Хроматографическое и электрофоретическое определение тиреостатиков – тиоамидов на основе пиридина, пиримидина и пурина

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Хроматографическое и электрофоретическое определение тиреостатиков - тиоамидов на основе пиридина, пиримидина и пурина

Долинкин Андрей Олегович

Краснодар - 2010

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета ФГОУ ВПО «Южный федеральный университет».

Научный руководитель:доктор химических наук, профессор

Черновьянц Маргарита Сергеевна

Официальные оппоненты:доктор химических наук, профессор

Буков Николай Николаевич

кандидат химических наук

Бозина Татьяна Владимировна

Ведущая организация:ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Пятигорск

Защита диссертации состоится «29» июня 2010г. в 14 часов в аудитории 231 на заседании диссертационного совета ДМ 212.101.16 при Кубанском государственном университете по адресу: 350040, г. Краснодар,

ул. Ставропольская, 149.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кубанского государственного университета по адресу: 350040, г. Краснодар,

ул. Ставропольская, 149.

Автореферат разослан «__» мая 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук, доцент Н.В. Киселева

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Биологически активные соединения (БАС) на основе гетероароматических тиоамидов широко известны как лекарственные препараты с различной фармакологической активностью (производные пиридина, пиримидина, пурина, тиоурацила и др.). Фармакофором, ответственным за антитиреоидное действие, считается тиоамидная группа, включенная в структуры соединений на основе пиридина, пиримидина, урацила, пурина, приобретающих после этого антитиреоидные и гойтрогенные свойства. Иод - важнейший элемент, вовлеченный в функционирование щитовидной железы, синтез тиреоидных гормонов и секрецию. Тиоамиды ингибируют синтез тиреоидных гормонов: тироксина Т4 и его активной формы трииодтиронина Т3, главным образом, на этапе органификации иода - включения активированного иода в тирозильные фрагменты тиреоглобулина.

Несмотря на длительное применение в международной клинической практике, механизм их физико-химического действия на этапе органификации иода остается до конца не определенным. Возрастающий интерес к изучению устойчивости комплексов переноса заряда иода с тиоамидами вызван не только стремлением детализировать механизм органификации иода, но и направленным поиском новых препаратов тиреостатического действия, аналогов используемых в клинической практике. Антитиреоидная активность тиоамидов зависит от структуры и термодинамической устойчивости их молекулярных комплексов с иодом. Фармакологическая активность лекарственных препаратов во многом определяется фармакокинетическим фактором, влияющим на их распределение в организме, актуальным является также изучение протолитических свойств тиоамидов (основности и кислотности), соотношения молекулярной и ионной форм препаратов при физиологическом значении рН, а также оценка констант ассоциации препаратов с транспортными белками плазмы крови.

Поскольку большинство антитиреоидных препаратов при физиологических условиях существуют частично в биологически активной - ионной форме, то существует потребность в разработке простых в исполнении, высокочувствительных и экспрессных электрофоретических методик разделения и анализа, применимых для мониторинга лекарственных препаратов и биообъектов.

Предварительный проведенный анализ научных публикаций позволил сделать вывод о лидирующей позиции методов хроматографии при определении биологически активных тиоамидов в лекарственных формах и биообъектах, в том числе ГХ-масс-спектрометрия (ГХ-МС), ВЭЖХ-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС), включающие способы пробоподготовки (предварительную экстракцию и дериватизацию).

Дополнительным аргументом в пользу потребности в простых и доступных методиках определения тиреостатиков является необходимость контроля их содержания в кормах, биологических жидкостях и тканях животных. Этот контроль обусловлен использованием тиреостатических средств в качестве несанкционированных пищевых добавок, увеличивающих массу животных.

Цель работы заключалась в разработке современных методик идентификации и определения тиоамидов, производных пиримидина, пиридина и пурина на основе систематического исследования их физико-химических характеристик.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- сравнительная оценка устойчивости n-у*-комплексов гетероароматических тиоамидов с молекулярным иодом в неполярной среде (хлороформе);

- исследование окислительно-восстановительного взаимодействия тиоамидов с молекулярным иодом в полярных средах (вода и водно-этанольный раствор);

- оценка протолитических свойств и констант протолитических равновесий исследуемых соединений;

- изучение взаимодействия лекарственных препаратов с белком-переносчиком (бычьим сывороточным альбумином) и расчет констант ассоциации;

- подбор условий идентификации гетероароматических тиоамидов, основанных на зависимости хроматографической и электрофоретической подвижности (методы ТСХ, ГХ-МС, ВЭЖХ, капиллярный зонный электрофорез) и оптических характеристик УФ-, ИК-, масс-спектров от природы гетероцикла; окислительный тиоамид иод альбумин

- разработка комплекса методик определения препаратов на основе тонкослойной хроматографии (в том числе с применением оптической денситометрии, газовой хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ);

- апробация разработанной методики в анализе биологических жидкостей.

Научная новизна.

- Установлена взаимосвязь между структурой гетероароматических тиоамидов, их способностью формировать n-у*-комплексы с иодом в неполярных средах, а также восстановительными свойствами в водно-этанольных растворах, что послужило основой их иодиметрического определения;

- Подобраны оптимальные условия капиллярного электрофоретического разделения и определения тиреостатиков на основании оценки протолитических свойств тиоамидов (и );

- Определены константы ассоциации молекулярных (методом гашения люминесценции альбумина) и ионных (методом КЗЭ) форм препаратов-тиреостатиков с белком-переносчиком и сделано предположение о природе связывающих сайтов в молекуле альбумина;

- Разработаны методики идентификации, разделения и определения гетероароматических тиоамидов хроматографическими (ТСХ, ГХ-МС, ВЭЖХ), электромиграционными (КЗЭ) и спектроскопическими (УФ-, ИК-) методами.

Практическая значимость.

Предложены условия идентификации, разделения и определения гетероароматических тиоамидов с использованием спектроскопических, хроматографических и электрофоретических методов, которые могут быть применены также при составлении фармакопейных статей лекарственных субстанций. Разработана методика ТСХ определения тиреостатика 6-н-пропил-2-тиоурацила с применением оптической денситометрии.

Разработаны подходы и показана возможность оценки констант ассоциации активных ионных форм тиреостатиков, производных 2-тиоурацила, с транспортным протеином-сывороточным альбумином методом капиллярного зонного электрофореза.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Результаты спектроскопических и потенциометрических исследований взаимодействия ряда гетероароматических тиоамидов, производных пиримидина, пиридина, урацила и пурина с молекулярным иодом в различных средах. Влияние природы гетероцикла на электронодонорные свойства тиоамидов и возможность их иодиметрического определения.

2. Оценка протолитических свойств гетероароматических тиоамидов, установление соотношения молекулярной и ионной форм препаратов при физиологическом значении рН и подбор оптимальных условий капиллярного электрофоретического разделения и определения тиреостатиков.

3. Результаты исследования ассоциации тиреостатических препаратов на основе 2-тиоурацила с транспортным альбумином и оценка констант связывания методами гашения люминесценции и КЗЭ.

4. Комплекс современных спектроскопических (ИК-, УФ-, масс-спектрометрия), хроматографических (ТСХ, ГХ, ВЭЖХ, КЗЭ) методик идентификации гетероароматических тиоамидов.

5. Аналитические преимущества методик хроматографического (ГХ-МС, ВЭЖХ-УФ и КЗЭ) определения тиоамидов на основе пиримидина, пиридина, урацила и пурина.

6. Практическое применение методики ВЭЖХ-УФ определения тиреостатика 6-н-пропил-2-тиоурацила в моче здорового человека.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Международном конгрессе студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспектива» (Нальчик, 2007г.); XVII Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2007г.); XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007г.); II Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008г.); V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды (Ростов-на-Дону, 2009г.); VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика» (Йошкар-Ола, 2009г.); III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2009г.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 печатных работ в виде 4 статей, которые входят в список журналов, рекомендованных ВАК, материалов докладов и конференций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Работа выполнена на 136 страницах машинописного текста, включающего 57 рисунков, 17 таблиц и библиографию из 180 наименований.

Основное содержание работы

Во введении обосновывается актуальность темы и формулируется цель работы.

Обзор литературы

Обзор состоит из двух разделов, посвященных структурной и аналитической химии гетероароматических тиоамидов - лекарственных препаратов тиреостатического действия.

В первом разделе обобщены структурные исследования продуктов взаимодействия препаратов антитиреоидного действия (гетероароматических тиоамидов) с иодом. Показано (в основном по данным рентгеноструктурного анализа и Рамановской спектроскопии), что структурные параметры молекулярных комплексов иода высоко чувствительны к изменению типа гетероатома и характера заместителя в гетерокольце. Приведена модель ингибирующего действия препаратов - тиреостатиков на биосинтез гормонов щитовидной железы. Проанализировано влияние структуры тиоамидов на механизм их антитиреоидной активности.

Во втором разделе представлены широко применяемые в фармацевтической и клинической практике методы идентификации и количественного определения препаратов тиреостатического действия. Уделено внимание стадиям пробоподготовки образцов (твердофазной и жидкостной экстракции из биологических матриц) и химического модифицирования молекул препаратов. Представленные в обзоре аналитические характеристики отдельных методик определения тиреостатиков могут быть использованы в производстве на стадии контроля качества.

Базируясь на приведенных в литературе данных, сформулированы задачи для достижения поставленной в работе цели.

Объекты исследования

В работе исследовались традиционно используемые препараты и потенциальные тиреостатики - гетероароматические тиоамиды:

I-II: производные пиридин-2-тиона

	№ R Название соединения I H пиридин-2-тион II CF3 5-трифторметил-пиридин-2-тион

III-IV: производные пиримидин-2-тиона

	№ R Название соединения III H пиримидин-2-тион IV CF3 4-трифторметил-пиримидин-2-тион

V-VII: производные 2-тиоурацила

	№ R Название соединения V H 2-тиоурацил, TU VI CH3 6-метил-2-тиоурацил, MTU VII н-С3H7 6-н-пропил-2-тиоурацил, PTU

VIII-IX: производные пурин-6-тиона

1Н-пурин-6(9Н)тион, 6МР (VIII)	1Н-пиразоло[3,4-d]пиримидин-4(5Н)-тион (IX)

Исследование взаимодействия гетероароматических тиоамидов

с иодом в различных средах

Проявление антитиреоидной активности гетероароматическими тиоамидами зависит от структуры и термодинамической устойчивости их молекулярных комплексов с иодом. Реакция между тиреостатиками и молекулярным иодом приводит к образованию аддуктов состава 1:1, посредством донирования электронной плотности с ВЗМО тиоамида на НСМО (у*-типа) молекулы иода.

В системе тиоамид - элементарный иод в хлороформе спектрофотометрическим методом сдвига равновесия исследовано образование молекулярных комплексов у-типа тиоамид-I2. Константы устойчивости молекулярных аддуктов () и количество молекул иода, координируемых одной молекулой тиоамида, рассчитывали с использованием функции «среднеиодное число» () характеризующей количество молекул иода, координируемых одной молекулой тиоамида. Равновесная концентрация иода рассчитывалась из оптической плотности в максимуме полосы поглощения иода (510 нм) по уравнению , где - молярный коэффициент светопоглощения молекулярного иода; - толщина поглощающего слоя. Для каждой равновесной концентрации иода определено соответственное значение функции по уравнению , где CD - общая концентрация тиоамида. Расчет констант устойчивости выполнялся по формуле . Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты спектрофотометрического определения констант устойчивости (lg) у-комплексов тиоамидов (I-VII) с молекулярным иодом в хлороформе

	производные пиридин-2-тиона	производные пиримидин-2-тиона	производные 2-тиоурацила
	I	II	III	IV	V	VI	VII
lg	4.52	3.45	4.93	3.68	2.91	3.14	3.23

Введение электроноакцепторного -CF3 заместителя в пиридиновый и пиримидиновый цикл тиоамидов уменьшает их у-донорные свойства по отношению к молекулярному иоду. Поскольку производные 2-тиоурацила образуют малоустойчивые комплексы с молекулярным иодом, их тиреостатическое действие в организме связано с ингибированием процесса превращения прогормона T4 в гормон T3.

Для исследования окислительно-восстановительного взаимодействия тиоамидов с элементарным иодом в полярных средах (водные и водно-этанольные растворы) нами было применено обратное потенциометрическое (иодиметрическое) титрование. Точку эквивалентности фиксировали иономером «ЭВ-74» в режиме вольтметра и визуально по обесцвечиванию титруемого раствора. Степень протекания реакции () определяли по формуле , где х0 - количество тиоамида, моль; - объем добавленного раствора иода, мл; - концентрация раствора иода, моль-экв/л; - объем раствора тиосульфата натрия, пошедшего на титрование, мл; - концентрация раствора тиосульфата натрия, моль-экв/л.

Таблица 2 - Результаты потенциометрического (иодиметрического) титрования тиоамидов I-IX в водных и водно-этанольных средах

	производные пиридин-2-тиона	производные пиримидин-2-тиона	производные 2-тиоурацила	производные пурин- 6-тиона
	вода	этанол:вода (1:1 об.)
	I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII	IX
	100	85	83,5	71	88	89	86	68	75

Результаты иодиметрического титрования (табл. 2) свидетельствуют о различии в окислительно-восстановительных свойствах и химической активности изучаемых тиоамидов по отношению к молекулярному иоду. Из числа изучаемых тиоамидов, лишь пиридин-2-тион количественно окисляется молекулярным иодом с образованием 2,2/-дитио-бис(2-меркаптопиридиния)трииодида по схеме:

Продукт окисления пиридин-2-тиона координирует избыточное количество иода в составе аниона и способствует выведению его из организма. Соединения I-VI можно отнести к группе тиреостатиков, работающих в организме подобно 1-метилимидазолин-2-тиону. Соединения (I,V,VI) количественно окисляются молекулярным иодом, что служит основой методик их потенциометрического определения.

Протолитические свойства тиоамидов

Знание протолитических свойств необходимо как для аналитического изучения сложных равновесных систем (экстракции, комплексообразования и др.), так и для комплексного исследования молекул соединений, рассматривающихся как биологически активные. Процессы всасывания, распределения, метаболизма и экскреции лекарственных препаратов зависят от протолитических свойств. Кроме того, для подбора оптимальных условий идентификации и количественного определения требуется знание констант протолитических равновесий.

Исследуемые тиоамиды являются амфолитами и их протолитические свойства количественно характеризуются константами кислотности и основности (протонирования, ). Нами определены протолитические свойства тиоамидов (I-IX) потенциометрическим титрованием 0.200 ммоль тиоамида (или его сопряженной кислоты) раствором NaOH. Постоянную ионную силу (м=0.100) поддерживали добавлением к исходному раствору KCl. Значение рН фиксировалось рН-метром «рН-150М». Расчет констант протолитического равновесия исследуемых соединений проводили методом наименьших квадратов (МНК) (табл. 3) по уравнению , где CR - аналитическая концентрация титруемого вещества с учетом разбавления в процессе титрования (моль/л); - степень оттитрованности, рассчитывающаяся по формуле , где СNaOH и VNaOH - концентрация и объем (мл) раствора NaOH, х- количество тиоамида (ммоль).

Обращает на себя внимание близость протолитических свойств производных 2-тиоурацила, а также соединения VIII и его изомера IX. Введение электроноакцепторного -CF3 заместителя в пиридиновый и пиримидиновый цикл тиоамидов повышает приблизительно на два порядка (табл. 3).

Оценка протолитических свойств позволила подобрать оптимальные условия капиллярного электрофоретического разделения и ВЭЖХ определения тиреостатиков, установить соотношение молекулярной и ионной форм препаратов при физиологическом значении рН.

Таблица 3 - Значения констант протолитических равновесий тиоамидов I-IX в водных и водно-этанольных средах, м=0.100 (КСl)

	производные пиридин- 2-тиона	производные пиримидин- 2-тиона	производные 2-тиоурацила	производные пурин 6-тиона
	вода	этанол:вода (1:1 об.)
	I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII	IX
	9.80	7.56	7.22	5.27	8.20	8.40	8.37	8.61	8.50
	1.21	2.41	1.36	2.40	2.13	1.84	1.81	2.56	2.40

Методы идентификации гетероароматических тиоамидов

Электронные спектры поглощения (ЭСП) исследуемых тиоамидов содержат несколько полос поглощения, что позволяет достаточно надежно их идентифицировать (табл. 4). Длинноволновые полосы поглощения гетероароматических тиоамидов представлены р-р* переходами. Поскольку тиоамиды III, IV, VIII и IX малорастворимы в хлороформе была использована добавка полярного растворителя - этанола (5 об.%).

ИК-спектроскопия (4000-400 cм-1) использована в основном как метод установления подлинности, так как совокупность всех полос поглощения, образующая ИК-спектр данного вещества, однозначно определяет его индивидуальность. В ИК-спектрах соединений присутствуют полосы, характерные для групп N-H (3500-3100 cм-1), С-N (936-890 cм-1), а также и C-S (1600-1460 cм-1), характеристическая в присутствии атома азота, т.е. полоса тиоуреидной группировки, которая довольно интенсивна. К колебаниям связи C-S можно отнести полосы поглощения в области 743 см-1 (I), 452-465 см-1 (V-VII), 471 cм1 (III). Идентифицировать соединения V-VII можно по полосе валентных колебаний С=О группы в области 1831-1876 см-1. Такое положение полосы поглощения С=О объясняется ее слабым сопряжением с малоароматичным пиримидиновым циклом.

Таблица 4 - Характеристики спектров поглощения растворов исследуемых соединений

	производные пиридин- 2-тиона	производные пиримидин- 2-тиона	производные 2-тиоурацила	производные пурин 6-тиона
	I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII	IX
	EtOH:H2O (1:1 об.)
лmax, нм (lg е)	270(4.10) 344(3.95)	300(4.16) 365(3.74)	275 (4.41)	290 (4.40)	214(4.49) 271(4.37)	212(4.01) 272(3.88)	214(4.42) 273(4.29)	310* (4.72)	305* (4.82)
CHCl3
лmax, нм (lg е)	290(4.14) 370(3.73)	305(4.28) 370(3.88)	290(4.32) 375(3.55)	295(4.40) 410(3.48)	290 (3.88)	284 (4.20)	285 (4.35)	330 (3.45)	325 (3.53)

* - УФ-спектры соединений VIII и IX получены в 0.1 М NaOH.

Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) изучена подвижность тиоамидов в тонком слое сорбента (силикагеле). Подобраны условия хроматографирования для качественного определения субстанций. В таблице 5 приведены значения подвижности Rf , величины относительного стандартного отклонения sr (n=5, P=0.95) и состав подвижной фазы для хроматографического определения тиоамидов.

Таблица 5 - Результаты хроматографического определения тиоамидов

	производные пиридин- 2-тиона	производные пиримидин- 2-тиона	производные 2-тиоурацила	производные пурин- 6-тиона
	I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII	IX
CHCl3: MeCN:MeOH	9:1:0	1:1:0	7:3:0	3:7:0
Rf	0.55	0.75	0.62	0.68	0.32	0.39	0.29	0.26	0.34
sr	0.03	0.02	0.02	0.02	0.01	0.01	0.01	0.01	0.02

В работе проведено исследование электрофоретической подвижности тиоамидов и подобраны условия их идентификации, установления подлинности и чистоты с использованием системы капиллярного электрофореза «Капель 103Р». Применяли немодифицированный кварцевый капилляр с внутренним диаметром 75 мкм и длиной 60 см (эффективная длина 50 см). Детектировали фотометрически при 253.7 нм. Благодаря высокой растворимости соединений в щелочных средах определение удобно проводить в виде анионов. В качестве ведущего электролита использован боратный буферный раствор (10 мМ буры, рН 9.18). Рабочее напряжение составляло 20 кВ и было постоянным во всех экспериментах.

Таблица 6 - Результаты исследования электрофоретической подвижности тиоамидов (n=4, P=0.95)

	производные пиридин- 2-тиона	производные пиримидин- 2-тиона	производные 2-тиоурацила	производные пурин 6-тиона
	I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII	IX
tR, мин	5.48	6.23	7.15	8.12	7.35	6.64	6.16	8.02	8.47
sr	0.03	0.02	0.02	0.04	0.03	0.02	0.02	0.03	0.04

Данный фоновый электролит при прямом детектировании позволяет получить хорошо сформированные пики. В таблице 6 приведены значения времени выхода tR исследуемых тиоамидов и величины относительного стандартного отклонения sr для четырех параллельных измерений.

Методы разделения и определения гетероароматических тиоамидов

Хронология представленных в обзоре литературы методов разделения и определения тиоамидов свидетельствует о преобладании в современном фармацевтическом анализе хроматографических методов. Метод капиллярного зонного электрофореза, относящийся к перспективным комбинированным методам разделения и анализа, до настоящего времени не использовался для идентификации и определения тиреостатиков - производных 2-тиоурацила.

Нами изучено электрофоретическое поведение 6-замещенных 2-тиоурацилов (V-VII) и подобраны оптимальные условия их разделения и определения (боратный буферный раствор рН=9.18, напряжение 20 кВ) методом КЗЭ. Определение методом внешнего стандарта проводили, используя систему капиллярного электрофореза «Капель-103Р». Электрофореграмма смеси исследуемых соединений представлена на рис. 1.

Рис. 1. Электрофореграмма смеси 1·10-3 М TU, MTU и PTU на фоне боратного буферного раствора (рН 9.18).

Результаты электрофоретического определения TU, MTU и PTU представлены в таблице 7. Предлагаемая методика позволяет оценить содержание веществ в диапазонах концентраций 1.3-103 мкг/мл, 1.4-114 мкг/мл и 1.7-136 мкг/мл, с пределами обнаружения (cmin) 0.93, 0.73 и 0.86 мкг/мл для TU, MTU, PTU соответственно.

Выбраны оптимальные условия определения PTU (рис. 5) в присутствии лекарственных препаратов 1-метилимидазолин-2-тиона (MMI) и 3-метил-1-этоксикарбонилимидазолин-2-тиона (Carb) методом ВЭЖХ при элюировании смесью (75:25) ацетонитрил-фосфатный буферный раствор (рН 6.86). Определение методом внешнего стандарта выполняли на жидкостном хроматографе «Хромос ЖХ-301» с детектором «UVV 104M». Использовали колонку размером 1504.0 мм, заполненную обращенно-фазовым сорбентом Диасфер-110-С18 с размером частиц 5 мкм. Мертвое время колонки составляет 99 с, мертвый объем - 1.32 мл. Скорость подачи подвижной фазы - 1 мл/мин. Детектировали в максимуме светопоглощения PTU (275 нм). Зависимость площади пика от концентрации определяемого вещества линейна в диапазоне концентраций: 0.51-170.23 мг/л. Предел обнаружения PTU составляет 0.26 мг/л. Время удерживания (tR), уравнение градуировочной функции и метрологические характеристики методики приведены в таблице 7.

Рис. 2. Хроматограмма смеси MMI (1), PTU (2) и Carb (3) (7·10-4 М).

Метод ГХ-МС широко используется в аналитической и экспертной практике лекарственных препаратов и предложен в качестве контрольного при определении PTU.

Нами предложены условия ГХ-МС определения 6-н-пропил-2-тиоурацила (линейный диапазон концентраций 10-50 мкг/мл, предел обнаружения 5.22 мкг/мл). Определение проводили на аналитической системе Agilent Technologies GC 6890N/5973N, работавшей в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ и оборудованной капиллярной колонкой НР-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки неподвижной жидкой фазы (5% Phenyl Methyl Siloxane) 0.25 мкм. В качестве газа-носителя использовался гелий (расход 1 мл/мин). Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 30 до 550m/z. Запись хроматограммы вели по полному ионному току. Концентрацию определяли методом внутреннего стандарта с помощью градуировочного графика. Внутренним стандартом служил 1-метил-имидазолин-2-тион. В предлагаемых условиях PTU может быть селективно определен, так как его пик отделяется до базовой линии от пиков TU и MTU, идентификация которых возможна (времена удерживания составляют 10.79 и 11.16 соответственно), но для количественного определения необходима их предварительная химическая дериватизация. Время удерживания и метрологические характеристики ГХ-МС определения PTU представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Уравнения градуировочных функций вида Y=k1X+k2 и метрологические характеристики определения 6-замещенных 2-тиоурацилов методом КЗЭ и 6-н-пропил-2-тиоурацила методами ГХ-МС* и ВЭЖХ-УФ** (n=5, t0.95=2.78)

Тиоамид	tR, мин	Уравнение градуировочной функции	r	Введено, мкг/мл	Найдено, мкг/мл	sr	cmin, мкг/мл
TU	7.35	0.218c+0.07	0.999	12.8	12.5±0.5	0.03	0.93
MTU	6.64	0.175c+0.05	0.999	14.2	13.9±0.5	0.03	0.73
PTU	6.16	0.142c+0.045	0.999	17.0	16.7±0.5	0.02	0.86
PTU*	12.90	1.25c/cвн.ст.-0.45	0.999	30.0	30.1±1.0	0.03	5.22
PTU**	2.52	2.262с+2.83	0.999	17.0	16.5±0.1	0.01	0.26

Примечание. cвн.ст. - концентрация внутреннего стандарта 1-метил-имидазолин-2-тиона в пробе, мкг/мл.

Масс-спектр PTU, полученный в вершине хроматографического пика, представлен на рис. 3.

Рис. 3. Масс-спектр 6-н-пропил-2-тиоурацила: 170 - (МП)+, 155 - (МП-CH3)+; 142 - (МП-C2H4)+, 127 - (МП-C3H7)+.

Таким образом, метод ВЭЖХ-УФ отличается наибольшей чувствительностью и воспроизводимостью результатов определения. Преимуществом КЗЭ является простота разработки методики, малый расход реагентов, высокая эффективность разделения и малая продолжительность анализа.

Исследование связывания тиоамидов с бычьим сывороточным альбумином

Эффективность действия лекарственного препарата, в том числе тиреостатического действия зависит от его распределения в организме. Нами изучено взаимодействие TU, MTU, PTU c транспортным протеином, определены константы ассоциации и число связывающих сайтов молекулы белка. В качестве белка-переносчика выбран бычий сывороточный альбумин (БСА), молекула которого представляет собой полипептидную цепь (585 остатков аминокислот). Раствор альбумина (Alb) обладает природной флуоресценцией, обусловленной наличием триптофановых (2) и тирозиновых (20) фрагментов. Связывание альбумина с тиреостатиком сопровождается гашением флуоресценции вследствие образования устойчивого ассоциата белок-препарат. Равновесие ассоциации альбумина с тиреостатиком характеризуется константой ассоциации , где n - число связывающих сайтов молекулы белка. Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре Varian Cary Eclipse при длинах волн облучающего света 280 (возбуждается тирозиновый и триптофановый фрагменты белка) и 295 нм (возбуждается триптофановый фрагмент белка) при постоянной концентрации альбумина и переменной - препарата (рис. 4). Применяли фосфатный буфер со значением рН 7.37, близким к рН крови. Для построения концентрационной зависимости использовали интенсивность люминесценции при длине волны 346 нм.

Рис. 4. Спектры флуоресценции для системы PTU-Alb при =295 нм (СAlb=1.0·10-5 M; СPTU=0, 3.0·10-6 M, 6.0·10-6 M, 1.0·10-5 M, 2.0·10-5 M, 4.0·10-5 M, 6.0·10-5 M, 1.0·10-4 M, 2.0·10-4 M).

По данным гашения флуоресценции рассчитаны константа ассоциации белок-препарат (1:1) и число связывающих сайтов молекулы белка линейным и нелинейным МНК:

Модель МНК	Уравнение расчета K
линейная
нелинейная

где Imax, Ii - значение интенсивности флуоресценции альбумина в отсутствие и в присутствии препарата; [L] - равновесная концентрация препарата; СL, CAlb - аналитические концентрации препарата и альбумина.

Рассчитанные линейным и нелинейным МНК величины констант ассоциации (lgK) находятся в хорошем соответствии и демонстрируют высокое сродство тиреостатиков, производных тиоурацила, по отношению к сывороточному альбумину (табл. 8). Ассоциация с альбумином реализуется за счет образования водородных связей между атомом кислорода молекул тиоурацилов и протонами триптофанового и тирозинового остатков белка.

Таблица 8 - Результаты определения параметров связывания тиреостатиков, производных 2-тиоурацила с альбумином методом гашения флуоресценции

Соединение	линейная модель (lgK)	коэффициент корреляции (r)	число связывающих сайтов (n)	нелинейная модель (lgK)
TU	4.21 ± 0.14	0.998	0.96	4.30 ± 0.17
MTU	4.17 ± 0.15	0.996	0.98	4.30 ± 0.29
PTU	4.71 ± 0.11	0.998	1.08	4.51 ± 0.25

Использование метода капиллярного зонного электрофореза позволило нам определить константы ассоциации с альбумином депротонированных (при физиологических условиях) форм тиреостатиков. При введении альбумина вследствие связывания ионной формы препарата с белком уменьшается площадь пика и увеличивается площадь пика ассоциата тиреостатика с альбумином (рис. 5).

Измерения проводили, используя систему капиллярного электрофореза «Капель-103Р». Фоновый электролит - фосфатный буферный раствор (pH 7.37). Рабочее напряжение (15 кВ) поддерживалось постоянным во всех экспериментах. В качестве маркера электроосмотического потока (ЭОП) использовали бензиловый спирт. Детектировали фотометрически при 253.7 нм. Константы ассоциации анионных форм препаратов (lgK) можно рассчитать МНК по уравнению , где - среднее число анионов тиреостатика, связанного с молекулой альбумина, (- отношение площадей пиков тиреостатика в присутствии и в отсутствие альбумина; [Alb] - равновесная концентрация белка). В физиологических условиях (рН 7.4) бычий сывороточный альбумин находится преимущественно в анионной форме (pI 4.7). Этим объясняется низкое сродство анионных форм тиреостатиков к сывороточному альбумину (табл. 9). Повышенная липофильность молекулы PTU способствует связыванию препарата с сывороточным альбумином в основном за счет гидрофобного взаимодействия.

Рис. 5. Электрофореграммы для системы PTU-Alb CPTU=2.14·10-4 M;

CAlb: 2.14·10-4 M (1), 4.29·10-4 M (2), 8.57·10-4 M (3), 2.14·10-3 M (4).

Таблица 9 - Результаты определения констант ассоциации анионных форм тиреостатиков, производных тиоурацила с альбумином методом капиллярного зонного электрофореза

Соединение	Время миграции, с	Электрофоретическая подвижность, см2/кВ·с	Константа ассоциации (logK)
PTU	452	-2.1	2.99 ± 0.01
MTU	560	-7.2	1.85 ± 0.04
TU	498	-4.5	2.11 ± 0.02

Практическое использование разработанной ВЭЖХ методики определения 6-н-пропил-2-тиоурацила

Разработанная ВЭЖХ-УФ методика определения PTU апробирована при анализе мочи здорового человека. Анализируемый образец готовили модификацией свежесобранной мочи здорового человека стандартным раствором PTU в фосфатном буфере (рН 6.86). Экстракцию PTU проводили тремя порциями по 5 мл этилацетата (ч.д.а.) из 5 мл мочи. Экстракты упаривали при комнатной температуре, растворяли в 5 мл подвижной фазы и анализировали методом ВЭЖХ. Хроматограмма образца мочи после пробоподготовки (рис. 7) содержит пик соэкстрактов матрицы урины (1-2.4 мин) и хорошо сформированный пик пропилтиоурацила (2.53 мин). Анализ занимает не более 6 минут, хроматографические пики хорошо сформированы и разделяются до базовой линии (рис. 6, табл. 10).

Рис. 6. Хроматограмма образца мочи (введено 2.05 мг/л PTU);

* - всплеск светопоглощения при переключении длины волны детектора.

Таблица 10 - Результаты ВЭЖХ-УФ определения содержания PTU в моче (n=5, P=0.95)

Введено, мг/л	Найдено, мг/л	D, %
2.13	2.05	3.52
3.06	3.08	0.46
3.40	3.28	3.59
4.26	4.35	2.23
5.11	5.24	2.63

ВЫВОДЫ

Исследован ряд тиоамидов-тиреостатиков на основе пиридина, пиримидина, урацила и пурина и оценена их способность координировать молекулярный иод в хлороформном растворе. Установлено, что устойчивость молекулярных аддуктов тиоамидов с иодом уменьшается в ряду пиримидин-2-тион (lg=4.93) пиридин-2-тион (lg=4.52) 4-трифторметил-пиримидин-2-тион (lg=3.68) 5-трифторметил-пиридин-2-тион (lg=3.45) 6-н-пропил-2-тиоурацил (lg=3.23) 6-метил-2-тиоурацил (lg=3.14) 2-тиоурацил (lg=2.91).

Изучены реакции взаимодействия тиоамидов с молекулярным иодом в водных и водно-спиртовых растворах, которые показали различия в их окислительно-восстановительных свойствах и химической активности: пиридин-2-тион, 2-тиоурацил и 6-метил-2-тиоурацил количественно окисляются иодом, что служит основой их иодиметрического определения. Методом потенциометрического титрования определены кислотно-основные свойства тиоамидов-амфолитов (и ). В результате оценки протолитических свойств тиреостатиков установлено соотношение молекулярной и ионной форм препаратов при физиологическом значении рН и подобран ведущий электролит (боратный буферный раствор, рН=9.18) для капиллярного электрофоретического их определения в форме анионов.

Определены константы ассоциации (lgK) молекулярных форм препаратов-тиреостатиков: TU (4.21), MTU (4.17), PTU (4.71) методом гашения люминесценции; а также их ионных форм (2.11, 1.85, 2.99) методом КЗЭ с белком-переносчиком. На основе этих данных проведена оценка степени распределения лекарственных препаратов в организме.

Предложены условия разделения и определения антитиреоидных препаратов - 6-R-2-тиоурацилов, где R=H (TU), CH3 (MTU), н-C3H7 (PTU) методом КЗЭ. Методика позволяет определить вещества в диапазонах концентраций 1.3-103 мкг/мл, 1.4-114 мкг/мл и 1.7-136 мкг/мл, с пределами обнаружения 0.93, 0.73 и 0.86 мкг/мл для TU, MTU, PTU соответственно.

Разработаны методики определения тиреостатика PTU с линейным диапазоном концентраций 10-50 мкг/мл и пределом обнаружения 5.22 мкг/мл (методом ГХ-МС), а также в диапазоне концентраций 0.51-170.23 мг/л с пределом обнаружения - 0.26 мг/л (методом обращенно-фазовой ВЭЖХ). Методика апробирована при анализе образца мочи здорового человека с добавкой PTU. Степень извлечения PTU составила 70±2%, предел обнаружения в моче 0.38 мг/л.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

Долинкин, А.О. Определение гетероароматических тиоамидов, препаратов тиреостатического действия; исследование их -комплексов с молекулярным иодом [Текст] // Международный конгресс студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспектива»: тез. докл. - Нальчик, 2007. - Т.III. - c.269-271.

Черновьянц, М.С. Определение протолитических свойств гетероциклических тиоамидов [Текст] / М.С. Черновьянц, Е.В. Хохлов, А.О. Долинкин // Проблемы теоретической и экспериментальной химии: XVII Российская молодежная научная конференция: тез. докл. - Екатеринбург, 2007. - c. 166-167.

Долинкин, А.О. Квантово-химическое изучение структуры и устойчивости молекулярного комплекса 1-метилимидазолин-2-тиона с иодом в различных средах [Текст] / А.О. Долинкин, Е.В. Хохлов // XIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов»: тез. докл. - Москва, 2007. Электронная.

Долинкин, А.О. Полуколичественное определение 6-пропил-2-тиоурацила методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии с применением оптической денситометрии [Текст] // Труды аспирантов и соискателей Южного федерального университета: сб. трудов. - Ростов-на-Дону, 2007. - Т. XII. - c. 42-43.

Черновьянц, М.С. Хроматографическое определение 6-замещенных 2-тиоурацилов, препаратов тиреостатического действия [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин, И.В. Браславская // Журнал аналитической химии. - 2008. - Т.63. - №9. - С. 930-934.

Черновьянц, М.С. Определение 6-меркаптопурина, препарата цитостатического действия методом капиллярного зонного электрофореза [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин // II Международный форум «Аналитика и аналитики»: тез. докл. - Воронеж, 2008. - Т.2. - С. 489 .

Долинкин, А.О. Определение 6-замещенных 2-тиоурацилов, препаратов тиреостатического действия методом капиллярного зонного электрофореза [Текст] // Труды аспирантов и соискателей Южного федерального университета: сб. трудов. - Ростов-на-Дону, 2008. - Т. XIII. - С. 59-62.

Черновьянц, М.С. Определение константы связывания 6-метил-2-тиоурацила, препарата тиреостатического действия, с сывороточным альбумином методом гашения флуоресценции [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин, А.В. Чернышев // Разработка, исследование, и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. трудов. - Пятигорск, 2009. - С. 357-358.

Черновьянц, М.С. Использование метода гашения флуоресценции для определения константы связывания противолейкемического препарата 6-меркаптопурина с бычьим сывороточным альбумином [Текст] / М.С. Черновьянц, А.В. Чернышев, С.А. Тучков, А.О. Долинкин // III Международная конференция по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды: тез. докл. - Ростов-на-Дону, 2009. - С. 45-46.

Черновьянц, М.С. Разделение и количественное определение тиреостатических препаратов, производных 2-тиоурацила, методом капиллярного электрофореза [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин // VI Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика»: тез. докл. - Йошкар-Ола, 2009. - С. 229.

Черновьянц, М.С. ВЭЖХ разделение и количественное определение препаратов антитиреоидного действия [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин, Е.В. Хохлов // Журнал аналитической химии - 2009. - Т.64. - №8. - С. 850-853.

Черновьянц, М.С. Использование капиллярного электрофореза для определения констант связывания антитиреоидных препаратов, производных тиоурацила, с бычьим сывороточным альбумином [Текст] / М.С. Черновьянц, А.О. Долинкин // III Всероссийская конференция «Аналитика России» с международным участием (к 175-летию со дня рождения Д.И. Менделеева): тез. докл. - Краснодар, 2009. - С. 109.

Черновьянц, М.С. Исследование взаимодействия антитиреоидных препаратов, производных 2-тиоурацила, с бычьим сывороточным альбумином методом гашения флуоресценции [Текст] / М.С. Черновьянц, А.В. Чернышев, А.О. Долинкин // III Всероссийская конференция «Аналитика России» с международным участием (к 175-летию со дня рождения Д.И. Менделеева): тез. докл. - Краснодар, 2009. - С. 431.

Долинкин, А.О. Анализ гетероароматических тиоамидов - препаратов тиреостатического действия (обзор) [Текст] / А.О. Долинкин, М.С. Черновьянц // Химико-фармацевтический журнал - 2010. - Т.44. - №2. - С. 46-53.

Chernov'yants, M.S. Interaction of antithyroid drugs with bovine serum albumin: electrophoretic and fluorimetric study [Текст] / M.S. Chernov'yants, A.O. Dolinkin, A.V. Chernyshev [и др.] // Journal of Pharmaceutical Sciences - 2010. - V.99 - №3. - P.1567-1573.

Размещено на Allbest.ru

...