Биосинтез хинолидиновых алкалоидов в суспензионной культуре клеток Thermopsis Lanceolata R. BR

Размещено на http://www.allbest.ru/

Восточно-Казахстанский государственный университет им. С. Аманжолова

Биосинтез хинолидиновых алкалоидов в суспензионной культуре клеток Thermopsis Lanceolata R. BR

А.П. Андреева

Растения являются источником получения очень многих практически важных веществ. При этом следует подчеркнуть, что промышленное получение некоторых соединений, например, сердечных гликозидов, флавонойдов, кумаринов, эфирных масел достигается только путем выделения их из растительного сырья.

Растительные клетки особенно богаты алкалоидами - особой группой азотистых органических соединений основного характера, имеющих сложный состав, среди которых обнаружены вещества с уникальным и специфическим физиологическим действием на животных и человека.

Интерес к изучению алкалоидов вызывается, прежде всего, тем, что многие из них являются незаменимыми лекарственными веществами. Особое место занимают хинолидиновые алкалоиды, которые оказывают на организм человека и животных возбуждающее или парализующее действие [1]. Наиболее известными веществами этой группы являются:

цитизин (1) -встречается во многих растениях семейства бобовых (Leguminosae). Содержание его колеблется от 1 до 3%. Широко распространенный в СНГ термопсис ланцетный (Thermopsis lanceolata) содержит метилцитизин С12Н16ОN2, анагирин С15Н20ОN2, пахикарпин С15Н26N2, термопсин С15Н20ОN2, гомотермопсин С17Н24ОN2 и некоторые другие алкалоиды -- производные пиридина. Наибольшее количество алкалойдов (2-3%) содержится в семенах Thermopsis lanceolata, в большей мере цитизин С11Н14ОN2. Цитизин оказывает возбуждающее влияние на ганглии вегетативного отдела нервной системы и родственные им образования: хромаффинную ткань надпочечников и каротидные клубочки. Характерным для действия цитизина является возбуждение дыхания, связанное с рефлекторной стимуляцией дыхательного центра импульсами, поступающими от каротидных клубочков. Одновременное возбуждение симпатических ганглиев и надпочечников приводит к повышению артериального давления. Поэтому цитизин применяется в медицине как стимулятор дыхания и кровообращения. [2,3];

пахикарпин (2) - алкалоид, содержащийся в растении софора толстоплодная (Sорhоrа расhycarpa С.А.М.), сем. бобовых (Leguminosae); содержится также в Тhermopsis lanceolata. Является двутретичным основанием: в отличие от бензогексония и аналогичных по строению препаратов пахикарпин не содержит четвертичных атомов азота ("ониевых групп"); вместе с тем пахикарпин, подобно этим соединениям, обладает способностью блокировать вегетативные ганглии. Пахикарпин в этом отношении менее активен, однако он удобен для применения внутрь, так как легко всасывается из желудочно-кишечного тракта. Применяют пахикарпин в качестве ганглиоблокатора главным образом при спазмах периферических сосудов, а также при ганглионитах. Пахикарпин улучшает функцию мышц при миопатии.

Одной из важных особенностей пахикарпина является его способность повышать тонус и усиливать сокращение мускулатуры матки. В связи с этим пахикарпин относительно широко применяли для усиления родовой деятельности при слабости родовых схваток и при раннем отхождении вод, а также при слабости потуг. [4]

Как мы видим, вопрос получения алкалоидов, используемых в медицине, для синтеза лекарственных препаратов является актуальным.

Проблема в том, что содержание алкалоидов в растении обычно очень невелико. Кроме того, возникают трудности, связанные с отделением этих веществ от «балластного материала», составляющего основную массу растительного сырья.

Сложность выделения и очистки цитизина из семян T. lanceolata приводит к высокой стоимости коммерческого препарата и делает целесообразным поиск альтернативного способа получения алкалоида. Для получения алкалоида цитизина предлагается использовать биотехнологический метод. Выделение культуры клеток T. lanceolata представляет интерес как модельная система для изучения биосинтеза и динамики накопления цитизина в условиях in vitro.

Выбор растительного объекта для использования в качестве экспериментальной модели в процессе культивирования in vitro и последующего получения штамма-продуцента БАВ, как правило, связан с информацией о его химическом составе и успехами выращивания в условиях in vivo.

Такие исследования актуальны в связи с тем, что синтез алкалоидов сложной структуры трудно воспроизводим (хотя в лабораторных условиях возможен - например, синтез резерпина и стрихнина, осуществленный Вудвортом) и экономически нецелесообразен. Изучение химических процессов биосинтеза алкалоидов в живой растительной ткани позволяет разработать оптимальные методы их выделения из лекарственного растительного сырья. По современным данным, синтез хинолизидиновых алкалоидов идет по следующей схеме:

пахикарпин очистка цитизин термопсин

Алкалоидами, содержащими хинолизидиновое кольцо, является лупинин, и более сложные структуры - спартеиновые алкалоиды. Предшественником лупининовых алкалоидов в растениях является аминокислота лизин, из двух молекул которого образуется в начале диальдегидамин, который затем восстанавливается с образованием хинолизидиновой структуры лупинина. Последующее присоединение еще одной молекулы лизина приводит к образованию тетрацикличесикх соединений, известных под общим названием спартеиновых алкалоидов.

В результате ферментативного окисления и гидролиза происходит образование из спартеина анагерина и его изомера термопсина и цитизина [5,6].

Цель настоящего обзора - разработать методическую базу для получения хинолизидиновых алкалоидов в суспензионной культуре клеток Тhermopsis lanceolata.

Перспективы биотехнологического способа получения ценных препаратов на основе растительных клеток вместо использования интактных растений в настоящее время общепризнаны в мире.

История развития метода культуры тканей начинается на рубеже XIX-XX вв. с опытов немецких ученых Фехтинга, Рехингера и Габерландта, которые пытались выращивать на растворах сахарозы изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Не достигнув экспериментальных успехов, эти исследователи, однако, высказали ряд важных идей и гипотез, которые были подтверждены значительно позже. В 1947 г. Телл и Готре впервые показали способность синтеза вторичных соединений, а именно алкалоидов, в клеточной культуре белены черной. В нашей стране систематические исследования в этой области были начаты Р.Г. Бутенко в 1957 г. в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН СССР, которая получила клеточные культуры женьшеня и ряда других лекарственных растений [7,8,9]. До начала 70-х годов спектр соединений, образуемых клеточными культурами в количествах, характерных для целого растения, был очень ограничен. Это Nicotiana tabacum, в которой некоторые исследователи наблюдали синтез относительно больших количеств никотина (0.7 %), Dioscorea deltoidea, накапливающая до 1.6 % диосгенина [10], Ammi visnaga, содержащая в 20 раз больше виснагина в культуре ткани, чем в растении [11], и некоторые другие. Экспериментальные данные, накопившиеся к этому периоду, указывали, что биосинтез многих соединений в недифференцированных тканях сильно подавлен, а появление продуктов во многих случаях было связано с регенерацией корней, побегов и других морфологических структур, т.е. с процессом дифференциации ткани. С начала 70-х годов список фармакологически ценных вторичных продуктов биосинтеза, обнаруженных в культурах тканей, значительно расширился. На данном этапе биотехнологическое использование клеточных культур в качестве сырья в промышленных масштабах становится реальностью. В виде примеров можно привести производство шиконина из Lithospermum erythrorhison в Японии (фирма Toshiba) -- ценного для косметики, пищевой промышленности и медицины растительного нафтохинонового пигмента. В России производство культуры ткани женьшеня ("Биоженьшень") осуществляется на биохимических заводах. Экстракт, получаемый из биомассы женьшеня, используется в качестве биологически активной добавки к кремам, лосьонам, а в пищевой промышленности -- для приготовления тонизирующих напитков. Для получения ценного противоаритмического препарата аймалина на ХПХФО "Здоровье"(Харьков, Украина) организовано опытное производство биомассы культуры тканей Rauwolfia serpentina. Таким образом, возможности, открытые методом культуры тканей, позволили в настоящее время создать биотехнологическое производство принципиально новых видов сырья для получения необходимых соединений [7,12].

Метод культур клеток имеет ряд преимуществ, среди которых радикальное решение проблемы дефицита исходного сырья, возможность получения фитомассы, полностью свободной от поллютантов (гербицидов, пестицидов, радиоактивных веществ и др.), индустриализация и удешевление производства, возможность управления процессом биосинтеза целевых продуктов и пр. [13,14].

В последние годы все больший интерес привлекают методы глубинного культивирования клеток высших растений, поскольку этот метод обладает большим преимуществом перед поверхностным культивированием (каллусными культурами): обеспечение одинаковых условий для всех клеток популяции; увеличение скорости их роста и биосинтетического потенциала; возможность автоматизации процессов.

Одной из наиболее эффективных технологий, применяемой для промышленного выращивания клеточной биомассы, с целью получения экономически важных продуктов, является выращивание суспензии клеток растений в установках непрерывного культивирования по принципу хемостата.

При оптимальном режиме выращивания клетки в суспензиях быстро размножаются, имеют более высокий «урожай», чем в стационарных культурах.

Под суспензионной культурой понимают выращивание отдельных клеток или небольших групп их во взвешенном состоянии в жидкой среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание.

В 1953 году Оуенс с сотрудниками впервые показал способность клеток размножаться в жидкой среде в свободно суспендированном состоянии. С тех пор метод суспензионного культивирования привлекает внимание исследователей в связи с его высокой эффективностью при накоплении больших количеств клеток[15].

Начальный момент получения суспензионной клеточной культуры является очень важным. Это означает, что только клетки, которые по ряду причин способны к перестройки метаболизма и размножению с высоким коэффициентом в данных конкретных условиях суспензионного культивирования, образуют «хорошие» линии. Важными характеристиками таких линий является высокая степень дезагригации (5-10 клеток в группе), морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или слегка овальная форма, плотная цитоплазма), отсутствие трахиидоподобных элементов.

Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Рыхлые, оводненные культуры каллусных тканей более пригодны для перевода в суспензию, чем структурированные, плотные каллусы. Выращивание каллусов на среде с 2,4 Д, исключение из среды ионов кальция, обработка пектиназой трансплантанта, предназначенного для выращивания в суспензионной культуре, оптимальны для получения суспензии [16].

Суспензионные клеточные культуры проходят характерные стадии: лаг-фазу, фазу логарифмического роста, стационарную фазу и фазу логарифмического отмирания. В первой стадии, как правило, количество клеток уменьшается, во второй стадии популяция клеток увеличивается (логарифмическая стадия роста), в третьей стадии увеличения количества клеток не наблюдается (стационарная фаза). Если культивирование продолжить дальше, то обнаружится период уменьшения численности клеток - фаза логарифмического отмирания (фаза разрушения) [17].

Сообщения о взаимосвязи синтеза вторичных соединений с ростом клеток довольно противоречивы. У многих культур при периодическом режиме выращивания вторичные метаболиты накапливается в значительных количествах лишь при замедлении или остановке роста, хотя в отдельных случаях синтез продукта способствует росту клеток. Возможно, механизмы и условия, блокирующие деление клеток и активный рост, является одновременно механизмами активации, обеспечивающими синтез ферментов вторичного метаболизма [14, 33]. К примеру, в литературе присутствуют данные, что накопление N- малонилтриптофана в суспензионных культурах растительных клеток резко усиливалось при длительном нахождении клеток в стационарной фазе культурального цикла, в которой деление клеток отсутствовало и, следовательно, происходило их старение [18].

Но адаптация клеток растений к росту на искусственных питательных средах в течение длительного времени возможна только при участии в митотическом цикле (МЦ) большей части популяции. Анализ данных литературы показал, что основные процессы, определяющие пролиферацию и контролирующие последовательность событий МЦ, являются общими для клеток эукариотов, включая длительно поддерживаемые in vitro [19,20].Однако существуют черты, присущие только культивируемым клеткам. К ним относятся нарушение строгой пространственной ориентации делений, изменение клеточных контактов и отсутствие тканевой специализации.

Спецификой ситуации in vitro является и то, что цитофизиологический статус клеток можно регулировать экзогенно. Это позволяет через стандартизацию условий культивирования в какой-то мере стабилизировать физиологические параметры клеток. Кроме того, условия in vitro можно рассматривать как не конкурентный режим, поскольку при росте на питательных средах в оптимальных условиях, как правило не возникает дефицита компонентов минерального питания, витаминов, углеводов и других ростовых факторов. Однако это может привести к накоплению в популяции клеток с генетическими и эпигенетическими изменениями, по сравнению с интактным растением, что в свою очередь скажется на реакциях первичного и вторичного метаболизма [21,22].

В любом случае, прежде всего, стараются создать оптимальные условия для роста, то есть накопления биомассы, а затем исследуют влияние этих условий на биосинтез вторичных метаболитов. Если образование биомассы не связано с синтезом вторичного вещества, стараются установить баланс между биомассой и выходом БАВ.

Важной характеристикой клеточной популяции является ее стабильность в отношении синтеза, транспорта и депонирования вторичных метаболитов. Стабильность может сохраняться в течение всего времени существования популяции.

При этом сохраняются и активно работают гены синтеза, системы транспорта и депонирования. Возможен случай постепенного (в течение нескольких лет) увеличения числа клеток со сниженным синтезом метаболитов. И, наконец, в случае полной нестабильности клетки популяции очень быстро теряют свой биосинтетический потенциал.

Однако, преимущество культивируемых in vitro тканей растений обусловлено тем, что деление клеток можно синхронизировать в различных фазах цикла, варьируя условия культивирования. Синхронизация может быть вызвана следующими факторами: 1) изменение физических параметров (освещения, температуры) и вариацией состава питательных сред; 2) применением химических ингибиторов деления клеток.

Подбор физических и химических условий культивирования является наиболее простым и часто применяемым подходом для повышения продуктивности. В основе физиологического регулирования процессов вторичного синтеза лежит изучение влияния факторов культивирования на рост и метаболизм клеток. Большое внимание уделяется таким факторам культивирования, как регуляторы роста, минеральные вещества, витамины, сахара, свет, аэрация, температура, а также обработка элиситорами [23,24].

Во многих случаях эти работы привели к успеху. Удачны в этом отношении примеры японских фирм: Mitsui petrochemical, получивших ткань воробейника, продуцирующую шиконин в 8 раз больше интактного растения и Shionagi, производящей убихинон-10 из ткани табака (Nicotiana tabacum) в количестве в 12 раз превышающих синтез в растении. Также следует отметить работу Института физиологии растений РАН по получению мутантной линии раульфии змеиной (Rauwolfia serpentina), синтезирующей аймалин в 10 раз превышающей исходный уровень. Культура клеток Esholzia californica синтезирует в 8 раз больше бензофенантрединовых алкалоидов, чем интактное растение. При клонировании суспензионной культуры клеток паслена были выделены линии, накапливающие больше 3 % соланидина [25], получен штамм клеток руты душистой, содержащей в 20 раз больше алкалоида рутакридона по сравнению с растением [26].

Изучению динамики биосинтеза вторичных метаболитов в экстрактах их каллусной или суспензионной культуры способствовало применение качественных методов колончатой и бумажной хроматографии (БХ). Доступность и высокая степень достоверности хроматографических исследований не теряет актуальности в третьем тысячелетии. Специализированные биотехнологические комплексы обращают большое внимание на техническое оснащение процессов культивирования клеток, что касается химического анализа, предпочтение отдается методам не требующих специальной подготовки сотрудников.

Хроматографический метод разделения суммы веществ позволяет проанализировать физические и химические свойства. В основе метода лежит четкое выделение концентрационных зон исследуемых компонентов, которые перемещаются в потоке подвижной фазы (элюента) вдоль слоя неподвижной. Исследуемый алкалоид будет распределен между обеими фазами. Обычно неподвижная фаза представляет собой сорбент с развитой поверхностью, а подвижная - поток газа (пара) или жидкости, фильтрующийся через слой сорбента. Различие в равновесном или кинетическом распределении компонентов смеси между фазами является необходимым условием их хроматографического разделения.

Чаще всего для качественного определения суммы веществ используют колончатую и бумажную хроматографию. Колончатая хроматография основана на различии растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе и элюенте. Наиболее удобна проявительная хроматография, при которой анализируемую смесь периодически вводят в поток подвижной фазы. В колонке смесь разделяется на отдельные компоненты, между которыми находятся зоны подвижной фазы [27,28-30].

Вторым видом используемой как «экспресс метод» хроматографии является бумажная хроматография (БХ), основанная на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси на бумаге в потоке растворителя соответствующего состава. Хроматограммой в этом случае называют картину расположения хроматографических зон на бумаге после завершения разделения. Каплю исследуемого экстракта (1-10мкл) наносят на специальную бумагу, по которой под действием капиллярных и гравитационных сил перемещается растворитель.

В БХ положение зон компонентов характеризуется величиной R, которая равна отношению пути, пройденному фронтом растворителя. В стандартизированных условиях величина R постоянна для каждого алкалоида и используется для его идентификации [28, 31,32].

Таким образом, состояние дел в области направленного биосинтеза БАВ растительного происхождения позволяет говорить о том, что уже в настоящее время есть возможность для практического применения достижений в фармацевтической промышленности. Для этого необходимо дальнейшее детальное изучение биосинтетических путей БАВ.

Список литературы

1. Мироненко А.В. Методы определения алкалоидов. Минск.: 1966.С.179

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства.М.:Медицина, 1993. т2. С. 157.

3. Царев М.В. //Труды ВИЛАР. 1950. вып.10. С.138.

4. Семенов А.А. Очерк химии природных соединений. Новосибирск.: Наука, 2000. С.472.

5. Орехов А.П. Химия алкалойдов. М.: Издательство Академии наук СССР - 1955 г. С. 30-32

6. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия. М.:Медицина, 2002 г. С 432-435

7. Филиппова В. Особенности вторичного метаболизма в культурах растительных клеток

8. Бутенко Р.Г. Выращивание клеток высших растений в суспензионной культуре. // Известия АН СССР. 1977. № 5. С.697 -709

9. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. -М.: Наука, 1964 г. С. 272.

10. Kaul B., Staba E.I. Dioscorea tissue cultures: 1. Biosynthesis and isolation of diosgenin from Dioscorea deltoidea callus and suspend cells // Lloyda, 1968. Vol. 31. P. 171-179.

11. Kaul B., Staba E.I. Ammi visnaga (L.) Lam. tissue cultures. Multiliter suspension growth and examination for furanochromones // Planta med., 1967. Vol. 15. № 2. P. 473-4766.

12. Шульгин А. Шульгина Э. Trytamina botanica

13. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений.- Алматы: Конжык - 1996 г

14. Андреева А.П. Учебное пособие «Биотехнология»

15. Егорова Т.А., Клунова С. М., Живухина Е.А., Основы биотехнологии.-М.: «Академия»-2003 г

16. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.Ф., Корженевская Т.Г.,Маркарова Е.Н. Клеточная инженерия. М.: Высшая школа, 1987 г. С.21-23

17. Волова Т. Г. «Биотехнология».

18. Маркова Т.А., Гамбург К.З. Эндогенный N- малонилтриптофан в суспензионных культурах растительных клеток.// Физиология растений, т. 42, №1

19. Зоринянц С.Э. , Смоленская И.Н., Носов А.В., Быстрорастущая суспензионная культура клеток и протопласты пшеницы Тимофеева. // Физиология растений, т.40, №2

20. Зоринянц С.Э. , Смоленская И.Н., Длительно культивируемая суспензия пшеницы Тимофеева. Кинетика популяции // Физиология растений, т.45, №1

21. 21.Зоринянц С.Э. , Смоленская И.Н., Бадаева Е.Д. Длительно культивируемая суспензия клеток пшеницы Тимофеева. Синхронизация деления с помощью оксимочевины и колхицина.// Физиология растений, т.45, №2

22. Сапко О.А., Шамина З. Б. , Кунаева Р. М. Действие N- нитрозо -N- метилмочевины на вариабильность клоновых популяций Alchagi kirgisorum in vitro.// Физиология растений, т.40, №2

23. Культура клеток растений. М.: Наука, 1981 г.

24. Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986 г.

25. Zenk M.H. The impact of plant cell culture on industry // Frontiers of plant tissue culture Calgari (USA), 1978. P. 1-14.

26. Адескенов С.М. Современное состояние и перспективы производства биопрепаратов для медицины.//Биотехнология,2002,№3

27. Пасешниченко В.А. Новый альтернативный путь биосинтеза изопреноидов у бактерий и растений.// Биотехнология,1998,т.63,№2. С171-182.

28. Загребельный С.Н. Биотехнология. Ч.1. Культивирование продуцентов и очистка продуктов. Новосибирск, 2001. - 109 с.

29. Химический энциклопедический словарь/под ред. Клунянц И.Л.// М.: Советская энциклопедия.1983.С.667-669.

30. Рогинский С.З., Яновский М.И., Берман А.Д. Основы применения хроматографии в катализе.// М.,1972.

31. Гольберт К.А., Вигдергауз М.С. Курс газовой хроматографии.// 2 изд.М.:1974.

32. Хроматография на бумаге/под ред. И.Хайса, К.Мацека, пер. с чешск.//М.:1962.

33. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений // Культура клеток растений.М.:Наука,1981.С.37-50.

Размещено на Allbest.ru