеанса ГБО в гемолизате больных ЖКБ наблюдается инактивация СОД на 28% и 27%, и увеличение её активности после 3 сеанса на 29% относительно фоновых значений (рис. 11). Инактивация СОД в гемолизате больных ЖКБ, скорее всего, обусловлена дестабилизацией мембран эритроцитов после лапароскопической холецистэктомии и выходом данного внутриклеточного фермента в плазму крови, где он довольно быстро теряет свою активность.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

В плазме крови работает целый комплекс компонентов, утилизирующих О₂-^* и объединяемых в СУА (Гуляева и др., 1988), уровень которой снижается после ЛХЭ на 32% и после 3 сеанса ГБО на 30% (рис. 11), что может быть связано с окислительной модификацией компонентов этого комплекса продуктами ПОЛ.

Активность каталазы в гемолизате клинической группы увеличивается после 1 сеанса ГБО на 32%, а также во время и после ЛХЭ на 62% и 38% соответственно относительно фоновых значений (рис. 12). В плазме крови правильнее говорить не об активности данного внутриклеточного фермента, а о скорости разложения Н₂О₂ соединениями, использующими её в качестве своего субстрата. Снижение Н₂О₂ наблюдается на разных этапах лечения от 19% до 30% относительно нулевой точки (рис. 12), что может быть связано со свободнорадикальными эффектами продуктов ПОЛ. В результате происходит накопление перекиси, которая обладает рядом патологических эффектов.

Увеличение активности медьсодержащего белка церулоплазмина в плазме крови больных ЖКБ наблюдается после лапароскопической холецистэктомии на 34% относительно фоновых значений (рис 12). Церулоплазмин, обладая рядом активностей, в том числе и СОД-подобной, в некоторой степени компенсирует инактивацию СОД в крови пациентов.

Как показывают наши данные, защитный потенциал АОС многократно усиливается и выгодно дополняется эффективным антиоксидантным действием в плазме крови больных ЖКБ низкомолекулярных азотсодержащих соединений - мочевины и мочевой кислоты. Содержание мочевины увеличивается в плазме крови обследуемых на разных этапах лечения от 30% до 47%, за исключением 3 сеанса ГБО, когда её уровень снижается на 29% относительно фоновых значений (рис. 13). Максимальный уровень мочевины в плазме крови клинической группы соответствует наибольшей интенсификации ПОЛ, которая наблюдается во время проведения лапароскопической холецистэктомии.

Содержание мочевой кислоты в плазме крови больных ЖКБ также увеличивается на разных этапах лечения от 19% до её максимального значения - 89% после 2 сеанса ГБО относительно нулевой точки (рис. 14). Известно, что действие кислорода под давлением приводит к усилению протеолиза белков, являющихся одной из причин увеличения содержания мочевины и мочевой кислоты как конечных продуктов азотистого метаболизма, которые согласно «концепции протекторного катаболизма» способны ингибировать свободнорадикальное окисление по принципу обратной связи (Кения и др., 1993). Можно предположить, что под действием ППДК, а также рСО₂ во время лапароскопической холецистэктомии в плазме крови больных ЖКБ происходит увеличение “ёмкости” АОС в основном за счет таких низкомолекулярных участников как мочевина и мочевая кислота, т.к. концентрация этих антиоксидантов в плазме крови обследуемых увеличивается по сравнению с фоновыми значениями на протяжении практически всех этапов лечения.

Размещено на http://www.allbest.ru/

В плазме крови больных ЖКБ наблюдали увеличение содержания МСМ_210нм после 1 сеанса ГБО на 40%, после ЛХЭ и 3 сеанса ГБО - снижение на 33% и 45%, соответственно, относительно фоновых значений (рис. 15), возможно обусловленных терапевтическими эффектами ГБО. Повышение уровня МСМ_254нм и МСМ_280нм в плазме крови пациентов по сравнению с показателями нулевой точки наблюдается только после 3 сеанса ГБО на 310% и 23% (рис. 15), что, скорее всего, связано с усилением окислительных повреждений структур биомолекул, в результате которых увеличивается концентрация соединений с измененными свойствами.

Увеличение концентрации ксантина в крови больных ЖКБ во время проведения ЛХЭ на 24% (рис. 15) относительно фоновых значений свидетельствует о развитии гипоксии, главной причиной которой на наш взгляд, является использование карбоксиперитонеума. При этом повышается вероятность нарушения выведения из организма СО₂, и к гипоксии, вероятно, по всей видимости, может присоединиться гиперкапния (Логинов, 2001). Высокий уровень ксантина, возможно, связан с активацией ксантиноксидазы, которая, как мы предполагаем, принимает непосредственное участие в механизмах реализации гипоксии и является мощным радикалообразующим ферментом (Внуков и др., 2005).

На протяжении всего курса лечения в слюне больных желчнокаменной болезнью, также как и в плазме крови наблюдается снижение интенсивности всех показателей хемилюминесценции относительно фоновых значений: «h» 30 - 32%, «H» 77 - 87%, «Sm» 46 - 48%, «Tg» 66 - 81% (рис. 6). Угнетение генерации активных форм кислорода, вероятнее всего, связано с эффективной работой по обезвреживанию кислородных интермедиатов и ингибированию перекисного окисления липидов различными компонентами антиоксидантной системы слюны клинической группы.

Протекание СРП поддерживается наличием в слюне высокого содержания субстратов СРО, а также свободных радикалов (R*), которые образуются в процессе антибактериальной защиты и ферментативным путем в пероксидазных реакциях (Нагорная, 2005), основной вклад в которые в слюне вносит миелопероксидаза (Внуков и др., 2003). Уровень СПА в слюне больных ЖКБ увеличивается в течение практически всех этапов лечения: после 1 и до 2 сеансов ГБО - на 88% и 101%, после 2 и 3 сеансов - на 106% и 79%, соответственно, относительно значений нулевой точки (рис. 7). Подобные изменения являются, по нашему мнению, компенсаторным ответом организма на проводимые операцию и ГБО - терапию, а не следствием резко активизировавшихся патологических процессов.

Несмотря на угнетение начальных этапов СРО, в слюне клинической группы наблюдается умеренная интенсификация ПОЛ гипербарическим кислородом и, возможно, фактора- тми ЛХЭ. Некоторое уменьшение уровня ДК в слюне больных ЖКБ после 1 и до 2 сеанса ГБО на 31% и 45%, что, вероятно, связано с их переходом в МДА, сменяется более значительным их увеличением после 2 и 3 сеансов на 56% и 44% относительно фоновых значений (рис. 8). Уровень ТБК-активных продуктов и ШО в слюне обследуемых увеличивается на всех этапах лечения: содержание МДА увеличивается до сеансов ППДК от 106% до 136%, после их завершения от 45% до 63% (рис. 9), уровень ШО повышается до и после 2 сеанса ГБО на 66% и 79%, после 3 сеанса на 93% (рис. 10), что характеризует интенсивно идущие терминальные стадии свободнорадикального окисления и указывает на достаточно большую продолжительность СРП в слюне больных ЖКБ.

Ферментативные антиоксиданты в слюне больных ЖКБ проявляют высокую активность, особенно после проведения сеансов ППДК, что подчёркивает положительный эффект проводимых лечебных мероприятий. Поскольку в слюне, так же, как и в плазме крови, изоформы СОД отсутствуют, за исключением, возможно, экстрацеллюлярной СОД (Petersen et al., 2004), то определяемая нами активность супероксиддисмутазы является интегральным показателем антирадикальной активности в слюне клинической группы, уровень которой увеличивается до и после 2 сеанса ГБО на 72% и 73%, до и после 3 сеанса на 70% и 83%, соответственно, относительно фоновых значений (рис. 11).

Считается, что внеклеточная роль каталазы незначительна, её происхождение в слюне не совсем понятно, возможен выход данного фермента из клеток при увеличении проницаемости мембран, обусловленной действием ГБО, также определенный вклад в данный процесс вносят многочисленные соединения утилизирующие Н₂О₂. В слюне обследуемых наблюдается ингибирование активности каталазы до сеансов ГБО от 53% до 67%, что, может быть, обусловлено повышенной активностью протеолитических ферментов, а также повреждающим действием высоких концентраций продуктов ПОЛ, и увеличение её активности после гипербарических воздействий от 67% до 71% по сравнению с нулевой точкой (рис. 12).

Максимальное увеличение мочевины на 127% в слюне больных ЖКБ наблюдается после 1 сеанса ГБО, на последующих этапах лечения ее концентрация несколько ниже (67 - 91%), но стабильно высокая относительно фоновых значений (рис. 13). Благодаря избы-точно высокому образованию мочевины в слюне при ЖКБ может реализовываться её защитный эффект от будущей потенциальной инициации ПОЛ, что является важным для данной категории больных учитывая развитие гипоксии, которая, как известно, значительно усиливает перекисное окисление липидов.

Уровень мочевой кислоты в слюне больных ЖКБ повышается только до начала 2 сеанса ГБО на 96% относительно фоновых значений (рис. 14), что, скорее всего, обусловлено не гипероксическим компонентом, а развитием гипоксии во время лапароскопической холецистэктомии, когда активизируется ключевой фермент ее синтеза - ксантиноксидаза. Содержание мочевой кислоты снижается до и после 3 сеанса ППДК на 49% и 45% относительно нулевой точки (рис. 14). Содержание неферментативных антиоксидантов, возможно, определяется не только активностью СРП, но и многими другими биологическими процессами, в частности скоростью их образования в ряде биохимических реакций и скоростью выведения из организма. Итоговое содержание этих соединений может являться результатом наложения ряда процессов, одним из которых является ПОЛ.

Уровень МСМ_210нм в слюне больных ЖКБ увеличивается только до и после 2 сеанса ГБО на 90% и 105% относительно фоновых значений (рис. 16). Во фракции МСМ_254нм слюны обследуемых до 2 сеанса ГБО увеличение составляет 110%, которое снижается до и после 3 сеанса ППДК на 59% и 58%, соответственно, относительно нулевой точки. Накопление молекул средней массы до и после 2 сеанса ГБО может служить доказательством усиления свободнорадикальных эффектов гипоксии под влиянием оксигенобаротерапии. Постепенное нивелирование гипоксического синдрома приводит к нормализации биохимических процессов в организме больных ЖКБ, в том числе и скорости катаболизма накопившихся “модифицированных метаболитов” фракции 254 нм в слюне обследуемых больных и снижению их концентрации относительно нулевой точки.

Одной из главных задач нашего исследования явилось не столько изучение механизмов, происходящих процессов в слюне при развитии ЖКБ, сколько поиск положительной или отрицательной, но статистически достоверной корреляции между параметрами крови и слюны. После проведения 3 сеанса ГБО в крови и слюне пациентов нами была обнаружена корреляция (r = 0, 58044; р < 0, 05) по амплитуде быстрой вспышки (h), характеризующей интенсивность хемилюминесценции. Кроме того, была обнаружена кореляция по со-держанию в крови и слюне пациентов молекулярных продуктов ПОЛ: МДА - после 3 сеанса (r = 0, 52148; р < 0, 05), ШО - после 2 сеанса ГБО (r = 0, 86772; р < 0, 01).

Таким образом, при стационарном лечении с применением лапароскопической холецистэктомии и оксигенобаротерапии, в крови и слюне больных желчнокаменной болезнью наблюдается активация процессов свободнорадикального окисления, максимально интенсифицирующихся во время операции. Применение гипербарической оксигенации является эффективным способом увеличения активности и содержания, а также “ёмкости” антиоксидантной системы в ответ на умеренную интенсификацию перекисного окисления липидов. Во время лапароскопической холецистэктомии, проводимой с использованием карбоксиперитонеума, наблюдается развитие гипоксического синдрома, в устранении которого основную роль, как мы считаем, могут выполнять низкомолекулярные азотсодержащие антиоксиданты - мочевина и мочевая кислота.

Желчнокаменная болезнь - сложная патология, имеющая множество проявлений, которые значительно затрудняют раннюю диагностику данного заболевания и его своевременное лечение. В свободнорадикальном отношении развитие желчнокаменной болезни довольно своеобразно. Как показывают результаты проведённого исследования по большинству биохимических и биофизических показателей наблюдается весьма специфичный ответ со стороны свободнорадикальных процессов и их регуляции, не свойственный развитию других патологий, о чём свидетельствует, в первую очередь, как уже неоднократно указывалось выше, ингибирование свободнорадикального окисления. Результаты исследования позволяют с новой точки зрения рассматривать патогенез хронической желчнокаменной болезни, сформулировать целостное представление о роли свободнорадикального окисления, ферментативных и неферментативных антиоксидантов, а также о системе адаптивно-компенсаторных механизмов в процессе развития заболевания и стационарного лечения. Полученные в работе данные важны как для обоснования применения повышенного парциального давления кислорода, так и для оптимизации давлений и экспозиций сеансов гипербарической оксигенации, используемых в процессе лечения больных желчнокаменной болезнью.

ВЫВОДЫ

1. В работе сформулировано целостное представление о роли свободнорадикального окисления, ферментативных и неферментативных антиоксидантов в процессе развития заболевания.

2. Длительное развитие хронической неосложненной желчнокаменной болезни при купированном воспалительном процессе приводит к угнетению в крови и слюне больных желчнокаменной болезнью свободнорадикального окисления на фоне снижения генерации активных форм кислорода и интенсивности перекисного окисления липидов. Содержание МДА в плазме крови обследуемых, напротив, увеличивается, почти в 1, 5 раза.

3. У больных желчнокаменной болезнью наблюдали угнетение активности исследуемых антиоксидантных ферментов в гемолизате, увеличение их активности и содержания мочевой кислоты (в 1, 5 - 2 раза) в плазме крови. В слюне антиоксидантная защита обеспечивается, главным образом, за счет увеличения активности каталазы.

4. При развитии желчнокаменной болезни в плазме крови обследуемых больных относительно контроля наблюдали увеличение содержания соединений пептидной природы (МСМ_{280 нм} в 2 раза), что связано с развитием эндогенной интоксикации. В процессе лечебных мероприятий (три сеанса ГБО и лапароскопическая холецистэктомия) в крови и слюне больных желчнокаменной болезнью наблюдается повышение уровня МСМ пептидной (МСМ_{210, 280 нм}) и непептидной (МСМ_{254 нм}) природы в 1, 5 - 2 раза.

5. После операции в процессе проводимых лечебных мероприятий в плазме крови больных ЖКБ наблюдали усиление генерации активных форм кислорода и умеренную интенсификацию ПОЛ в крови и слюне, за исключением МДА в плазме крови.

6. Увеличение содержания ВЭГ и СПА в плазме крови больных ЖКБ во время и после ЛХЭ ~ в 1, 5 раза свидетельствует о дестабилизации мембран форменных элементов крови.

7. При лечении больных ЖКБ первая линия антиоксидантной защиты в эритроцитах обеспечивается, в основном, работой каталазы, в плазме крови - церулоплазмина и неферментативными антиоксидантами, в слюне - высокой активностью супероксиддисмутазы и каталазы, а также увеличением содержания мочевины и мочевой кислоты.

8. При лапароскопической холецистэктомии, проводимой с использованием карбоксиперитонеума, у больных желчнокаменной болезнью развивается гипоксия, изначально не характерная для патогенеза данного заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Питерская Е. А., Внуков В. В. Свободнорадикальные процессы в крови и слюне больных желчнокаменной болезнью // Известия Высших учебных заведений Северо-Кавказский регион. Естественные науки.- Ростов-на-Дону, 2007. - № 4. - С. 88-92.- 0, 16 п.л., - личный вклад 50%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Жиронкина (Питерская) Е. А. Свободнорадикальные процессы в крови больных желчнокаменной болезнью при ГБО-терапии // В сб. тр. III межвузовской межд. конф. молодых ученых, специалистов и студентов «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, 2004. - С. 37-38. - 0, 04 п.л., - личный вклад 100 %.

2. Жиронкина (Питерская) Е. А., Буриков М. А. Интенсивность процессов ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов в крови больных желчнокаменной болезнью при ГБО-терапии // В сб. тр. IV межвузовской межд. конференции «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, 2005. - С. 85-86. - 0, 04 п.л., - личный вклад 80 %.

3. Внуков В. В., Жиронкина (Питерская) Е. А. Механизмы развития гипоксии у больных желчнокаменной болезнью // В мат. IV Российской конф. с межд. участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». - М., 2005. - С. 23. - 0, 02 п.л., - личный вклад 50 %.

4. Жиронкина (Питерская) Е. А. Активность антиоксидантных ферментов в слюне больных желчнокаменной болезнью при ГБО-терапии // В сб. тр. асп. и соискателей Ростовского государственного университета. - Ростов-на-Дону: Издательство Рост. ун-та, 2005. - Т. XI. - С. 66-67. - 0, 08 п.л., - личный вклад 100 %

5. Внуков В. В., Жиронкина (Питерская) Е. А. Свободнорадикальные процессы в крови больных желчнокаменной болезнью после холецистэктомии и последующей ГБО-терапии // В мат. IV Нац. научно-практ. конф. с межд. участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». - Смоленск, 2005. - С. 171-172. - 0, 04 п.л., - личный вклад 50 %.