Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК: 615.273:615.28:615.32:615.451.16:582.998.2

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

фітохімічне вивчення трави деревію звичайного (achillea millefolium mill.) та створення лікарських засобів на його основі

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

Кисличенко Олександра Анатоліївна

Харків - 2013

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі хімії природних сполук Національного

фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України

Науковий доктор фармацевтичних наук, професор

керівник: КОМІСАРЕНКО АНДРІЙ МИКОЛАЙОВИЧ,

Національний фармацевтичний університет,

професор кафедри хімії природних сполук.

Офіційні доктор фармацевтичних наук, професор

опоненти: ВЕТЮТНЕВА НАТАЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА,

Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика,

завідувач кафедри контролю якості і стандартизації лікарських засобів;

кандидат фармацевтичних наук, молодший науковий співробітник

ДЖАН ТЕТЯНА ВІТАЛІЇВНА,

ДУ «Інститут фармакології та токсикології НАМН України».

Захист відбудеться «1» листопада 2013 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою:

61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий «__» вересня 2013 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

професор В.А. Георгіянц

анотація

Кисличенко О.А. Фітохімічне вивчення трави деревію звичайного (Achillea millefolium Mill.) та створення лікарських засобів на його основі. - На правах рукопису.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. - Національний фармацевтичний університет, МОЗ України, Харків, 2013.

Дисертація присвячена системному фітохімічному вивченню біологічно активних речовин квіток, листя, стебел, трави деревію звичайного (Achillea millefolium). Розроблено на основі БАР трави деревію принципові схеми одержання шлункового збору, 60% спиртового рідкого екстракту з кровоспинною активністю та густого модифікованого екстракту з антистафілококовою активністю, досліджено їх хімічний склад, обрано параметри стандартизації та доведено їх фармакологічну активність. У траві, листі, квітках та стеблах A. millefolium виявлено 33 фенольні речовини, 69 терпенів, 4 моноцукри, 18 амінокислот. В 60 % спиртовому рідкому екстракті з трави A. millefolium виявлено 24 речовини фенольної природи, в густих модифікованому екстракті - 100 терпенів. Визначено кількісний вміст основних груп БАР у траві, листі, квітках та стеблах A. millefolium, зборі, 60% спиртовому рідкому і густому моджифікованому екстракті з цієї сировини. Встановлено кореляційні зв'язки між вмістом фенольних сполук, антимікробною та кровоспинною активністю.

Ключові слова: деревій звичайний, трава, листя, квітки, стебла, біологічно активні речовини, збір, густий і рідкий екстракт, антимікробна і кровоспинна активність.

Кисличенко А.А. Фитохимическое изучение травы тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium Mill.) и создание лекарственных средств на его основе. - На правах рукописи.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. - Национальный фармацевтический университет, МЗ Украины, Харьков, 2013.

Диссертация посвящена системному фитохимическому изучению биологически активных веществ цветков, листьев, стеблей, травы тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium) и продуктов их переработки. Разработаны принципиальные схемы получения желудочного сбора с противовоспалительным действием, 60% спиртового жидкого экстракта с кровоостанавливающим действием и густого липофильного модифицированного экстракта с антистафилококковой активностью, исследован их химический состав, избраны параметры стандартизации и доказана их фармакологическая активность.

Проведено исследование качественного и количественного состава терпенов, гидроксикоричных кислот, флавоноидов, хлорофиллов, полисахаридов и моносахаров в траве, листьях, цветках и стеблях Achillea millefolium, сбора, густого и жидкого экстрактов из этого сырья. В траве, листьях, цветках и стеблях Achillea millefolium выявлено 33 вещества фенольной природы, из которых 14 были идентифицированы, 69 терпенов, из которых 49 установлены, 4 моносахара и 18 аминокислот. Фенольные соединения достаточно равномерно накапливаются во всей надземной части тысячелистника обыкновенного, в листьях содержание флавоноидов и производных гидроксикоричных кислот выше, наибольшее содержание терпенов наблюдалось в цветках и листьях, что нужно учитывать при заготовке сырья данного лекарственного растения и использовать обмолоченную траву.

В жидком экстракте из травы Achillea millefolium выявлено 24 вещества фенольной природы, в густых экстрактах - 100 веществ терпеновой природы. Определено количественное содержание основных групп БАВ в объектах исследования. Разработана технология и состав желудочного сбора на основе травы тысячелистника, который внедрен в промышленное производство на ОАО "Лубныфарм". Разработана принципиальная схема получения 60% спиртового жидкого и густого модифицированного экстрактов из травы тысячелистника обыкновенного, изучена кинетика экстракции биологически активных веществ из сырья. Подтверждена возможность создания нового лекарственного средства на основе 60% спиртового жидкого экстракта и антистафилококкового лекарственного средства на основе густого модифицированного экстракта из травы тысячелистника обыкновенного путем изучения соответствующей фармакологической активности.

Определена взаимосвязь технологии, химического состава и фармакологической активности экстрактов. Установлены корреляционные связи между содержанием фенольных соединений, флавоноидов и кровоостанавливающей активностью. При содержании флавоноидов не менее 0,3% наблюдается выраженное кровоостанавливающее действие. Установлены корреляционные связи между содержанием фенольных соединений, терпенов и антимикробной активностью. Удаление фенольных соединений из экстракта повышает антистафилококковую активность почти в два раза. Изучены параметры стандартизации и разработаны МКЯ на сбор, проекты МКЯ на 60% спиртовой жидкий и густой модифицированный экстракты из травы тысячелистника обыкновенного. Проведены валидационные исследования аналитических методик количественного определения дубильных веществ в растительном сборе и флавоноидов в 60% спиртовом жидком экстракте из травы тысячелистника обыкновенного. Изучены валидационные характеристики - линейность, правильность и сходимость, робастность, внутреннелабораторная точность.

Подтверждена возможность создания нового лекарственного средства с кровоостанавливающим действием на основе 60% спиртового жидкого экстракта и оригинального антистафилококкового лекарственного средства на основе густого липофильного модифицированного экстракта травы тысячелистника обыкновенного путем изучения соответствующей фармакологической активности.

Ключевые слова: тысячелистник обыкновенный, трава, листья, цветки, стебли, биологически активные вещества, сбор, густой и жидкий экстракт, антимикробная и кровоостанавливающая активность.

Kyslychenko О.А. A phytochemical study of yarrow grass (Achillea millefolium Mill.) and new remedies creation on its basis. - A manuscript.

The dissertation for a candidate scientific degree in pharmacy 15.00.02 - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. - National university of Pharmacy, Ministry of Public Health of Ukraine, Kharkiv, 2013.

The dissertation is devoted to a systemic phytochemical study of biologically active substances from flowers, leaves and stems as well as yarrow herb (Achillea millefolium), working out principial schemes of getting gastric species as well as liquid extract with haemostatic activity and thick modified extract with antistaphylococcic activity on its basis. Their chemical composition, standardization parameters and pharmacological activity was studied. 33 phenolic compounds, 69 terpenes, 4 monosugars, 18 aminoacids were found in grass, leaves, flowers and stems. 24 phenolic compounds were found in liquid extract from Achillea millefolium grass, 100 terpenes were found in thick extract. The quantitative content of the main groups of biologically active substances in grass, leaves, flowers, and stems of Achillea millefolium as well as their content in species, thick and liquid extracts obtained from this plant raw material was identified. The correlations between phenolic compounds content and heamostatic activity and between phenolic compounds content and antimicribial activity were found.

Key words: yarrow, grass, leaves, flowers, stems, biologically active substances, species, thick and liquid extract, antimicrobial and haemostatic activity.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Лікування інфекційних захворювань та запальних процесів залишається актуальною проблемою сучасної фармації. За даними ВООЗ за останні роки кількість осіб, які були госпіталізовані з інфекціями, викликаними Staphylococcus aureus, збільшилась більш, ніж у два рази, крім того, ці інфекції займають перше місце серед хвороб, зараження якими найчастіше здійснюється у медичних закладах. Смертність від золотистого стафілококу перевищує смертність від СНІДу. Провідні країни світу витрачають мільярди доларів для боротьби з ним, при цьому витрати постійно зростають. За останній час кількість резистентних штамів S. aureus до вже існуючих лікарських препаратів значно збільшилась. У пошуках ефективних засобів боротьби з інфекціями одним з найбільш перспективних напрямків є розробка лікарських засобів, які виявляють поряд з антибактеріальною дією також імуномодулюючу активність, що характерно для рослинних засобів.

У народній та офіційній медицині широко застосовується трава деревію звичайного (д. звичайного) - Achillea millefolium Mill., як протизапальний, кровоспинний та антимікробний засіб. На території України зростає 19 видів деревію. Дослідження хімічного складу трави A. millefolium, яка містить ефірну олію, флавоноїди, дубильні та гіркі речовини, вітамін К та органічні кислоти, проведені тільки для сировини, а поглиблених даних про хімічний склад квіток, листя та стебел немає.

На ринку України та Російської Федерації існує близько 20 препаратів (Ротокан, Вундехіл тощо), до складу яких входять біологічно активні речовини (БАР) трави деревію, які в основному представлені зборами, тоді як сировина має широкий спектр фармакологічної дії та може слугувати основою для створення вітчизняних галенових та новогаленових антимікробних та кровоспинних лікарських засобів. Поглиблене фітохімічне вивчення БАР надземних органів д. звичайного та створення на їх основі нових лікарських засобів з антимікробною та кровоспинною дією є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом проблемної комісії «Фармація» МОЗ та АМН України і є фрагментом комплексної науково - дослідної роботи Національного фармацевтичного університету «Фармакогностичне вивчення біологічно активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження» (номер державної реєстрації 0103U000476).

Мета і задачі дослідження. Метою нашої роботи було системне фітохімічне вивчення біологічно активних речовин трави деревію звичайного (A. millefolium) та продуктів їх переробки для створення на їх основі нових лікарських засобів з антимікробною та кровоспинною дією.

Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

• проаналізувати та узагальнити дані первинних джерел з ботанічної характеристики, ареалів розповсюдження, вивчення хімічного складу та застосування у медицині представників роду Achillea;

• провести попереднє дослідження хімічного складу трави, листя, квіток та стебел д. звичайного, збору, густого і рідкого екстрактів з трави A. millefolium та ідентифікувати їх основні БАР;

• визначити кількісний вміст основних груп БАР у траві, листі, квітках та стеблах д. звичайного, у зборі та густому ліпофільному і рідкому екстракті з трави A. millefolium;

• розробити склад та технологію збору на основі трави деревію;

• розробити принципову схему одержання густого ліпофільного та рідкого екстрактів з трави A. millefolium та вивчити кінетику екстракції БАР;

• визначити взаємозв'язок технології, хімічного складу та фармакологічної активності екстрактів;

• вивчити параметри стандартизації, розробити методики контролю якості (МКЯ) на збір, проекти МКЯ на густий і рідкий екстракти з трави деревію;

• за результатом вивчення фармакологічної активності екстрактів, визначити перспективи створення на їх основі нових лікарських засобів.

Об'єкт дослідження: системне фітохімічне вивчення трави, листя, квіток, стебел A. millefolium, шлункового збору, 60% та 96% спиртових рідких та густого модифікованого екстрактів з трави д. звичайного.

Предмет дослідження: показники якості, виявлення та ідентифікація БАР трави, листя, квіток, стебел A. millefolium, шлункового збору, 60% та 96% спиртових рідких та густого модифікованого екстрактів з трави д. звичайного, якісний склад та кількісний вміст БАР, вивчення їх антимікробної та кровоспинної активності.

Методи дослідження: якісний склад та кількісний вміст БАР визначали фармакопейними методами за допомогою тонкошарової (ТШХ), паперової (ПХ), високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), газової хроматографії (ГХ), хромато-мас-спектрометрії, титриметрії, гравіметрії та спектрофотометрії (СФ). Фармакологічні дослідження проводили in vitro та in vivo: антибактеріальну активність вивчали методом дифузії в агар, кровоспинну активність - на мишах. Статистичну обробку результатів досліджень проводили з використанням персонального комп'ютера та програмного забезпечення Microsoft Excel 7.0, GraphPad Prism 5.0 та пакету прикладних програм “STATISTIKA”.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено якісний склад та кількісний вміст БАР у надземних органах A. millefolium. У листі, квітках, стеблах та траві A. millefolium були виявлені моноцукри, полісахариди, амінокислоти, органічні кислоти, похідні гідроксикоричних кислот, кумарини, флавоноїди, терпени, хлорофіли, стероїди та фосфоліпіди.

У результаті дослідження амінокислотного складу квіток д. звичайного вперше встановлено наявність 18 вільних та 17 зв'язаних амінокислот, дев'ять з яких є незамінними - треонін, валін, метіонін, ізолейцин, лейцин, фенілаланін, гістидин, лізин і аргінін. У листі, квітках, стеблах і траві д. звичайного виявлено 33 фенольні сполуки, 14 з яких ідентифіковано, та 69 речовин терпенової природи, 49 з яких ідентифіковано. Усі ці речовини у листі, квітках і стеблах A. millefolium були виявлені вперше. В усіх об'єктах спостерігався високий вміст хлорогенової та похідних кофейної кислот, апігеніну, лютеоліну та їх глікозидів. Основними компонентами ефірної олії трави деревію звичайного є 1,8-цинеол, камфора, борнеол, терпінен-4-ол, б-терпінеол та каріофіленоксид. Вивчення антимікробної активності екстрактів з надземних органів A. millefolium показало активність по відношенню до S. aureus, B. subtilis та E. сoli. Вперше встановлено, що найбільшу антимікробну активність мав 96% спиртовий рідкий екстракт та при збільшенні вмісту фенольних сполук у екстрактах їх активність зменшувалася, що було враховано при розробці лікарських засобів.

Вперше виявлено та вивчено гемостатичну активність 60% спиртового рідкого екстракту з трави деревію. У 60% спиртовому рідкому екстракті уперше було виявлено 24 речовини, з яких 9 були ідентифіковані, встановлено їх кількісний вміст та динаміку екстрагування. Відмічено, що домінуючими речовинами є хлорогенова кислота та похідні кофейної кислоти, лютеолін, апігенін та їх глікозиди. Вперше вивчено ізопреноїдний склад та антимікробну активність густого модифікованого екстракту з трави д. звичайного, що було використано при розробці МКЯ на одержаний новий фітозасіб. Новизну досліджень підтверджено та захищено патентами України на винахід та корисну модель № 68825, 41309.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблений шлунковий збір впроваджено у промислове виробництво ВАТ «Лубнифарм», на який отримано реєстраційне посвідчення № UA/12584/01/01, що розширило номенклатуру вітчизняних лікарських препаратів для лікування захворювань шлунково-кишкового тракту.

Враховуючи результати кількісного вмісту фенольних сполук, вперше встановлено, що вони досить рівномірно накопичуються в усій надземній частині рослини, тільки в листі вміст флавоноїдів та похідних гідроксикоричної кислоти дещо вищий. Найбільший вміст терпенів спостерігався в квітках та листі д. звичайного, що потрібно враховувати при заготівлі сировини даної лікарської рослини. Тому запропоновано в якості сировини використовувати обмолочену траву деревію звичайного, що дозволить підвищити якість сировини для виготовлення лікарських форм.

На підставі проведених досліджень встановлені критичні точки при виробництві рослинного шлункового збору, які увійшли до технологічного промислового регламенту. Визначені критичні параметри виробництва рослинного збору. Розроблено методи якісного та кількісного аналізу діючих речовин шлункового збору, які закладені в МКЯ. Запропоновано перспективну методику кількісного визначення дубильних речовин у шлунковому зборі з використанням спектрофотометричного методу. Проведено валідаційні дослідження аналітичної методики кількісного визначення дубильних речовин рослинного збору та вивчено валідаційні характеристики - лінійність, правильність та збіжність, робасність, внутрішньолабораторну точність. Дана методика може бути коректно відтворена в умовах різних лабораторій.

Вперше розроблено принципову схему одержання 60% спиртового рідкого екстракту з трави д. звичайного методом шестикратної перколяції для створення нового лікарського засобу з гемостатичною активністю.

Вперше проведено валідацію методики кількісного визначення флавоноїдів в 60% спиртовому рідкому екстракті з трави д. звичайного, яка покладена в основу його кількісної стандартизації.

Вперше математичними та статистичними методами встановлено, що оптимальна кратність спиртової екстракції з трави A. millefolium складає 3 рази, що враховано у технологічному процесі виробництва густого модифікованого екстракту.

Вперше розроблено принципову схему одержання густого модифікованого екстракту з трави д. звичайного з використанням гексану та 4% розчину цинку сульфату для створення нового лікарського засобу з антимікробною активністю.

За результатами досліджень розроблено проекти МКЯ на 60% спиртовий рідкий екстракт з кровоспинною дією та густий модифікований екстракт з антистафілококовою активністю на основі трави д. звичайного.

Результати дослідження трави, квіток, листя та стебел A. millefolium, а також шлункового збору, 60% спиртового рідкого та густого модифікованого екстрактів впроваджено у науково-дослідну роботу та навчальний процес: кафедри якості, стандартизації та сертифікації ліків Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації при Національному фармацевтичному університеті; кафедри фармакогнозії з курсом ботаніки Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського; кафедри фармакогнозії і ботаніки Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького; кафедри фармацевтичної хімії та фармакогнозії Луганського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Безпосередньо автором здійснено інформаційний пошук та аналіз літературних даних за темою дисертації; попереднє дослідження якісного складу та кількісного вмісту БАР в об'єктах дослідження; вивчено фенольний і терпеноїдний склад квіток, листя, стебел, трави A. millefolium, шлункового збору, 60% спиртового рідкого та густого модифікованого екстрактів з трави д. звичайного; розроблено склад та технологію одержання шлункового збору, до складу якого входить трава д. звичайного (реєстраційне посвідчення № UA/12584/01/01); розроблено принципову схему одержання 60% спиртового рідкого екстракту та густого модифікованого екстракту з трави A. millefolium з використанням гексану та 4% розчину цинку сульфату; проведено валідацію методики кількісного визначення флавоноїдів в 60% спиртовому рідкому екстракті з трави д. звичайного та дубильних речовин в шлунковому зборі, яка покладена в основу їх стандартизації; розроблені МКЯ на шлунковий збір та проекти МКЯ на 60% спиртовий рідкий екстракт з кровоспинною дією та густий модифікований екстракт з антистафілококовою активністю.

У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертанту належить фактичний матеріал і основний творчий доробок.

Апробація результатів дисертації.

Результати наукових досліджень, що увійшли до дисертації, оприлюднені на VII Международной научно-практической конференции «Студенческая медицинская наука ХХІ века» (Витебск, 2007); 6-th International Symposium on Chromatography of Natural Products (ISCPN) (Lublin, 2008); Международной научно-практической конференции «Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании» (Белгород, 2008); Ювілейній науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій пам'яті кандидата фармацевтичних наук, доцента Михайла Івановича Борисова (до 80-річчя від дня народження) (Харків, 2009); 42nd IUPAC Congress Chemistry solutions (Glasgow, 2009); 3-й науково-практичній конференції з міжнародною участю «Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів» (Тернопіль, 2009); VIII Съезде фармацевтических работников Республики Беларусь (Витебск, 2010); ІІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції «Хімія природних сполук» (Тернопіль, 2012); The 7th International Congress of Young Medical Scientists (Poznan, 2007), ХІІІ, ХІV, ХV International Congresses Phytopharm (St-Petersburg, 2010, Bonn, 2009 and Nuremberg, 2011); The 2nd and 3nd International Symposium on Medicinal Plants, their Cultivation and Aspects of Uses (Petra, 2010, 2012); I Міжнародній науково-практичній конференції «Функціональні харчові продукти - дієтичні добавки - як дієвий засіб різнопланової профілактики захворювань» (Харків, 2013).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 27 наукових робіт, з яких 8 статей у наукових фахових виданнях України та інших держав, 2 патенти України на корисну модель та 17 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 201 сторінці машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, трьох розділів експериментальних досліджень, загальних висновків, 11 додатків, списку використаних літературних джерел. Обсяг основного тексту роботи складає 127 сторінок. Робота ілюстрована 9 рисунками та 31 таблицею. Список використаних джерел літератури включає 169 найменувань, серед яких 99 кирилицею та 70 латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

деревія збір трава хімічний

Деревій звичайний - джерело біологічно активних речовин та лікарських препаратів (огляд літератури). В огляді літератури наведено ботанічну характеристику, відомості про хімічний склад та розповсюдження рослин роду Achillea та їх використання у офіційній та народній медицині. Рід Achillea включає близько 100 видів, з яких хімічний склад частково досліджений лише в 20 видах. Встановлено, що ефірна олія різних видів Achillea відрізняється за хімічним складом, хоча у всіх ефірних оліях переважають монотерпеноїди. Частково вивчений склад фенольних сполук для деяких представників роду Achillea.

Основна терапевтична активність лікарських засобів д. звичайного - протизапальна, болетамувальна, бактерицидна та кровоспинна.

Проведений аналіз літературних даних показав, що вивчений лише хімічний склад трави д. звичайного, але немає даних щодо складу БАР у квітках, листі та стеблах. Це створює передумови для більш поглибленого фітохімічного вивчення цієї лікарської рослинної сировини для створення нових лікарських засобів з гастропротекторною, кровоспинною та антистафілококовою активністю.

Дослідження хімічного складу трави деревію звичайного. Попереднє дослідження хімічного складу трави, листя, квіток та стебел д.звичайного, яке проводили загальноприйнятими методами, показало наявність моноцукрів, полісахаридів, амінокислот, гідроксикоричних кислот, кумаринів, флавоноїдів, терпенів, стероїдів, хлорофілів та фосфоліпідів. Проведено вивчення хімічного складу фенольних сполук надземних органів A. millefolium методами високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), терпенового складу - методом хромато-мас-спектрометрії. У цілому в досліджуваних об'єктах було виявлено 33 речовини фенольної природи, з яких 14 були ідентифіковані. Всі ці речовини у листі, квітках та стеблах д. звичайного виявлені вперше. В усіх об'єктах спостерігався високий вміст хлорогенової кислоти та похідних кофейної кислоти, апігеніну, лютеоліну та їх глікозидів. Загалом було виявлено 69 речовин терпенової природи, 49 з яких ідентифіковано. Основними компонентами ефірної олії надземних органів A. millefolium є 1,8-цинеол, камфора, борнеол, терпінен-4-ол, б-терпінеол та каріофіленоксид.

Кількісний вміст БАР у надземних органах д. звичайного визначали спектрофотометричним методом, вміст ефірної олії - методом гідродистиляції згідно ДФУ (табл. 1).

Таблиця 1

Кількісний вміст БАР у траві д. звичайного (може краще дві таблиці?)

Група БАР Метод аналізу	Кількісний вміст, % (в перерахунку на суху сировину)
	Трава	Листя	Квітки	Стебло
Вихід спиртового екстракту, %	1,92	1,98	1,29	1,06
Похідні гідроксикоричної кислоти:
Спектрофотометричний метод у перерахунку на хлорогенову кислоту (327 нм)	0,468±0,011	0,499±0,023	0,47±0,041	0,466±0,021
Флавоноїди:
Спектрофотометричний метод у перерахунку на рутин (415 нм)	0,0315±0,016	0,049±0,006	0,035±0,003	0,032±0,004
Фенольні сполуки:
Спектрофотометричний метод у перерахунку на галову кислоту (270 нм)	0,410±0,015	0,320±0,002	0,332±0,004	0,279±0,003

Враховуючи результати кількісного вмісту фенольних сполук встановили, що вони досить рівномірно накопичуються в усій надземній частині рослини, в листі вміст флавоноїдів та похідних гідроксикоричної кислоти є дещо вищим. Найбільший вміст терпенів спостерігався в квітках та листі A. millefolium. Результати досліджень потрібно враховувати при заготівлі сировини даної лікарської рослини.

Вивчення антимікробної активності екстрактів з надземних органів A. millefolium проводили методом дифузії в агар в Інституті мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова під керівництвом к. біол. н. Осолодченко Т.П. Встановлено, що екстракти виявляють антимікробну активність по відношенню до S. aureus, B. subtilis та E. сoli.

Враховуючи вихід спиртових екстрактів, одержаних з різних видів досліджуваної сировини, вміст БАР та антимікробну активність, доцільно використовувати обмолочену траву деревію звичайного.

Хімічні, технологічні та фармакологічні аспекти одержання лікарських засобів з трави деревію. На основі проведених досліджень розроблено шлунковий збір (реєстраційне посвідчення № UA/12584/01/01), який впроваджено у промислове виробництво на ВАТ «Лубнифарм». На підставі проведених досліджень встановлені параметри контролю при виробництві рослинного шлункового збору, які увійшли до технологічного промислового регламенту. Визначені критичні параметри виробництва рослинного збору.

Розроблено методи якісного та кількісного аналізу діючих речовин шлункового збору, які закладені в МКЯ. Запропоновано методику кількісного визначення дубильних речовин у шлунковому зборі з використанням спектрофотометричного методу. Проведено її валідаційні дослілження, зокрема вивчено лінійність, правильність та збіжність, стабільність, внутрішньолаборатрну точність.

Проведено вивчення технології одержання екстрактів з трави A. millefolium. Враховуючи вміст основних груп БАР (табл. 2) та антимікробну активність екстрактів з трави деревію (табл. 3), хіміко-технологічні і токсикологічні аспекти, встановлено, що найбільш перспективними екстрагентами є 96% і 60% етанол.

Найбільшу антимікробну активність виявляв 96% спиртовий екстракт, тоді як при збільшенні вмісту фенольних сполук у інших екстрактах їх активність зменшувалася, що потрібно враховувати при розробці лікарських засобів. Враховуючи результати хімічного та мікробіологічного дослідження екстрактів з трави деревію, перспективним є створення на основі 96% спиртового екстракту нового лікарського засобу з антимікробною активністю та на основі 60% спиртового екстракту, який містив найбільшу кількість фенольних сполук, нового лікарського засобу з кровоспинною та протизапальною активністю.

Вперше розроблено принципову схему одержання 60% спиртового рідкого екстракт з трави д. звичайного, яку зображено на рис. 1 для створення нового лікарського засобу з гемостатичною активністю.

В 60% спиртовому рідкому екстракті вперше було виявлено 24 речовини, з яких 9 були ідентифіковані, та встановлено їх кількісний вміст і динаміку екстрагування. Домінуючими речовинами серед гідроксикоричних кислот були хлорогенова кислота та похідні кофейної кислоти, серед флавоноїдів - лютеолін, апігенін та їх глікозиди.

Таблиця 2

Кількісний вміст БАР в екстрактах з трави д. звичайного

Об'єкт дослідження (екстракти з трави деревію)	Кількісний вміст, %
	Сухий залишок, % (згідно з ДФУ)	Хлорофіли а та b (СФ)	Гідроксикоричні кислоти (СФ у перерахунку на хлорогенову кислоту)	Флавоноїди (СФ у перерахунку на рутин)	Сума фенольних сполук ( СФ у перерахунку на галову кислоту)
96 % спиртовий екстракт	2,12	0,34±0,02	4,23±0,02	3,31 ±0,02	8,31±0,03
70 % спиртовий екстракт	3,05	0,46±0,03	4,11±0,02	3,55±0,02	11,92±0,02
60 % спиртовий екстракт	3,56	-	3,66±0,03	3,95±0,02	21,84±0,03
Етилацетатний екстракт	1,34	0,49±0,02	6,54±0,01	2,79±0,01	13,41±0,02
Ацетоновий екстракт	0,63	0,18±0,02	-	-	-
Гексановий екстракт	0,43	0,58±0,02	-	-	-
Бензиновий екстракт	0,33	0,61±0,01	-	-	-
Хлороформний екстракт	0,92	1,08±0,01	-	-	-
Водний екстракт	3,45	-	6,24±0,02	1,72±0,03	11,35±0,03

Таблиця 3

Антимікробна активність екстрактів з трави деревію звичайного

Досліджуваний екстракт з трави деревію	Діаметри зон затримки росту мікроорганізма, в мм
	S.aureus АТСС 25923	E. coli АТСС 25922	B.subtilis ATCC 6633	Proteus vulgaris 4636	Candida albicans АТСС 885/653	P.aeruginosa АТСС 27853	S.pyogenes 2432
96 % спиртовий екстракт	24	16	16	12	11	12	13
Етилацетатний екстракт	22	14	17	11	13	12	14
60 % спиртовий екстракт	20	17	13	11	-	12	-
Водний екстракт	17	12	18	-	-	-	-
70 % спиртовий екстракт	22	12	15	-	14	-	12
Гексановий екстракт	23	17	14	11	11	13	12
Ацетоновий екстракт	20	15	16	12	11	-	12
Бензиновий екстракт	22	14	17	11	-	-	-
Хлороформний екстракт	19	11	13	-	-	-	-

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Принципова схема одержання 60% спиртового рідкого екстракту з трави д. звичайного.

Найбільший вміст фенольних речовин притаманний для екстракту №5 та №6. Вперше проведено валідацію методики кількісного визначення флавоноїдів у 60% спиртовому рідкому екстракті з трави д. звичайного, яка покладена в основу його стандартизації, вивчено його гемостатичну активність (табл. 4).

Таблиця 4

Вивчення кровоспинної активності рідких 60% спиртових екстрактів з трави д. звичайного

Експериментальні групи	Показники
	Маса крововтрати, мг	Час зупинки кровотечі, сек
Інтактні	34,0 ± 2,53	89,2 ± 9,1
Контроль	18,6 ± 0,98 *	36,2 ± 3,8 *
Екстракти деревію	№ 1	62,8 ± 15,7	63,0 ± 12,5
	№ 2	47,0 ± 10,9	54,4 ± 12,7
	№ 3	13,8 ± 2,73 *	31,0 ± 7,4 *
	№ 4	34,0 ± 6,0	46,6 ± 5,4 *
	№ 5	22,4 ± 3,9 *	36,8 ± 1,4 *
	№ 6	11,0 ± 2,44 *	24,0 ± 1,1 *

В результаті вивчення кровоспинної активності рідких екстрактів з трави д. звичайного встановлено, що найбільшу активність виявив екстракт №6. Збільшення вмісту суми фенольних сполук підвищує кровоспинну активність. Таким чином, для одержання кровоспинного лікарського засобу з трави A. millefolium розроблено спосіб одержання рідкого екстракту з використанням 60% етанолу методом шестикратної перколяції.

Оскільки при вивченні екстрактів, одержаних з використанням розчинників різної полярності, оптимальним екстрагентом для одержання антимікробного лікарського засобу був 96% етанол, то для оптимізації кратності спиртової екстракції у кожній відібраній пробі на кожній з стадій екстракції проведено визначення сухого залишку та кількісного вмісту основних груп БАР, які були ідентифіковані в екстрактах, та було розраховано рентабельність кожної стадії (miекстракту/miспирту) по кожному з показників, а також за допомогою пакету прикладних програм «STATISTIKA» виведено залежність цих факторів від кратності екстракції та визначено оптимальний час екстракції. Враховуючи ці показники, оптимальна кратність спиртової екстракції з трави д. звичайного складає 3 рази.

Фенольний склад густого спиртового екстракту з трави деревію вивчали методом ВЕРХ. В цілому було виявлено 33 речовини, з яких 13 були ідентифіковані, та встановлено їх кількісний вміст. Оскільки фенольні сполуки знижують антимікробну активність екстрактів, то було б доцільно видалити їх, тому було розроблено принципову схему одержання густого модифікованого екстракту з трави A. millefolium, з використанням гексану та 4% розчину цинку сульфату, як зазначено на рис. 2.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Принципова схема одержання густого модифікованого екстракту з трави д. звичайного.

В густому спиртовому екстракті з трави A. millefolium виявлено 66 речовин, 51 з яких ідентифіковано (88,4%); в густому екстракті, який модифікований 4% розчином цинку сульфату, - 25 речовин, 23 з яких ідентифіковано. В 96% екстрактах з трави д. звичайного домінуючими речовинами були 1,8-цинеол, камфора та борнеол. В густому спиртовому екстракті з трави д. звичайного вміст терпеноїдів складав 0,82±0,02%, а вміст хлорофілів a та b - 1,12±0,01%; в густому екстракті, який модифікований 4% розчином цинку сульфату, вміст терпеноїдів - 1,29±0,02%, хлорофілів a та b - 3,52±0,01 % відповідно, в густому екстракті хлорофіліпту, що був використаний як препарат порівняння, вміст терпеноїдів - 4,29±0,03%, хлорофілів a та b - 3,31±0,01%.

В результаті вивчення антимікробної активності екстрактів (табл. 6) встановили, що густий модифікований екстракт з трави A. millefolium, у технології якого використовували 4% розчин цинку сульфату, та хлорофіліпт виявляли антимікробну активність на одному рівні по відношенню до S. aureus та B. subtilis.

Таблиця 6

Антимікробна активність 1% спиртових розчинів екстрактів з трави деревію та густого екстракту хлорофіліпту

Мікроорганізм	Діаметр зони затримки росту, мм
	96 % спиртовий екстракт з трави деревію	Густий модифікований екстракт з трави деревію	Хлорофіліпт
S. aureus ATCC 25923	20	28	23
S. aureus ATCC 6538	19	25	24
E. coli ATCC 25922	16	13	14
P. vulgaris 4636	ріст	ріст	ріст
B. subtilis ATCC 6633	17	15	15
P. aeruginosa ATCC 27853	ріст	ріст	ріст
P. aeruginosa ATCC 9027	ріст	ріст	ріст
S. pyogenosa 2432	14	12	13
C. albicans 885/653	ріст	ріст	ріст

Хімічним та мікробіологічним шляхом встановили можливість створення нового густого модифікованого екстракту з трави д. звичайного з використанням гексану та 4% розчину цинку сульфату.

Розробка методик контролю якості одержаних лікарських засобів.

Розроблено МКЯ на шлунковий збір, який впроваджено у промислове виробництво на ВАТ «Лубнифарм». Основні показники може вказати так як для екстрактів?

Розроблено МКЯ на шлунковий збір, який впроваджено у промислове виробництво на ВАТ «Лубнифарм». Розроблено проекти МКЯ на рідкий та густий модифікований екстракт з трави A. millefolium.

Якість рідкого екстракту запропоновано контролювати за описом, ідентифікацію проводити за вмістом флавоноїдів та терпенів, контролювати відносну густину екстракту, вміст етанолу, метанолу та 2-пропанолу, сухого залишку та важких металів, мікробіологічну густину, кількісне визначення за вмістом флавоноїдів (не менше 0,15%).

З трави д. звичайного спиртовою екстракцією були одержані чотири серії густого екстракту, в технології якого використовували 4% розчин цинку сульфату, розроблено проект МКЯ згідно ДФУ та проведено аналіз серій згідно нього. Контролювати якість екстракту запропоновано за описом, розчинністю в спирті, ефірі, хлороформі та воді, ідентифікацію проводити за вмістом порфіринів, цинку та терпенів, контролювати залишкові кількості органічних розчинників (гексану та спирту), вміст сухого залишку та важких металів, мікробіологічну чистоту та кількісне визначення за антимікробною активністю та вмістом основних терпенів. Всі отримані екстракти відповідали вимогам розроблених проектів МКЯ.

ВИСНОВКИ

У роботі наведено вирішення наукової задачі з системного фітохімічного вивчення біологічно активних речовин (БАР) надземних органів та трави деревію звичайного та продуктів їх переробки, розроблено на їх основі принципові схеми одержання шлункового збору, 60% спиртового рідкого екстракту з кровоспинною активністю та густого модифікованого екстракту з антистафілококовою активністю, досліджено їх хімічний склад, вивчено параметри стандартизації та фармакологічну активність.

1. Проведено дослідження якісного складу терпенів, гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, хлорофілів, полісахаридів та моноцукрів, амінокислот у траві, листі, квітках та стеблах A. millefolium, зборі, 60% спиртовому рідкому та густому модифікованому екстрактах з трави д. звичайного.

2. У траві, листі, квітках та стеблах A. millefolium виявлено 33 речовини фенольної природи, з яких 14 були ідентифіковані, 69 терпенів, 49 з яких було ідентифіковано, 4 моноцукри та 18 амінокислот. Вперше в 60% спиртовому рідкому екстракті з трави д. звичайного виявлено 24 речовини фенольної природи, в густому модифікованому екстракті - 100 речовин терпенової природи.

3. Визначено кількісний вміст основних груп БАР у траві, листі, квітках та стеблах д. звичайного, зборі, 60% спиртовому рідкому та густому модифікованому екстрактах з трави A. millefolium. Фенольні сполуки досить рівномірно накопичуються в усій надземній частині деревію звичайного, в листі вміст флавоноїдів та похідних гідроксикоричної кислоти є вищим, найбільший вміст терпенів спостерігався в квітках та листі, що потрібно враховувати при заготівлі сировини даної лікарської рослини.

4. Вперше розроблено склад та технологію шлункового збору на основі трави деревію, який впроваджено у виробництво на ВАТ “Лубнифарм”( реєстраційне посвідчення № UA/12584/01/01).

5. Вперше розроблено принципову схему одержання густого модифікованого та рідкого екстрактів з трави д. звичайного, вивчено кінетику екстракції БАР з сировини, встановлено оптимальну кратність спиртової екстракції, яка становить 3 рази.

6. Визначено взаємозв'язок технології, хімічного складу та фармакологічної активності екстрактів. Встановлено кореляційні зв'язки між вмістом фенольних сполук, флавоноїдів та кровоспинною активністю. При вмісті флавоноїдів не менше 0,3% спостерігається виражена кровоспинна активність. Встановлено кореляційні зв'язки між вмістом фенольних сполук, терпенів та антимікробною активністю. Видалення фенольних сполук з екстракту підвищує антистафілококову активність майже у два рази.

7. Вивчено параметри стандартизації та розроблено проекти МКЯ на шлунковий збір, 60% спиртовий рідкий та густий модифікований екстракт з трави A. millefolium.

8. Підтверджено можливість створення нового лікарських засобу з кровоспинною активністю на основі 60% спиртового рідкого екстракту та антистафілококового лікарського засобу на основі густого модифікованого екстракту з трави д. звичайного шляхом вивчення відповідної фармакологічної активності.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Хромато-мас-спектрометричне дослідження терпеноїдів ефірної олії Achillea collina Beck. / А. М. Ковальова, А. М. Комісаренко, О. А. Кисличенко, С. М. Комісаренко // Фітотерапія. Часопис. - 2007. - № 4. - С. 69-71. (Особистий внесок - участь у постановці завдань, проведення досліджень, обробка результатів, написання статті).

2. Gas chromatography with mass-spectrometric detection of the components of the essential oil from Achillea carpatica Blocki ex Dubovik and Echinacea pallida (Nutt.) Nutt. / A. A. Kyslychenko, Ya. V. Dyakonova, A. N. Aleksandrov, R. Ye. Darmogray // Herba polonica. - 2008. - Vol. 54, № 4. - P. 62-67. (Особистий внесок - участь у проведенні досліджень, обробці результатів, написанні статті).

3. Дослідження фенольних сполук трави деревію звичайного / О. А. Кисличенко, О. М. Кошовий, А. М. Комісаренко, Т. П. Осолодченко // Medical Chemistry. - 2011. - Т. 13, № 4 (49). - С. 129-132. (Особистий внесок - проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, оформлення статті).

4. Кисличенко О. А. Амінокислотний та моноцукровий склад квіток Achillea millefolium Mill. / О. А. Кисличенко, О. М. Кошовий, А. М. Комісаренко // Український медичний альманах. - 2011. - Т. 14, № 2. - С. 91-93. (Особистий внесок - участь у постановці завдань дослідження, проведення експерименту, узагальнення результатів, написання статті).

5. Кисличенко О. А. Ізопреноїдний склад спиртового екстракту трави Achillea millefolium / О. А. Кисличенко, А. М. Комісаренко, О. М. Новосел // Збірник наукових праць НМАПО ім. П.Л. Шупика. - 2012. - Вип. 20, кн. 3. - С. 487-492. (Особистий внесок - участь у постановці завдань, проведення експерименту, обробка результатів, написання статті).

6. Кисличенко О. А. Терпеноїдний склад надземних органів деревію звичайного (Achillea millefolium Mill.) / О. А. Кисличенко, О. М. Кошовий, А. М. Комісаренко // Фармац. журн. - 2012. - № 2. - С. 96-99. (Особистий внесок - участь у постановці завдань та проведенні дослідження, обробці результатів, оформленні статті).

7. Перспективи одержання густого модифікованого спиртового екстракту з трави деревію звичайного / О. А. Кисличенко, О. М. Кошовий, А. М. Комісаренко, Т. П. Осолодченко // Збірник наукових праць НМАПО ім. П.Л. Шупика. - 2012. - Вип. 21, кн. 4. - С. 277-283. (Особистий внесок - участь у постановці завдань, проведення експерименту, узагальнення результатів, написання статті).

8. Кисличенко О. А. Оптимізація процесу спиртової екстракції біологічно активних речовин з трави деревію звичайного (Achillea millefolium) / О. А. Кисличенко, О. М. Кошовий, А. М. Комісаренко // Фармац. журн. - 2012. - № 6. - С. 51-54. (Особистий внесок - участь у постановці завдань, проведення досліджень, визначення якісного складу та кількісного вмісту основних груп БАР, математична обробка результатів, написання статті).

9. Пат. № 41309, Україна, МПК G01N 33/15. Спосіб кількісного визначення стероїдів та флавоноїдів біологічно активних речовин рослинного походження / Кисличенко В. С., Журавель І. О., Ярошенко І. В., Тернінко І. І., Бурда Н. Є., Кисличенко О. А., Грубник І. М., Нещерет О. І. - № u 2009 00463, заявл. 22.01.2009, опубл. 12.05.2009, Бюл. №9. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, обробці одержаних результатів, оформленні патенту).

10. Пат. № 68825, Україна, МПК A61K 36\28 (2006.01). Спосіб одержання засобу з антимікробною активністю з трави деревію звичайного / Кисличенко О. А., Комісаренко А. М., Кошовий О. М. - № u 2011 11938, заявл. 11.10.2011, опубл. 10.04.2012, Бюл. №7. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, обробці одержаних результатів, оформленні патенту).

11. Кисличенко А. А. Изучение полисахаридного комплекса травы тысячелистника обыкновенного / А. А. Кисличенко, А. М. Ковалева // Студенческая медицинская наука ХХІ века : материалы VII Междунар. науч.-практ. конф., 1-2 нояб. 2007 г., Витебск, Республика Беларусь. - Витебск, 2007. - С. 268-270.

12. Kyslychenko O. Chromatic and mass-spectrometric detection of terpenoids in the Achillea ptarmica L. grass essential oil / О. Kyslychenko, A. M. Kovalyova // 7th International Congress of Young Medical Scientists, May 20-21, 2007, Poznan, Poland. - Poznan, 2007. - P. 190.

13. Кисличенко О. А. Стандартизація біологічно активних речовин збору шлункового та сухого екстракту на його основі. / О. А. Кисличенко, Є. В. Гладух // Сучасні досягнення фармацевтичної технології : матеріали доп. першої наук.-практ. конф. з міжнар. участю, 20-21 листоп. 2008, Харків. - Харків, 2008. - С. 119-120.

14. Перспективы использования представителей рода Achillea в официнальной медицине / А. А. Кисличенко, А. Н. Комиссаренко, А. М. Ковалева, Е. В. Гладух // Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании : материалы междунар. науч.-практ. конф. 20-21 нояб. 2008, Белгород. - Белгород, 2008. - С. 266-267.

15. Кисличенко О. А. Дослідження впливу компонентів рослинного збору на склад одержаних екстрактів / О. А. Кисличенко, Є. В. Гладух, Л. І. Шульга // Науково-технічний прогрес i оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів : матеріали 3-ї наук.-практ. конф., 1-2 жовт. 2009, Тернопіль. - Тернопіль, 2009. - С. 58-59.

16. Кисличенко А. А. Приготовление и применение препаратов Millefolium в гомеопатической практике / А. А. Кисличенко, Н. Ф. Орловецкая // Сучасні напрямки розвитку гомеопатії в Україні : матеріали наук.-практ. інтернет-конф., м. Харків, 26-27 листоп. 2009 р. Х., 2009. С. 22.

17. Кисличенко О. А. Технологічні особливості одержання збору з лікарської рослинної сировини / О. А. Кисличенко, Є. В. Гладух // Фармакогнозія ХХІ століття. Досягнення та перспективи : матеріали ювілейної наук.-практ. конф. з міжнар. участю присвяч. пам'яті канд. фармац. наук, доц. Михайла Івановича Борисова до 80-річчя від дня народж., 26 берез. 2009 р., Харків. - Харків, 2009. - С. 90.

18. Development of a herbal species for treatment of gastroenteric diseases / O. A. Kyslychenko, Ye. V. Gladukh, O. S. Kukhtenko, L. I. Shulga, Iu. S. Kolisnyk // The XIII International congress “Phytopharm 2009”, 29-31 July 2009, Bonn, Germany. - Bonn, 2009. - P. 67.

19. Kyslychenko O. A. A study of aminoacid content of some plants from Fabaceae and Asteraceae families / O. A. Kyslychenko, U. V. Karpiuk, O. M. Yakymenko // The XIII International congress “Phytopharm 2009”, 29-31 July 2009, Bonn, Germany. - Bonn, 2009. - P. 66.

20. The use of gas chromatography with mass-spectrometric detection for exposing the falsified drugs / V. A. Georgiyants, O. A. Kyslychenko, I. I. Terninko, V. V. Velma, Ia. V. Diakonova // 42nd IUPAC Congress Chemistry solutions, 2-7 August 2009, SECC, Glasgow, Scotland, UK. - Glasgow, 2009. - P. 107016.

21. Кисличенко А. А. Разработка состава растительного сбора для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта. / А. А. Кисличенко, Е. В. Гладух // Материалы VIII Съезда фармацевтических работников Республики Беларусь, 8-9 апр. 2010 г., Витебск. - Витебск, 2010. - С. 484-487.

22. Persrective of creation of phytoteas in filter-packages / Yu. S. Prokopenko, O. A. Kyslychenko, Ye. V. Gladukh, O. I. Nescheret, V. A. Khanin // The 14th International Congress Phytopharm : Abstracts book, 1-3 July 2010, Saint-Petersburg, Russia. - Saint-Petersburg, 2010. - P. 79.

23. Monosaccharide composition of Achillea millefolium grass / O. A. Kyslychenko, O. M. Koshoviy, A. M. Komissarenko // The 15th International Congress Phytopharm : Abstracts book, 25-27 July 2011, Nuremberg, Germany. - Nuremberg, 2011. - P. 66-67.

24. Кисличенко О. А. Перспективи отримання екстрактів різної полярності з трави деревію звичайного / О. А. Кисличенко, О. М. Кошовий, А. М. Комісаренко // Хімія природних сполук : матеріали ІІІ Всеукр. наук.-практ. конф., 30-31 жовт. 2012 р., Тернопіль. - Тернопіль, 2012. - С. 120-121.

25. Kyslychenko O. Analysis of extracts of different polarity from yarrow herb. / O. Kyslychenko, O. Koshoviy, A. Komissarenko // The 3rd International Symposium on Medicinal Plants, their Cultivation and Aspects of Uses : Abstracts book, 21-23 November, 2012, Petra, Jordan. - Petra, 2012. - P. 78.

26. Kyslychenko O. A. Study of anti-inflammatory action of amuse extract of complex herbal species / O. A. Kyslychenko, I. L. Vihtinskaya // The 2nd International Symposium on Medicinal Plants, their Cultivation and Aspects of Uses : Abstracts book, 3-4 November, 2010, Petra, Jordan. - Petra, 2012. - P. 24.

27. Kyslychenko O. A. Ethanol extract standardization from Achillea millefolium herb / O. A. Kyslychenko, O. M. Koshoviy, A. M. Komissarenko // Функціональні харчові продукти - дієтичні добавки - як дієвий засіб різнопланової профілактики захворювань : матеріали I Міжнар. наук.-практ. конф., м. Харків, 11-12 квіт. 2013. - С. 293294.

Підписано до друку 25.09.2013. Формат 60х84/16

Папір офсетний. Гарнітура Times ET. Друк ризографічний.

Ум. друк. арк. 0,9. Наклад 100 пр. Зам.

Размещено на Allbest.ru

...