Синтетические пептиды, взаимодействующие с различными типами холинорецепторов

Заключение

Результатом данной работы является подбор оптимальных условий синтеза препаративных количеств природных б-конотоксинов и их аналогов. Показано, что наибольших выходов целевого продукта можно достичь при синтезе с одновременным замыканием дисульфидных связей действием кислорода воздуха в смеси вода-ацетонитрил (1:1 v/v) при рН=8,5. Однако, такой подход требует дальнейшего анализа порядка замыкания дисульфидных связей. В данной работе также был исследован метод поэтапного замыкания дисульфидных связей. Установлено, что расположение защитных tBu-групп на остатках цистеина в положениях Cys¹ и Cys³ приводит к увеличению выхода б-конотоксина RgIA в 3,7 раза по сравнению с синтезом, в котором tBu-группы расположены в положениях Cys² и Cys⁴. В данной работе впервые предложен метод разрушения комплексных соединений молекулы пептида с ионами таллия путем обработки раствором ЭДТА. Такие комплексные соединения могут образовываться (в зависимости от аминокислотной последовательности) при замыкании дисульфидных связей раствором трифторацетата таллия в трифторуксусной кислоте. Предложенный метод позволяет увеличить практическую значимость этого высокоэффективного реагента.

Синтезированные соединения были исследованы в опытах по связыванию с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами двух типов - природным мышечным нАХР из электрического органа ската T. californica и нейрональным б7 подтипом нАХР человека, трансфецированным в клетках GH₄C₁, а также ацетилхолин-связывающими белками из A. сalifornica и L. stagnalis. Новые аналоги [Н⁵]PnIA и [Н⁵, R¹⁴]PnIA показали более высокое сродство, чем природный пептид, к б7 нАХР и АХСБ из A. сalifornica. Пептиды, последовательности которых были выбраны на основании молекулярного моделирования, а именно [D⁵,R⁷,V¹⁰]PnIA, [D⁵,R⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA и особенно [D⁵,R⁷,L¹⁰]PnIA, имели высокую селективность к Ас-АХСБ. Влияние замен в положениях 10 и 14 конотоксинов оказалось незначительным, хотя эффект этих модификаций был очевиден в случае Ls-АХСБ. Так, аналоги [L¹⁰]PnIA и [L¹⁰, R¹⁴]PnIA не различались по сродству к Ac-АХБС, так же, как и [D⁵,R⁷,V¹⁰]PnIA, [D⁵,R⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA и [D⁵,R⁷,L¹⁰]PnIA. В целом, полученные результаты подтверждают предсказательную способность построенных моделей взаимодействия пептидных лигандов и АХСБ и их применимость в разработке веществ с заданными параметрами.

пептид дисульфидный конотоксин ацетилхолиновый

Выводы

1. Разработаны оптимальные условия синтеза б-конотоксинов с использованием одновременного замыкания обеих дисульфидных связей при получении препаративных количеств в сочетании с поэтапным замыканием как для проверки корректности образования дисульфидов в природных б-конотоксинах, так и для получения их аналогов.

2. Исследовано влияние расположения пар ортогональных защитных групп остатков цистеина на выход конечного продукта; показана возможность использования трифторацетата таллия при замыкании дисульфидных связей для повышения выхода аналогов б-конотоксинов.

3. С использованием разработанных методик синтезированы 4 различных природных б-конотоксинов и 29 новых аналогов, в том числе с неприродным порядком замыкания дисульфидных связей.

4. Показано, что изменение размера первой цистеиновой петли в б-конотоксине MI не переключает его специфичность с никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР) мышечного типа Torpedo californica в пользу нейронального б7 нАХР человека. На основе б-конотоксина PnIA получены аналоги, имеющие высокое сродство к б7 нАХР, а также аналог, селективный для ацетилхолин-связывающего белка A. californica.

5. С использованием б-конотоксина ImII и его ImII_изо аналога и радиоактивного производного [W10Y]ImII показано, что на б7 нАХР эти соединения взаимодействуют с классическим центром связывания агонистов и конкурентных антагонистов, но имеют иной центр связывания на АХР Torpedo californica.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях

1. Kasheverov I.E., Zhmak M.N., Fish A., Rucktooa P., Khruschov A.Yu., Osipov A.V., Ziganshin R.H., D.D`hoedt, Bertrand D., Sixma T.K., Smit A.B. and Tsetlin V.I. Interaction of б-conotoxin ImII and its analogs with nicotinic receptors and acetylcholine-binding proteins: additional binding sits on Torpedo receptor. J. Neurochem, 2009, 111 (4), 934-944.

2. Хрущёв А.Ю., Жмак М.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Синтетические аналоги б-конотоксинов в исследовании лиганд-связывающих сайтов никотиновых рецепторов. Биологические мембраны, 2009, 26(4), 333-334.

3. Koval L., Lykhmus O., Zhmak M., Khruschov A., Tsetlin V., Magrini E., Viola A., Chernyavsky A., Qian J., Grando S., Komisarenko S., Skok M. Differential involvement of б4в2; б7 and б9б10 nicotinic acetylcholine receptors in B lymphocyte activation in vitro. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2011, 43(4), 516-524.

4. Хрущёв А.Ю., Жмак М.Н., Цетлин В.И. Оптимизация ситеза б-конотоксинов. Тезисы докладов ХХI зимней молодежной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2009, Москва, 11.

5. Khruschov A.Yu., Zhmak M.N., Kasheverov I.E., Tsetlin V.I. Synthetic analogues of alfa-conotoxins in research of binding sites of nicotinic receptors. . Abstracts of the 6 Joint meeting of the European neuropeptide club and the summer neuropeptide conference, 2009, Salzburg, 79.

6. Khruschov A.Yu., Slovochotov I., Zhmak M.N., Kasheverov I.E., Tsetlin V.I. Radioactive derivatives of alpha-conotoxins for studies on nicotinic acetilcholone receptors. Abstracts of the 6 Joint meeting of the European neuropeptide club and the summer neuropeptide conference, 2009, Salzburg, 80.

7. Khruschov A.Yu., Slovochotov I., Zhmak M.N., Kasheverov I.E., Tsetlin V.I. Synthesis and characterization of novel alpha-conotoxin MII and PnIA analogs. Abstracts of the 7 Joint meeting of the European neuropeptide club and the summer neuropeptide conference, 2010, Pecs, 88.

8. Шелухина И.В., Струков А.С., Хрущёв А.Ю., Крюкова Е.В., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Никотиновые рецепторы мозга, вовлеченные в развитие нейродегенеративных и психических заболеваний. Тезисы докладов совещания «нейродегенеративные заболевания: современные представления о патогенезе, диагностике и лечении», 2010, Москва, 48.

9. Патентная заявка №2011104595. Аналог альфа-конотоксина PnIA, обладающий высоким сродством и селективностью к ацетилхолин-связывающему белку из Apysia californica. / Хрущев А.Ю., Жмак М.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., дата поступления заявки 10.02.2011.

10. Патентная заявка №2011104596. Аналог альфа-конотоксина PnIA, обладающий высоким сродством к альфа7 типу никотинового ацетилхолинового рецептора. / Хрущев А.Ю., Жмак М.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., дата поступления заявки 10.02.2011.

Размещено на Allbest.ru