Различная природа множественной лекарственной устойчивости клеток Serratia Marcescens и Escherichia Coli

Размещено на http://www.allbest.ru/

Различная природа множественной лекарственной устойчивости клеток Serratia Marcescens и Escherichia Coli

Одной из важнейших проблем современной медицинской микробиологии является лекарственная устойчивость бактерий, обусловленная как генами бактериальной хромосомы, так и конъюгативными (трансмиссивными), так и неконъюгативными (нетрансмиссивными) плазмидами. Конъюгативные плазмиды лекарственной резистентности (R- плазмиды) представляют собой коинтеграты, составленные фактором генетического переноса (RTF) и детерминантами резистентности (r), тогда как неконъюгативные плазмиды этого типа в большинстве своем являются нетрансмиссивными детерминантами r, лишенными генетического переноса. Между тем бактерии отдельных видов могут содержать либо только фактор переноса, либо фактор переноса и детерминанты резистентности, сосуществующие в одной и той же бактериальной клетке раздельно и ведущие себя как независимые генетические структуры [Пехов А. П. 1986: 15].

Целью настоящей работы явилось выявление природы множественной лекарственной устойчивости клеток штамма Serratia marcescens 9986 и Escherichia coli 108, выделенных из разных источников.

Как известно, многие штаммы Serratia marcescens, выделенные из природных источников, больных людей и животных, содержат R-плазмиды, которые в основном являются трансмиссивными и имеют достаточно большие молекулярные массы. В ряде случаев были идентифицированы плазмиды, определяющие устойчивость одновременно к 14 антибиотикам [Mendoza et al, 1983: 7; Sleigh J. D. 1984: 1651-1653]. Однако устойчивость к антибиотикам может быть обусловлена и хромосомными генами.

Клетки штамма Serratia marcescens 9986, выделенного из природных источников, оказались устойчивыми к ряду антибиотиков: к эритромицину - 100 мкг/мл, рифампицину - 75 мкг/мл, хлорамфениколу - 50 мкг/мл, ампициллину - 25 мкг/мл, тетрациклину и стрептомицину 15 мкг/мл (за уровень устойчивости принимали минимальную концентрацию антибиотика, при которой наблюдается 90 % выживаемости бактериальных клеток). Мы предположили, что перечисленная выше антибиотикоустойчивость может быть обусловлена как хромосомными, так и плазмидными генами.

Попытки выделить плазмидную ДНК не дали положительных результатов. Это может быть связано как с отсутствием плазмид в исследуемых клетках, так и с тем, что клетки Serratia marcescens конститутивно синтезируют эндонуклеазу, которая затрудняет выделение плазмидной ДНК.

Как известно, обработка клеток агентами, такими как акридиновый оранжевый, этидиум-бромид, митомицин С и другие приводит к элиминации (изгнанию) плазмид из обработанных клеток. Эффективным элиминирующим агентом также является и додецилсульфат натрия. Поэтому с целью выявления плазмид мы провели эксперименты по индуцированной элиминации. В качестве элиминирующего агента использовали этидиум-бромид в концентрации 200 мкг/мл, акридиновый оранжевый в концентрации 100 мкг/мл и додецилсульфат натрия в концентрации 5% и 10%. Выжившие после обработки элиминирующими агентами бактериальные клетки анализировали на "потерю" антибиотикоустойчивости. Оказалось, что практически все выжившие клетки сохранили маркеры резистентности к антибиотикам, при этом минимальные ингибирующие концентрации к антибиотикам остались на прежнем уровне. Эти результаты не дали однозначного ответа на вопрос о том, чем может быть обусловлена устойчивость: только хромосомными генами или хромосомными и плазмидными генами одновременно.

В дальнейшем мы провели эксперименты по конъюгационному переносу. Так как штамм Serratia marcescens 9986 обладает множественной устойчивостью к антибиотикам, нам не удалось подобрать подходящий реципиентный штамм из рода Serratia для осуществления селекции. Учитывая литературные данные о том, что возможен успешный обмен плазмидами между Serratia и Escherichia coli [Dubal-Iflahd Y. et al, 1980: 981], мы провели скрещивания между штаммами Serratia marcescens 9986 и Escherichia coli C600 Rif (50 мкг/мл), используя методику двух- и восемнадцатичасовой конъюгации. Селекцию трансконъюгантов вели отдельно по каждому маркеру антибиотикоустойчивости. Однако ни в одном из скрещиваний выявить трансконъюганты не удалось. Следовательно, если даже исследуемые клетки и содержат плазмиды, они не являются конъюгативными. Для проверки этого предположения мы провели «трехродительские» скрещивания с целью мобилизации неконъюгативных плазмид конъюгативными, используя в качестве мобилизующей плазмиду RP4. Как известно, эта плазмида является конъюгативной, обладает мобилизующими свойствами и широким кругом хозяев. Однако ни в одном случае (и при использовании различных модификаций этих скрещиваний) мы не смогли выявить мобилизацию плазмид.

На основании полученных результатов мы можем сделать вывод о том, что исследуемый штамм Serratia marcescens 9986, по-видимому, не содержит R-плазмид, а множественная устойчивость к антибиотикам: эритромицину, рифампицину, хлорамфениколу, ампициллину, тетрациклину и стрептомицину, обусловлена хромосомными генами.

Исследуя природу лекарственной устойчивости штамма Escherichia coli 108, выделенного от больных животных, мы обнаружили, что клетки этого штамма устойчивы к следующим антибиотикам: к стрептомицину - 100 мкг/мл, ампициллину - 800 мкг/мл и сульфаниламиду (норсульфазолу) - 2000мкг/мл.

Результаты выделения плазмидной ДНК с последующим электрофорезом указывали на присутствие в клетках исследуемого штамма одной или нескольких плазмид. Для установления только плазмидной или одновременно хромосомной и плазмидной природы устойчивости к лекарственным препаратам, мы провели эксперименты по элиминации, используя те же агенты, что и в опытах с Serratia marcescens 9986.

Оказалось, что обработка клеток штамма Escherichia coli 108 додецилсульфатом натрия в концентрациях 5% и 10%, одинаково приводила к почти полной потере (98%) маркера устойчивости к ампициллину (Ар), тогда как маркеры устойчивости к стрептомицину (Sm) и сульфаниламиду (Su) сохранялись. Аналогичные результаты были получены и при обработке клеток акридиновым оранжевым, с той лишь разницей, что частота элиминации маркера ампициллинустойчивости в этом случае была несколько ниже (76%). Частота элиминации маркеров устойчивости к стрептомицину и норсульфазолу равнялась 0,5%. При обработке клеток этидиум бромидом в концентрации 200 мкг/мл наблюдалась противоположная картина: потеря маркера устойчивости к стрептомицину и норсульфазолу составила 58% и 57% соответственно, а потеря маркера устойчивости к ампициллину - лишь 1%. Эти данные послужили первым доказательством того, что множественная устойчивость к лекарственным препаратам в клетках штамма Escherichia coli 108, обусловлена только плазмидными генами. Кроме того, разные частоты элиминации по отдельным маркерам позволили предположить, что в исследуемых бактериях, возможно, присутствует более одной плазмиды, поскольку использованные нами элиминирующие агенты по-разному действуют на конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Известно, что додецилсульфат натрия и акридиновый оранжевый эффективно «излечивают» бактерии от конъюгативных плазмид типа факторов переноса, но не эффективны в отношении неконъюгативных детерминантов лекарственной устойчивости. Этидим бромид, наоборот, хорошо элиминирует неконъюгативные детерминанты устойчивости к антибиотикам, а на конъюгативные плазмиды больших размеров влияния не оказывает.

В дальнейших экспериментах мы определяли принадлежность генов устойчивости к ампициллину, стрептомицину и норсульфазолу к одной или нескольким плазмидам. С этой целью мы проводили скрещивания исследуемого штамма с бесплазмидными штаммами с помощью двух- и восемнадцатичасовой конъюгации. В качестве реципиента использовали клетки штамма Escherichia coli C600Rif. Скрещивания проводили по стандартной методике. Конъюгационные смеси высевали на селективные среды, содержащие соответствующие антибиотики. В качестве контрселективного фактора в среду добавляли рифампицин в концентрации 50 мкг/мл.

Выросшие на селективных средах трансконъюганты проверяли на наличие неселективных маркеров. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Передача маркеров резистентности в реципиентные клетки

Как видно из данных, представленных в таблице, частота передачи маркера Ар достаточно высокая в обоих скрещиваниях, а трансконъюганты по маркерам Sm и Su появились лишь при восемнадцатичасовой конъюгации, причем с одинаковой частотой.

Это свидетельствует о том, что маркер Ар принадлежит конъюгативной плазмиде, а маркеры Sm и Su - неконъюгативной. Передача их в реципиентные клетки происходит благодаря мобилизации на перенос с помощью конъюгативной плазмиды.

Анализ трансконъюгантов по неселективным маркерам показал, что Артрансконъюганты не наследовали ни один из других маркеров. Трансконъюганты Sm наследовали только маркер Su и, наоборот, и ни один из них не наследовал маркер Ар, что указывает на сцепленный характер маркеров Sm и Su.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в клетках Escherichia coli 108 содержатся две плазмиды. Одна из них является конъюгативной, несет ген устойчивости к ампициллину и обладает мобилизационной способностью. Другая плазмида является неконъюгативной, имеет маркеры устойчивости к стрептомицину и норсульфазолу и может переноситься в другие клетки благодаря конъюгативной плазмиде.

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о различной природе лекарственной устойчивости клеток штаммов Serratia marcescens 9986 и Escherichia coli 108. Множественная устойчивость клеток штамма Serratia marcescens 9986 обусловлена хромосомными генами, тогда как клеток штамма Escherichia coli 108 - плазмидным комплексом, компоненты которого функционально различны.

Список литературы

лекарственный резистентность бактерия

1.Пехов А. П. Плазмиды бактерий. - М.: Медицина, 1986. - 224 с.

2.Dubal-Iflahd Y., Raiband P., Tancrede С., Rousseau M. R-Piasmid Transfer for Serratia Liguefaciens to Escherichia Coli in

Vitro and in Vivo in The Digestive Tract of Gnotobiotic Mice Associated with Human Fecal Flora // Infection and Immunity. - 1986. - V. 28. - P. 981-990.

3.Mendoza M. C., Mendez F. L., Lianeza J., Mayo B., Hardsson С. R-Plasmid Diversity in Clinical Isolates of Serratia Marcescens // Microbios Letters. - 1983. - V.22. - P. 7-17.

4.Sleigh J. D. Antibiotic Resistance in Serratia Marcescens // Brit. Med. J. - 1984. - V.5. - P. 1651-1653.

Размещено на Allbest.ru