Протеин sp-2 из шрота сои, изучение его противоопухолевой активности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Протеин sp-2 из шрота сои, изучение его противоопухолевой активности

Общая характеристика диссертации

Актуальность работы. За последние 100 лет по уровню заболеваемости и смертности онкопатология переместилась с десятого места на второе, уступая лишь болезням сердечно-сосудистой системы. По данным ВОЗ, каждый год вновь заболевают 10 млн. человек. Специалисты полагают, что если в ближайшие 15-20 лет не будет разработана эффективная профилактика, то количество заболевших раком возрастет до 20 млн, а число смертей - до 12 млн в год.

Помимо трех основных методов терапии рака - хирургии, химиотерапии и радиотерапии - в арсенале клиницистов появился четвертый - биотерапия. Биотерапия опухолей - это лечение злокачественных новообразований препаратами биологического происхождения. Формируется новое направление, основанное на повышении резервных возможностей организма с помощью нетоксичных природных препаратов [Вершинина С.Ф. и др., 2003, Безбородова О.А. и др., 2004, Семенов А.Л. и др., 2009].

В настоящее время в мире проводится большое количество исследований по изучению влияния сои и её компонентов на течение канцерогенеза [Крутяков В.М., 2001, Немцова Е.Р. и др., 2002]. Проводимые исследования показывают, что компоненты сои способны ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, индуцировать апоптоз в трансформированных клетках, и действуют они на опухолевые клетки, и токсические эффекты в отношении нормальных тканей организма минимальны [Залеток С.П. и др., 2006, Казачкина Н.И. и др., 2006].

Лечение онкологических больных в сравнении с другими заболеваниями необычайно дорогостоящее. Поэтому даже в экономически развитых странах постоянно думают о рациональном расходовании средств и удешевлении медицинских процедур и медицинских препаратов.

В связи с этим представляется актуальным выделение белковых компонентов из вторичного сырья - шрота сои и исследование их противоопухолевой активности.

Степень изученности проблемы. Лечебные свойства продуктов из соевых бобов хорошо известны в течение длительного времени. Еще в 30-е годы соевое молоко рекомендовалось при гастроинтестинальных язвах, истощении, холецистите, циррозе печени, гипертензии, отеках, лихорадочных состояниях, сердечно-сосудистых заболеваниях [Гапонова Л.В. и др. 1999, Модич Е., Модич П. 1999].

Исследования последних лет показали, что связанные с соевым белком изофлавоны - генестеин, диадзеин и глицитеин обладают антиканцерогенным профилактическим и в некоторых случаях лечебным эффектом [Zhou J.-R. et al., 1998, Zhou J.-R. et al., 1999, Constantinou A.I. et al., 2001]. Считается, что генистеин, один из основных изофлавонов сои, оказывает блокирующее действие на развитие опухолевых процессов [Cassidy A. et al., 2006]. Эпидемиологические исследования доказывают, что в восточных регионах, где люди традиционно употребляют в пищу сою, реже встречаются опухоли различных локализаций: толстой кишки, легких, матки, молочной железы, предстательной железы и т.д. [Rose D.P. et al., 1986, Messina M.J. et al., 1991].

Уникальность соевых фитоэстрогенов в том, что они помогают восстанавливать гормональное равновесие в организме [Scambia G. et al., 2000, Morton M.S. et al., 2002, Gallo D. et al., 2006]. Изофлавоны сои благодаря гормоноподобным эффектам могут оказывать лечебный эффект у женщин в период менопаузы. Применение соевых рационов позволяет справиться со многими проблемами, сопутствующими наступление климактерического периода, облегчает течение климакса, предупреждает развитие рака молочной железы и матки.

В настоящее время интенсивно изучаются белковые ингибиторы протеаз, которые замедляют инвазию и метастазирование в отношении злокачественной опухоли [Крутяков В.М., 2001]. Среди различных ингибиторов протеаз наиболее перспективным для медицины представляется самый низкомолекулярный ингибитор протеаз Баумана-Бирка с молекулярной массой 8 кДа [Birk Y., 1985].

Настоящая работа посвящена исследованию действия белковых компонентов, выделенных из шрота сои на канцерогенез в условиях in vitro и in vivo.

Связь диссертационной работы с тематическими планами НИР. Работа является частью исследований выполненных в рамках проекта УНТЦ №3501 «Исследование соевого белка в лечении злокачественных новообразований клетки организма», проводимых в Институте биоорганической химии АН РУз (2006-2009 гг.).

Цель исследования. Получение белкового комплекса протеина sp-2 из шрота сои, исследование его физико-химических характеристик и противораковой активности на штаммах АКАТОЛ, Меланома В-16 и раке молочной железы.

Задачи исследования.

· Получение белкового комплекса протеина sp-2 из шрота сои.

· Определение физических и химических характеристик протеина sp-2.

· Тестирование протеина sp-2 на пролиферацию клеток меланомы мышей КМЛ в цитотоксическом тесте радиометрическим методом по включению ¹⁴С-тимидина в экспериментах in vitro.

· Определение антитрипсиновой активности протеина sp-2.

· Определение чувствительности различных штаммов раковых опухолей к протеину sp-2 на животных опухоленосителях в экспериментах in vivo.

· Исследование экспрессии онкогенов до и после введения протеина sp-2 экспериментальным животным.

· Определение цитотоксической активности протеина sp-2 в клетках злокачественных новообразований человека.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования является белковый комплекс протеин sp-2 из шрота сои. Предметом исследования является физико-химические и противоопухолевые свойства протеина sp-2.

Методы исследований. Методы колоночной хроматографии, электрофоретические исследования, определение аминокислотного состава и N-концевых аминокислот, радиометрического анализа по включению ¹⁴С - тимидина, имунногистохимического анализа, микроскопии, имунноферментного анализа, ПЦР анализа.

Основные положения, выносимые на защиту:

- выделение и физико-химическая характеристика белкового комплекса протеина sp-2 из шрота сои;

- исследование специфической биологической активности протеина sp-2 в условиях in vitro и in vivo;

- исследование экспрессии онкогенов, контролирующих апоптоз после введения протеина sp-2.

Научная новизна. Впервые из шрота сои выделен белковый комплекс протеин sp-2, изучены его физико-химические свойства. Полученный очищенный белок состоит из комплекса белков с молекулярной массой основного компонента 30 кДа, изоэлектрической точкой в области pI -3,8; 3,9 и 8,2. Аминокислотный состав Ala, Arg, Asp, Val, His, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Tyr, Thr, Phe. N-концевые аминокислоты: треонин, глицин, серин, пролин, валин. Исследована специфическая противоопухолевая активность протеина sp-2 в условиях in vitro и in vivo.

Научная и практическая значимость результатов исследований.

Подана заявка в патентное Государственное ведомство Республики Узбекистан (№IAP 20080420) «Способ выделения белкового комплекса из шрота растительного сырья». Полученные результаты помогут увеличить фундаментальные знания современной науки относительно механизма и эффектов действия белков на опухолевые клетки, позволят понять новую стратегию лечения злокачественных новообразований, проектировать новые противоопухолевые препараты на основе белков, выделяемых из сои.

Реализация результатов. В результате проведенных исследований протеин sp-2 предложен в качестве противоопухолевого средства. В рамках прикладных исследований по гранту ФА-А11-Т174 «Разработка противоопухолевого белкового препарата из шрота сои и выделения особо чистых ферментов из местного сырья» (2009-2011 гг.) проводится разработка лекарственной формы и подготовка необходимых НТД по проекту ВФС субстанции для передачи в ФК МЗ РУз.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на: XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007); научно-практической конференции «Физико-химическая биология и перспективы биотехнологии» (Андижан, 2007); международной научно-практической конференции конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2009); международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); Российской научно-практической конференции с международным участием «Современная онкология: достижения и перспективы развития (Томск, 2009); научно - практической конференции «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации» (Ташкент, 2009).

Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ. Эти публикации включают 3 статьи в рецензируемых журналах, 9 тезисов в материалах научных форумах, 1 буклет.

Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (Глава I), описания материалов и методов (Глава II), результаты и их обсуждение (Глава III), заключения, выводов, списка используемой литературы. Диссертация иллюстрирована 3 таблицами и 35 рисунками. Список литературы включает 183 ссылки.

Диссертационная работа построена следующим образом:

- первая глава - литературный обзор посвящен характеристике сои, биохимическим компонентам семян сои и лечебным свойствам этого растения;

- в главе II приводятся методики выделения и очистки протеина sp-2, методы физико-химических и биологических исследований его свойств;

- в главе III охарактеризован протеин sp-2 и обсуждается его специфическая биологическая активность.

В заключение диссертации приводятся основные выводы.

Автор благодарит за помощь в проведении совместных исследований: с.н.с. лаборатории биорегуляторов ИБОХ АН РУз, к.м.н. Кузнецову Н.Н. по отбору активных фракций in vitro на клеточной линии меланомы мышей КМЛ (штамм меланомы мышей В-16); с.н.с. лаб. химии белков и пептидов ИБОХ АН РУз к.х.н. Э.М. Султанову по определении N - концевых аминокислот активной белковой фракции; зав. лаб. канцерогенеза и первичной профилактики РОНЦ МЗ РУз д.б.н Киреева Г.В.; зав лаб. биологии опухолей РОНЦ МЗ РУз к.б.н. Гильдиеву М.С.; с.н.с. ОЗ «Нихол» РОНЦ МЗ РУз к.б.н. Абдувалиева А.А.; с.н.с. ОЗ «Нихол» РОНЦ МЗ РУз к.м.н. Юсупову А.А. в определении противоопухолевой активности протеина sp-2.

Основное содержание работы

протеин шрот соя химический

Выделение протеина sp-2 и определение активности по включению ¹⁴С - тимидина

Выделение белков из шрота сои проводили двумя методами эстракции раствором 5% NaCl и 0,05М Трис буфером pH 7,4. Для тестирования противоопухолевой активности белков нами была использована модельная тест-система для отбора противоопухолевых веществ in vitro на клеточной линии меланомы мышей КМЛ (штамм меланомы мышей В-16). Определение активности фракций по включению ¹⁴С-тимидина, показало, что при использовании этих методов выделения белков из шрота сои вещество является активным. Однако белки, выделенные 0,05М Трис буфером pH 7,4, обладали большей активностью в подавлении пролиферации клеток КМЛ, которая составила 52,3±1,4%.

Электрофоретическое исследование компонентного состава тотальной фракции показало, что основные и ярко выраженные полипептиды находятся в области молекулярной массы до 67 кДа. В связи с этим были выбраны носители для гельфильтрации сефадексы G-75 и G-50.

На обоих носителях элюировалось по три фракции. Определение активности фракций по включению ¹⁴С-тимидина, показало, что наибольшим подавлением пролиферации клеток КМЛ 58,5±1,4% в дозе 100 мкг/мл обладала первая фракция после гельфильтрации на колонке с сефадексом G-75. Электрофоретические исследования белковых фракций после гельфильтрации, показало, что наиболее эффективное разделение белков на колонке с сефадексом G-75. Компонентный состав первой фракции представлен основными полипептидами с молекулярной массой 30, 32, 35 кДа. Эти полипептиды отсутствуют во второй и третьей фракции. При гельфильтрации на колонке с сефадексом G-50 разделение белков не эффективное, спектр белков всех трех фракций практически одинаков.

Дальнейшую очистку первой активной фракции после сефадекса G-75 проводили на колонке с ультрогелем АсА34 в 0,5М NaСl, pH 7,4. Разделение показало наличие пяти фракций. Хроматограмма гельфильтрации представлена на рисунке 1. Определение активности фракций по включению ¹⁴С-тимидина, показало, что активная фракция элюировалась вторым пиком, процент подавления включения метки составил 64,0±1,9% в дозе 100 мкг/мл.

Электрофоретическое исследование показало, что активная фракция состоит из комплекса белков с молекулярной массой основного компонента 30 кДа (Рис. 2.).

Процентное содержание основного компонента с молекулярной массой 30 кДа увеличивается по мере очистки с 5,36% до 29,16%. Вероятно, повышение активности белкового комплекса связано с повышением процентного содержания этого полипептида.

Рис. 1. Гельфильтрация протеина sp-2 на колонке с ультрогелем АсА34 (80 x 2.5), 0,5М NaСl, pH 7,4

Рис. 2. Электрофорез в градиенте 10-15% ПААГ в присутствии SDS белка из шрота сои после разделения на колонке с ультрогелем АсА34: 1-смесь белков-маркеров (БСА, Овальбумин, Соевый ингибитор трипсина, Лизоцим); 2-фракция I; 3 - фракция II; 4 - фракция III; 5 - фракция IV.

Затем было проведено изоэлектрофокусирование активной белковой фракции. Наблюдалось наличие трёх компонентов с изоэлектрическими точками в области pI -3,8; 3,9 и 8,2 (Рис. 3).

+

Рис. 3. Изоэлекторофокусирование активной фракции белка после гельфильтрации на колонке с ультрогелем ACA-34 (амфолины в диапазоне pH 3,5-10): 1 - Фракция II, 2 - Маркёры изофокусирования

Определен аминокислотный состав активной белковой фракции (см. табл. 1.).

Проведение анализа по определению N-концевой аминокислоты, показало наличие пяти N-концов: треонин, глицин, серин, пролин, валин.

Активный белковый комплекс, состоящий из пяти полипептидов, который элюировался второй фракцией с ультрогеля АсА34, был назван протеин sp-2 (soybean proteins).

Таблица 1. Аминокислотный состав активной белковой фракции