Виділення та хімічне вивчення біологично активних речовин ліпазотропної дії рослин родин Бобові та Селерові

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 547.587.51:577.152.311:542.978:542.947:582.736:582.893.6

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

ВИДІЛЕННЯ ТА ХІМІЧНЕ ВИВЧЕННЯ БІОЛОГИЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН ЛІПАЗОТРОПНОЇ ДІЇ РОСЛИН РОДИН БОБОВІ ТА СЕЛЕРОВІ

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

ЯНЧЕНКО ПАВЛО СЕРГІЙОВИЧ

Харків - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії Національного фармацевтичного університету (м. Харків), Міністерство охорони здоров'я України.

Науковий керівник:

КОМІСАРЕНКО АНДРІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, доктор фармацевтичних наук, професор, Національний фармацевтичний університет, професор кафедри хімії природних сполук.

Офіційний опоненти:

СЕРБІН АНАТОЛІЙ ГАВРИЛОВИЧ, доктор фармацевтичних наук, професор, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри ботаніки;

МАРТИНОВ АРТУР ВІКТОРОВИЧ, доктор фармацевтичних наук, старший науковий співробітник, Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, вчений секретар.

Захист відбудеться "___"________________________2009 р. о _____ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01. при Національному фармацевтичному університеті за адресою 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий "____"________________________2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор фармацевтичних наук, професор Л.М. Малоштан.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошук біологічно активних речовин (БАР) рослинного походження для створення на їх основі лікарських засобів є актуальним завданням фармації. Перспективними природними БАР є фенольні речовини - кумарини, хромони, флавоноїди, які широко представлені в рослинах родин Бобові та Селерові флори України. Виділення та вивчення цих речовин становить теоретичний та практичний інтерес.

Сучасним підходом до створення лікувальних засобів є пошук рослинних БАР, що здатні впливати на ферменти та рецептори. Перспективним напрямком досліджень є встановлення впливу природних БАР на активність панкреатичної ліпази. Активатори та інгібітори ліпази традиційно застосовують при розладах ферментного гомеостазу організму. Так, більш досліджені інгібітори ліпази використовуються в терапії ожиріння, гіперліпідемії, атеросклерозу, ліпаземій (гострий панкреатит). Активатори ліпаз недостатньо вивчені, проте можливості їх застосування досить вагомі, зокрема, це створення комплексних ферментних засобів з додатковою фармакологічною активністю (наприклад, гепатозахисною) для терапії ензимної недостатності з сукупною патологією, що має місце у 70 % подібних випадків.

Актуальним є створення ферментних препаратів з високою активністю ліпази, яка забезпечує їх терапевтичну ефективність та покращення якості життя пацієнта. Одним з гіпотетичних шляхів вирішення даної проблеми є включення до складу препаратів з відомої сировини (панкреатину) активаторів ліпаз. Перспективним є створення комбінацій рослинних активаторів, які б мали додаткові фармакологічні властивості, з панкреатином, з метою одержання ефективних і зручних у прийомі лікувальних засобів з широкою терапевтичною дією, та перевагами препаратів рослинного походження - низькою токсичністю, відсутністю вагомих протипоказань, тощо. За умов створення таких рослинних активаторів на основі вітчизняної, зокрема сільськогосподарської, сировини, дані препарати будуть мати також значні фармакоекономічні переваги.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету за темою "Фармакогностичне вивчення біологічно активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження" № державної реєстрації 0103U000476 і проблемної комісії "Фармація" МОЗ України.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи - виявлення, виділення, ідентифікація, встановлення структури фенольних БАР рослин флори України родин Бобові та Селерові та визначення впливу цих БАР на активність ліпази для подальшої розробки комбінованого ферментного препарату з високою ліпазною активністю та терапевтично доцільною додатковою фармакологічною дією.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися такі завдання:

- інформаційно-патентний пошук, узагальнення отриманих даних, критичний аналіз сучасного стану дослідження проблематики та вибір об'єктів дослідження;

- розробка експресного методу визначення ліполітичної активності ферментних препаратів та ліпазотропної активності об'єктів природного походження;

- проведення попередніх досліджень обраних рослинних об'єктів та підтвердження перспективності пошуку речовин ліпазотропної дії в них;

- ізолювання, хімічне вивчення та ідентифікація БАР фенольної природи з рослин родин Бобові (родів Vicia L., Coronilla L., Melilotus L.) та Селерові (Angelica L., Heracleum L., Daucus L.), та сумарних препаратів Піфламін, Флаванабол, Авісан;

- визначення ліпазотропної активності рослинних БАР та сумарних препаратів, що містять дані сполуки, вивчення особливостей такого впливу;

- розробка складу, технології одержання та методів стандартизації комбінованого ферментного препарату з високою активністю ліпази та додатковою фармакологічною дією.

Об'єкти дослідження: надземна частина та окремі органи рослин - Angelica archangelica L. (Дягель лікарський), Heracleum sphondylium L. (Борщівник звичайний), Daucus carota L. (Морква звичайна) родини Apiaceae, та Vicia tenuifolia Roth. (Горошок тонколистковий), Coronilla varia L. (В'язіль барвистий), Melilotus albus Medik. (Буркун білий), Melilotus officinalis (L.) Pall. (Буркун лікарський) родини Fabaceae, екстракти з цих рослин, субстанції Піфламін, Флаванабол, Авісан; БАР - похідні бензо-б-пірону (кумарини) та бензо-г-пірону (хромони, флавоноїди); панкреатин і панкреатична ліпаза.

Предмет дослідження: способи ізолювання БАР, фізико-хімічні властивості виділених сполук, метролого-статистичні характеристики методу визначення ліполітичної активності ферментних препаратів та ліпазотропної активності речовин, ліполітична активність панкреатину, ліпазотропна активність БАР, екстрактів та препаратів, технологія одержання комбінованого ферментного препарату Піфлензим (Піфлензим+), методи стандартизації препарату.

Методи дослідження: ізолювання БАР проводили методом багаторазової та дробної екстракції з подальшим хроматографічним розділенням; ідентифікацію речовин проводили за даними ІЧ- та УФ-спектрометрії, тонкошарової та паперової хроматографії, визначенням температури плавлення та депресії температури плавлення проби змішування з достовірними зразками, визначенням елементного складу, молекулярної маси, оптичного обертання. Ліполітичну активність панкреатину та ліпазотропну активність препаратів, екстрактів та БАР визначали розробленим методом з подальшою статистичною інтерпретацією.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше розроблено на основі методу рН-статування простий та експресний метод визначення ліполітичної активності ферментних препаратів та ліпазотропної активності речовин. Встановлені метрологічні параметри - точність, відтворюваність, лінійність, невизначеність.

З досліджуваних об'єктів виділено та ідентифіковано 48 фенольних речовин (27 речовин похідних бензо-б-пірону (10 оксикумаринів, з них 1 глікозид, 11 фурокумаринів ряду псоралену, 5 ряду ангеліцину, 1 піранокумарин), 2 фурохромона, 19 флавоноїдів, з яких 5 флавонів (2 флавонові С-глікозиди), 13 флавонолів (11 глікозидів: монозидів - 3, біозидів - 5, диглікозидів - 3), 1 ізофлавоновий глікозид). Вперше виділені з A. archangelica L. - скополетин; D. carota L. - умбеліферон, умбеліпренін, скополетин; H. sphondylium L. - остол, умбеліпренін; епірутин, антозид, флавантазид; з M. albus Medik. - робінин; з V. tenuifolia Roth. - умбеліферон, ескулетин, ескулін; лютеолін, діосметин, кемпферол, кверцетин та рутин.

Вперше визначено ліпазотропну активність спирто-водних екстрактів з 7 рослин флори України, 3 препаратів, та 33 БАР бензо-б- та бензо-г-піронової природи, вивчена динаміка ліпазотропного ефекту. Вперше здійснено пошук ліпазотропних агентів серед похідних бензо-б-пірону.

Вперше запропоновано концепцію комбінованого ферментного препарату з високою ферментною активністю, який містить ферментну субстанцію та субстанцію рослинного активатора, що підвищує активність ферменту та має власну фармакологічну активність. Розроблено технологію одержання комбінованих ферментних лікувальних засобів Піфлензим та Піфлензим+, таблетки вкриті кишково-розчинною оболонкою. Одержано патент України на винахід № 77246 "Лікувальний засіб, що містить панкреатин та екстракт трави гороху посівного" (дата реєстрації 15.11.2006).

Практичне значення отриманих результатів. Запропоновано методику визначення ліполітичної активності ферментних препаратів та ліпазотропної активності речовин.

Метод визначення ліполітичної активності ферментних препаратів та здатності біологічно активних речовин впливати на активність ліполітичних ферментів, результати фітохімічних досліджень рослин родин Бобові та Селерові впроваджено в навчальний та науково-дослідницький процес кафедри фармакогнозії та кафедри фармацевтичної хімії Запорізького державного медичного університету, кафедри біохімії Національного фармацевтичного університету, кафедри якості, стандартизації та сертифікації ліків Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації НФаУ, Центральної науково-дослідницької лабораторії НФаУ.

Встановлена можливість створення комбінованих ферментних препаратів з високою ферментною активністю на основі запропонованого підходу, який полягає у введенні до складу лікарської форми активатора ферменту рослинного походження. Розроблено технологію одержання та методи стандартизації комбінованого лікарського засобу з підвищеною активністю ліпази та гепатопротекторною активністю Піфлензим (Піфлензим+).

Особистий вклад здобувача.

- проведено інформаційно-патентний пошук за хімічним складом об'єктів дослідження та БАР, що мають здатність впливати на активність ліпази; за методами визначення впливу БАР на ферменти;

- розроблено метод визначення ліполітичної активності ферментних препаратів та ліпазотропної активності речовин, визначені основні метрологічні характеристики методу, проведені попередні випробування ліпазотропної активності екстрактів та сумарних препаратів;

- виділено, проведено хімічне вивчення та ідентифіковано 48 речовин фенольної природи з сировини A. archangelica L., H. sphondylium L., D. carota L. (Apiaceae) та C. varia L., V. tenuifolia Roth., M. albus Medik. (Fabaceae) та субстанцій сумарних препаратів Піфламін, Флаванабол та Авісан;

- визначено ліпазотропну активність 30 сполук;

- розроблено склад, технологію, основні підходи та методики стандартизації комбінованого лікарського засобу Піфлензим (та варіанту Піфлензим+).

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідалися на ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції "Наука та соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія" (Харків, 2003), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Фармація ХХІ століття" (Харків, 2002), Відкритій науково-практичній конференції молодих учених та спеціалістів "Наукові досягнення у галузі створення лікарських засобів: технологія, аналіз, фармакологія" (Харків, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 14 наукових праць, з яких 9 статей у фахових журналах ВАК України, 1 патент та 4 тези.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, розділу 1 - огляду літератури та 5 розділів експериментальних досліджень, загальних висновків та списку літературних джерел. Дисертацію викладено на 165 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 28 таблицями, 18 рисунками. Обсяг основного тексту дисертації складає 121 сторінку. Бібліографічний показник включає 175 джерел, з них 60 кирилицею та 115 латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Аналіз сучасного стану досліджень впливу рослинних БАР на активність ліпази показав актуальність таких досліджень. Літературні дані свідчать про вибірковість досліджень ліпазотропної дії рослинних БАР, так дані про дослідження бензо-б-піронів відсутні, а дані щодо флавоноїдів мають частковий характер; практично відсутні відомості про мономолекулярні активатори ліпаз. Огляд літератури дозволив обрати рослини-об'єкти - A. archangelica L., H. sphondylium L., D. carota L. (Apiaceae) та C. varia L., V. tenuifolia Roth. та M. albus Medik. (Fabaceae), хімічний склад яких не вивчався.

Розробка методу визначення ліпазотропної активності та попередні дослідження. На базі методу рН-статування розроблено метод визначення ліполітичної активності ферментних препаратів та ліпазотропної активності речовин, який відрізняється більш "фізіологічним" середовищем ліполітичної реакції. Запропоновано методики дослідження та розрахунку ліпазотропної активності. Визначені статистичні (метрологічні) характеристики методу.

Розробленим методом досліджено ліпазотропну активність спирто-водних екстрактів рослин та препаратів (табл. 1). Визначена висока перспективність їх подальшого дослідження.

Досліджено динаміку ліпазотропного ефекту. В більшості випадків визначено розвинення ефекту на перших хвилинах реакції з наступним згасанням, що проте не спостерігається для Піфламіну, ліпазотропний ефект якого в концентрації 1 мг/мл є сталим протягом всього часу моніторингу.

Виділення фізіологічно активних сполук. При попередніх дослідженнях у надземній частині рослин-об'єктів виявлені кумарини (найбільший вміст в A. archangelica L., H. sphondylium L. та D. carota L. (Apiaceae) та C. varia L.(Fabaceae)), флавоноїди (найбільше в D. carota L., C. varia L. та V. tenuifolia Roth.), похідні коричної кислоти.

Виділяли БАР загальновідомими методиками. Сировину екстрагували спирто-водними сумішами, хроматографічно очищували та фракціонували органічними розчинниками з подальшим розділенням хроматографією на колонках.

Таблиця 1. Ліпазотропна активність досліджуваних об'єктів

* - достовірно відносно контролю та всіх інших визначень (99 %, 76, 3) та (99 %, 3, 3);

** - достовірно відносно контролю, недостовірно відносно Піфламіну/Авісану (99 %, 3, 3).

Кумарини розділяли на колонках кислого алюмінію оксиду та силікагелю з 5 % гіпсу, флавоноїди - на поліамідному сорбенті (глікозиди флавоноїдів) та силікагелі з 5 % гіпсу. Як елюенти використовували підхожі органічні розчинники та їх суміші. В окремих випадках речовини розділяли препаративною хроматографією на папері.

Виділені такі класи речовин: A. archangelica L. (13 речовин) - оксикумарини (І, ІV, XII, XIII), фурокумарини (ІІ, ІII, V - XI); H. sphondylium L. (19) - оксикумарини (XIV, XV, XXVI, XXVII) та фурокумарини (XVI - XXV, XXVIII, XXIX); глікозиди флавоноїдів (XXX - XXXII); D. carota L. (12) - оксикумарини (XXXIII, XXXV, XXXVII, XXXVIII), фурокумарини (XXXIV, XXXVI); аглікони флавоноїдів (XXXIX - XLIII), глікозиди (XLIV); V. tenuifolia Roth. (9) - оксикумарини (XLV - XLVII) та їх глікозиди (XLVIII); аглікони флавоноїдів (XLIX - LII) та глікозиди (LIII); C. varia L. (9) - оксикумарини (LIV - LVII); аглікони флавоноїдів (LVIII), О_глікозиди (LIX, LX) та С-глікозиди флавоноїдів (LXI, LXII); M. albus Medik. (3) - кумарини (LXIII та LXIV); флавоноїдний глікозид (LXV).

Також виділяли БАР з Авісану, Піфламіну та Флаванаболу. Для виділення БАР з Піфламіну водну дисперсію субстанції фракціонували хлороформ-етанольною сумішшю (97:3), етилацетатом та н_бутанолом, упарені фракції розділяли на колонках силікагелю з 5 % гіпсу. Одержали 11 сполук - кумарини (LXVIII - LXX) та флавоноїди (LXXI - LXXVIII).

Хімічне вивчення (ідентифікація) речовин. Ідентифікували сполуки шляхом вивчення їх фізико-хімічних властивостей у порівнянні з даними літератури або властивостями достовірних зразків. Для попередньої ідентифікації вивчали хроматографічну поведінку, флюоресценцію, елементний склад, результати якісних реакцій, ІЧ- та УФ-спектри, температуру плавлення, оптичну активність. Проводили підтверджуючі дослідження (хімічна деструкція (гідроліз, термічне розщеплення тощо) з ідентифікацією продуктів, ацетилування, метилування, зустрічний синтез) та остаточну ідентифікацію (проба змішування з достовірним зразком, або хроматографування речовини зі свідком). Ідентифіковано 48 речовин (табл. 2.).

Таблиця 2. Фізико-хімічні властивості виділених БАР

Ідентифікація похідних бензо-б-пірону (кумаринів). Речовини (1) - (27) віднесені до кумаринів за реакцією з йодидною кислотою. Приналежність до похідних бензо-б-пірону підтверджено ІЧ- та УФ-спектрами. Основним типом хімічних перетворень при ідентифікації оксикумаринів та оксипохідних фурокумаринів були реакції метилування та гідролізу (рис. 1).

Ідентифікація похідних бензо-г-пірону. Хромони. Келін (28) та 5-гідроксікелін (29). Речовину (29) одержали при нагріванні (28) з калію йодидом та концентрованою оцтовою кислотою при 100°С. ІЧ-спектр (28) співпадає з ІЧ-спектром келіну-стандарту. При хроматографуванні (29) в системі хлороформ - метанол з достовірним зразком 5_гідроксікеліну отримали ідентичні плями з R_f=0,83.

Похідні 2-фенілбензо-г-пірону (флавоноїди). Речовини (30) - (48) віднесені до флавоноїдів за позитивною ціанідиновою реакцією, хроматографічною поведінкою, характером флюоресценції, ІЧ- та УФ-спектрами, зокрема з діагностичними реагентами. Основні хімічні перетворення при ідентифікації флавоноїдів - ацетилювання (аглікони флавоноїдів), гідроліз йодидною кислотою в середовищі рідкого фенолу (С-глікозиди флавонів), кислотний, лужний та ферментативний гідроліз (О-глікозиди флавоноїдів) (рис. 2).

Похідні 3-фенілбензо-г-пірону (ізофлавоноїди). Ононин (48). Кристалічна оптично активна речовина за хроматографічною поведінкою та ІЧ-спектром віднесена до глікозидів флавоноїдів. При ферментативному гідролізі одержали формононетин та D-глюкозу.

Дослідження ліпазотропної активності біологічно активних речовин. Визначена ліпазотропна активність 33 БАР - кумаринів, фурокумаринів, флавоноїдів. Вплив досліджено в динаміці, на діаграмах наведені криві розвитку ліпазотропного ефекту протягом 3-10 хв. реакції ліполізу. Концентрації речовини 1Ч10^-4 г/мл. Більшість речовин мали ліпазотропну дію та криву ліпазотропного ефекту з наростанням ефекту на початкових стадіях реакції (5-7 хв.) з наступним згасанням.

Рис. 1. Схема хімічних перетворень при ідентифікації дігідроксикумаринів

Для речовин, яки відзначено перспективними для дослідження, ця закономірність не спостерігалася.

Серед кумаринів найбільший активуючий вплив мали оксикумарини: остол (+81 %) та умбеліферон (+81,6 %), фурокумарини: дегідрофуранопсорален (+49 %) та ксантотоксол (+42 %). Інгібуючий вплив - кумарин (- 30 %), псорален (- 27 %), ксантотоксин (- 40 %) (рис. 3, 4). Більшість похідних бензо-б-пірону мали позитивну ліпазотропну активність, проте початковим гомологічним членам (кумарину, псоралену) притаманний інгібуючий вплив. Припустили, що інгібуючий вплив належить бензолактону й корегується замісниками.

Рис. 3. Динаміка ліпазотропного ефекту оксикумаринів, піранокумаринів та фуро-хромонів

Рис. 4. Динаміка ліпазотропного ефекту фурокумаринів (+80 %)

Запропоновано ймовірні шляхи впливу - вплив на реологічні властивості емульсії субстрату (суперсубстрат) та безпосереднє зв'язування лактону з активним або алостеричними центрами молекули ліпази.

Рис. 5. Динаміка ліпазотропного ефекту флавоноїдів

Більшість флавоноїдів підвищували швидкість ліполізу. Істотну активність мали астрагалозид (+140 %), байкалеїн (+127 %), авікулярин (+98 %), полістахозид Ононин (- 16 %) та астрагалін (- 37 %) визначені як перспективні речовини для дослідження інгібіторів ліпази (рис. 5).

Для флавоноїдів припустили ті самі механізми впливу. У випадку глікозидів флавоноїдів ймовірною є Ван-дер-ваальсова взаємодія неполярної агліконової частини молекули глікозиду з амінокислотними залишками на поверхні молекули ліпази, що призводить до сорбції глікозиду на поверхні протеїну та його солюбілізації (або порушення структури гідратної оболонки ензиму), що заважає правильній орієнтації молекули ліпази на суперсубстраті.

Причиною характерної динаміки ліпазотропного ефекту може бути конкурування ліпазотропного агенту з продуктами реакції ліполізу, накопичення продуктів ліполізу, що змінює склад та структуру поверхні розподілу фаз олія / вода та характер міжфазового розподілу речовин, сольволізні процеси, що призводять до зміни полярності речовин, їх спорідненості до ліпази або суперсубстрату тощо.

Також досліджено дозозалежний ліпазотропний ефект Піфламіну. Побудована гіпотетична поверхня в координатах концентрація - ефект - час (рис. 6) характеризує Піфламін як потужний активатор ліпази. Встановлено ліпазотропний ефект виділених з Піфламіну речовин. Усі досліджені компоненти Піфламіну мали активуючий вплив різного ступеня та описану динаміку ліпазотропного ефекту.

Розробка комбінованого ферментного препарату з високою активністю панкреатичної ліпази. Виходячи з ліпазотропного ефекту субстанції Піфламін, на її основі створено комбінований препарат з високою активністю ліпази та гепатопротекторною дією. Запропоновано лікарську форму - таблетки, вкриті кишково-розчинною оболонкою. Розроблено технологію отримання таблеток-ядер прямим пресуванням.

У процесі одержання препаратів проведено дослідження ліполітичної активності напівпродуктів та таблеток (табл. 4). Ліполітична активність грануляту, в який додано Піфламін, що не має власної ліполітичної активності, зростає відносно плацебо на 185 %, що свідчить про виражену потенцюючу дію Піфламіну на ліполітичну активність панкреатину при даному співвідношенні діючих речовин.

Також проведені фармако-технологічні дослідження запропонованими для проекту АНД методами. Апробація запропонованих методик на досліджуваних препаратах показала їх адекватність цілям стандартизації, належну якість препаратів та відповідність їх основних фармакотехнологічних показників вимогам ДФУ та ЄФ.

Рис. 6. Гіпотетична поверхня динаміки дозозалежного впливу Піфламіну

Таблиця 4. Різниця активностей ліпази на всіх стадіях технологічного процесу

Примітка. Наведені результати достовірно відрізняються при (4, 4, 99 %). ферментний ліпазна фенольна рослина

ВИСНОВКИ

1. Проведене виявлення, виділення, ідентифікація, встановлення структури фенольних БАР надземної частини Angelica archangelica L., Heracleum sphondylium L., Daucus carota L. (Apaiceae), та Vicia tenuifolia Roth., Coronilla varia L., Melilotus albus Medik. (Fabaceae), субстанції з гороху посівного показало перспективність даних рослин як джерел БАР бензо-б- та г-піронової природи. Дослідження впливу даних сполук (кумаринів, фурокумаринів, флавоноїдів, ізофлавоноїдів, хромонів) на активність ліпази показало високу перспективність пошуку серед даних класів речовин фармакофорів з різноспрямованим впливом на ліполітичні ферменти, що дозволило розробити на основі панкреатину та субстанції з трави гороху посівного комбінований ферментний препарат з високою ліпазною активністю та терапевтично доцільною додатковою гепато-протекторною дією Піфлензим (Піфлензим+).

2. Розроблено метод визначення ліпазотропної активності речовин, більш чітко описано поняття "ліпазотропності" речовини. Для розробленого методу визначені основні метрологічні характеристики, які свідчать про його точність, відтворюваність та широкий діапазон застосування.

3. За допомогою розробленого методу вперше визначено активуючий вплив на ліпазу екстрактів з 7 рослин родин Бобові та Селерові та трьох сумарних препаратів з лікарської рослинної сировини (Піфламін, Авісан, Флаванабол).

4. За допомогою екстракції спирто-водними сумішами та фракціонування різноманітними розчинниками з подальшим хроматографічним очищенням та розподіленням на колонках алюмінію оксиду та силікагелю з 5 % гіпсу при елююванні сумішами органічних та неорганічних розчинників виділено 79 речовин в індивідуальному стані, з яких 49 речовин є похідними бензо-б-пірону (з них прості кумарини - 25 речовин та фурокумарини - 24 речовини, 1 речовина віднесена до піранокумаринів), 1 речовина є похідним бензо-г-пірону (фурохромону) та 29 речовин - похідні бензо-г-пірону (флавоноїди, з них 1 ізофлавоновий глікозид).

5. Використовуючи різноманітні методи ідентифікації сполук, в тому числі УФ- та ІЧ-спектрометрію, вивчаючи фізико-хімічні характеристики речовин у порівнянні з константами достовірних зразків (температура плавлення, хроматографічна поведінка, флюоресценція тощо), проводячи підтверджуючі хімічні перетворення (гідроліз, ацетилування та алкілування, розщеплення тощо), серед виділених 79 речовин ідентифіковано 48 індивідуальних сполук фенольної природи. З них 27 речовин похідних бензо-б-пірону (10 простих кумаринів, з них 1 глікозид (ескулін), 11 фурокумаринів ряду псоралену, 5 ряду ангеліцину, 1 піранокумарин (віснадин), 2 фурохромона (келін та 5-гідроксикелін), 19 флавоноїдів з яких 5 флавонів (2 речовини - флавонові С-глікозиди - сапонаретин та гомоориєнтин), 13 флавонолів (11 глікозидів, з яких монозидів - 3, біозидів - 5, диглікозидів - 3) та 1 ізофлавоновий глікозид (ононин).

6. Вперше виділено з надземної частини рослин: A. archangelica L. - кумарин скополетин; з D. carota L. - кумарини: умбеліферон, умбеліпренін, скополетин; з H. sphondylium L. - кумарини: остол, умбеліпренін; глікозиди флавоноїдів: епірутин, антозид, флавантазид; з M. albus Medik. - флавоноїдний глікозид робінин; з V. tenuifolia Roth. - кумарини: умбеліферон, ескулетин, у тому числі глікозиди кумаринів - ескулін; флавоноїди: лютеолін, діосметин, кемпферол, кверцетин, у тому числі глікозиди флавоноїдів - рутин.

7. Вперше досліджено якісний склад субстанції Піфламін (з P. sativum L.), виділено 11 речовин (кумарини - ескулетин, ескулін, скополетин; флавоноїди - лютеолін, кемпферол, нікотифлорин, кверцетин, ізокверцитрин, рутин, кверцетин-3-О-софорозид, та глікозид ізорамнетину астрагалозид).

8. За розробленим методом вперше встановлена ліпазотропна активність 33 фенольних БАР. Визначено 4 речовини бензо-б-піронової природи (остол, умбеліферон, дегідрофуранопсорален та ксантотоксол) та 4 бензо-г-піронових похідних (астрагалозид, байкалеїн, полістахозид та авікулярин), які мають виражений позитивний ліпазотропний ефект та перспективні для подальшого дослідження з метою створення препаратів з підвищеною активністю ліпази. Визначено не менш 5 речовин (з них два флавоноїди - ононин та астрагалін), які є інгібіторами панкреатичної ліпази та перспективні для дослідження як гіполіпідемічні засоби. Встановлено особливості розвинення ліпазотропного ефекту для досліджених речовин.

9. На основі дослідження ліпазотропної активності субстанції Піфламін розроблено комбінований лікарський засіб з ферментативною та гепатопротекторною активністю для замісної терапії абсолютної та відносної ензимної недостатності при супутній патології печінки. Запропоновано два варіанти лікарського засобу Піфлензим (варіант Піфлензим+ з аскорбіновою кислотою), розроблено склад готової лікарської форми (таблетки в/о) та технологію її одержання. Для готової лікарської форми доведена висока ліполітична активність in vitro (збільшення на 60 % у порівнянні з аналогічною кількістю панкреатину). Розроблено аналітичні методики для проекту аналітичної нормативної документації. Доведена відповідність експериментально отриманих таблеток вимогам проекту АНД, Державної Фармакопеї України.

ТЕМА ДИСЕРТАЦІЇ ВІДОБРАЖЕНА В ПУБЛІКАЦІЯХ

1. Янченко, П.С. Метод визначення ліпазотропної активності речовин / П.С. Янченко, А.М. Комісаренко, Г.В. Георгієвский // Фармаком. - 2001. - № 3. - С. 44-47. (Янченко П.С. особисто здійснив літературний пошук, аналіз літературних даних, провів експеримент, узагальнив експериментальні дані, підготував статтю).

2. Янченко, П.С. Метод визначення ліполітичної активності панкреатину / П.С. Янченко, В.М. Ковальов, А.М. Комісаренко // Клінічна фармація. - 2002. - Т. 6, № 2. - С. 70-72. (Янченко П.С. здійснив експеримент, узагальнив експериментальні дані, підготував статтю).

3. Янченко, П.С. Исследование липазотропной активности силибора / П.С. Янченко, П.П. Пашнев, Н.А. Казаринов, А.Н. Комиссаренко // Фармаком. - 2003. - № 1. - С. 75-77. (Янченко П.С. приймав участь у експерименті, узагальненні експериментальних даних та підготовці статті).

4. Янченко, П.С. Ліпазотропна активність екстрактів з рослин деяких видів родин Бобові та Селерові / П.С. Янченко, А.М. Ковальова, А.М. Комісаренко // "Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики", збірн. наук. статей. - Т. 3. - Запоріжжя: Вид-во ЗДМУ, 2004. - С. 308-314. (Янченко П.С. особисто провів літературний пошук, експеримент по визначенню ліпазотропної активності, обробив та узагальнив експериментальні дані, підготував статтю).

5. Янченко, П.С. Виділення та вивчення деяких кумаринів і хромонів з рослин родин Бобові та Селерові та їх ліпазотропна активність / П.С. Янченко, А.М. Ковальова, Г.В. Георгієвський, А.М. Комісаренко // Фармаком. - 2004. - № 2. - С. 66-73. (Янченко П.С. приймав участь в виділенні й вивченні БАР, здійснив дослідження ліпазотропної активності, узагальнив експериментальні дані, підготував статтю).

6. Янченко, П.С. Виділення та вивчення деяких фурокумаринів із рослин Бобові та Селерові та їх ліпазотропна активність / П.С. Янченко, А.М. Ковальова, Г.В. Георгієвський, А.М. Комісаренко // Фармаком. - 2004. - № 3. - С. 28-35. (Янченко П.С. приймав участь в виділенні й вивченні БАР, здійснив дослідження ліпазотропної активності, обробив експериментальні дані, підготував статтю).

7. Янченко, П.С. Липазотропная активность субстанции пифламин и выделенных из неё индивидуальных веществ фенольной природы / П.С. Янченко // Фармаком. - 2004. - № 3. - С. 70-76.

8. Янченко, П.С. Виділення та вивчення деяких флавоноїдів із рослин родин Бобові та Селерові та їх ліпазотропна активність / П.С. Янченко, А.М. Ковальова, Г.В. Георгієвський, А.М. Комісаренко // Фармаком. - 2004. - № 4. - С. 46-57. (Янченко П.С. приймав участь в виділенні й вивченні БАР, дослідив ліпазотропну активність, обробив та узагальнив експериментальні дані, підготував статтю).

9. Янченко, П.С. Перспективы поиска соединений растительного и животного происхождения, обладающих липазотропной активностью / П.С. Янченко, А.М. Ковалёва, Г.В. Георгиєвский, А.М. Комиссаренко // Фармаком. - 2007. - № 3. - С. 47-51. (Янченко П.С. провів інформаційний пошук за темою огляду, здійснив експеримент з визначення ліпазотропної активності речовин, узагальнив експериментальні дані, підготував статтю).

10. Пат. 77246 Україна, МПК ⁷ А 61 К 38/57, А 61 К 36/48, А 61 Р 1/18. Лікувальний засіб, що містить панкреатин та екстракт трави гороху посівного / П.С. Янченко, А.М. Ковальова, А.М. Комісаренко, В.М. Ковальов, С.М. Комісаренко (Україна); власник Національний фармацевтичний університет. - № 20040706045; заявл. 21.07.2004; опубл. 15.11.2006, Бюл. № 11. - 6 с. (Янченко П.С. розробив лікувальний засіб, що містить панкреатин та екстракт гороху посівного, дослідив ліполітичну активність. Оформив заявку).

11. Янченко, П.С. Новий метод визначення здатності речовин впливати на активність ліполітичних ферментів / П.С. Янченко // Фармація ХХІ століття: Матеріали Всеукр. наук. - практ. конф. / Ред. кол. В.П. Черних, І.С. Гриценко, В.Н. Толочко. - Х.: Вид-во НФАУ. Золоті сторинки, 2002. - С. 92-93.

12. Янченко, П.С. Ліпазотропна активність деяких біологічно активних сполук рослин родин Бобові та Селерові / П.С. Янченко, А.М. Комісаренко // "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія": Тези доповідей ІІІ-Міжнар. наук.- практ. конф. Ч.1 - Х.: Вид-во НФАУ, 2003. - С. 364. (Янченко П.С. провів дослідження ліпазотропної активності, узагальнив експериментальні дані, підготував тези).

13. Курмашева, М.Ш. Кінетика інгібування ліпази панкреатину деякими фторхінолонами / М.Ш. Курмашева, П.С. Янченко // "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія": Тези доповідей ІІІ-Міжнар. наук.- практ. конф. Ч.1 - Х.: Вид-во НФАУ, 2003. - С. 177. (Янченко П.С. приймав участь у експерименті, узагальненні та інтерпретації експериментальних даних).

14. Янченко, П.С. Розробка нового лікарського засобу на основі панкреатину та субстанції з трави гороху посівного / П.С. Янченко, А.М. Ковалева, А.М. Комісаренко // Фармакогнозія ХХ століття. Досягнення та перспективи: Тези доп. Ювілейної наук.-практ. конф. з міжнар. участю (м. Харків, 26 березня 2009 р.). - Х.: Вид-во НФаУ, 2009. - С. 283-284. (Янченко П.С. приймав участь у розробці лікарського засобу, що містить панкреатин та екстракт гороху посівного, дослідив ліполітичну активність, оформив тези).

АНОТАЦІЯ

Виділення та хімічне вивчення біологічно активних речовин ліпазотропної дії рослин родин Бобові та Селерові. - Рукопис

Янченко П.С.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. Національний фармацевтичний університет, 2009.

Дисертація присвячена вирішенню проблеми пошуку ліпазотропних агентів серед рослинних БАР та створенню лікарського засобу з високою активністю ліпази. Розроблено метод визначення ліпазотропної активності речовин, визначені його метролого-статистичні характеристики. Вивчена ліпазотропна активність екстрактів 7 рослин родин Бобові та Селерові (Angelica archangelica L., Heracleum sphondylium L., Daucus carota L., Coronilla varia L., Vicia tenuifolia Roth., Melilotus officinalis (L.) Pall. та Melilotus albus Medik.), які мали активуючу дію. Досліджено 3 сумарних препарати Авісан, Піфламін та Флаванабол (активатори). Проведено фітохімічне дослідження вказаних рослин флори України. Виділено та ідентифіковано 48 сполук: 28 кумаринів, 1 фурохромон та 19 флавоноїдів. 17 речовин вперше виділено з певних рослинних об'єктів. Вперше досліджена ліпазотропна активність 33 БАР, вперше досліджені похідні бензо-б-пірону. Визначено не менш 8 перспективних активаторів ліпази (4 похідні бензо-б-пірону та 4 бензо-г-пірону) та 5 інгібіторів (з них два флавоноїди). Розроблено комбінований препарат з високою активністю ліпази, ліпазна активність препарату вища за активність аналогічної дози панкреатину. Розроблено технологію одержання препарату та методи стандартизації для проекту АНД.

Ключові слова: інгібітори ліпази, активатори ліпази, кумарини, флавоноїди, ферментні препарати, Angelica archangelica L., Heracleum sphondylium L., Daucus carota L., Coronilla varia L., Vicia tenuifolia Roth., Melilotus officinalis (L.) Pall. та Melilotus albus Medik., Піфламін.

АННОТАЦИЯ

Выделение и химическое изучение биологически активных веществ липазотропного действия растений семейств Бобовые и Сельдерейные. - Рукопись

Янченко П.С.

Диссертация на соискание научной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. Национальный фармацевтический университет, 2009.

Диссертация посвящена решению проблемы целенаправленного поиска липазотропных агентов среди биологически активных веществ растений семейств Бобовые и Сельдерейные и созданию на их основе комбинированного лекарственного препарата с высокой активностью липазы. На базе метода рН-статирования впервые разработан относительно простой, доступный метод определения липолитической активности ферментных препаратов и липазотропной активности веществ. Для разработанного метода определены основные метролого-статистические характеристики, такие как точность, воспроизводимость, линейность и диапазон использования. С помощью разработанного метода определена липазотрпная активность экстрактов из 7 растений семейств Бобовые и Сельдерейные (Angelica archangelica L., Heracleum sphondylium L., Daucus carota L., Coronilla varia L., Vicia tenuifolia Roth., Melilotus officinalis (L.) Pall. та Melilotus albus Medik.), при этом все исследованные экстракты имели выраженное активирующее действие. Также исследовано 3 суммарных препарата из лекарственного растительного сырья Ависан (из Visnaga daucoides Gaerth.), Пифламин (Pisum sativum L.) и Флаванабол (Ononis arvensis L.), которые также обладали активирующими свойствами. Проведено фитохимическое исследование указанных растений флоры Украины. Выделено и идентифицировано 48 соединений, среди которых 27 веществ производные бензо-б-пирона (10 оксикумаринов, в том числе 1 гликозид, 11 фурокумаринов ряда псоралена и 5 ряда ангелицина, а также 1 пиранокумарин ряда дегидросесселина), 21 вещество производное бензо-г-пирона (2 фурохромона и 19 флавоноидов, среди которых 5 флавонов (2 вещества - флавоновые С-гликозиды), 13 флавонолов (11 гликозидов, среди которых монозидов - 3, биозидов - 5, дигликозидов - 3) и 1 изофлавоновый гликозид. При этом 17 веществ было выделено из исследованных объектов впервые: из A. archangelica L. - скополетин; D. carota L. - умбеллиферон, умбеллипренин и скополетин; H. sphondylium L. - остол, умбеллипренин и эпирутин, антозид, флавантазид; M. albus Medik. - робинин; V. tenuifolia Roth. - умбеллиферон, эскулетин, эскулин; лютеолин, диосметин, кемпферол, кверцетин, рутин. Также исследовано химический состав субстанции Пифламин, при этом были выделены 11 фенольных веществ (кумарины и флавоноиды). Также была исследована липазотропная активность 33 веществ, в том числе была впервые исследована липазотропная активность производных бензо-б-пирона, определено не менее 8 перспективных активаторов липазы (4 вещества кумариновой природы (остол, умбелиферон, дегидрофуранопсорален и ксантотоксол) и 4 вещества флавоноидной (астрагаозид, байкалеин, авикулярин и полистахозид), также определено не менее 5 веществ - перспективных ингибиторов липазы (среди которых два флавононоида - астрагалин и ононин). На основе предложенной концепции создания комбинированных ферментных препаратов с высокой липолитической активностью (на основе комбинации панкреатин + растительный активатор липазы) и на основе исследованного положительного липазотропного эффекта пифламина было предложено два варианта комбинированного ферментного препарата с высокой липолитической активностью и дополнительной гепатопротекторной и нормализующей моторику ЖКТ фармакологической активностью. В эксперименте препарат демонстрировал на 60 % большую липазную активность, чем аналогичное количество панкреатина. Для препарата предложены состав действующих и вспомогательных веществ, технология получения готовой лекарственной формы (таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой). Разработаны основные методы стандартизации готовой лекарственной формы для проекта АНД.

Ключевые слова: ингибиторы липазы, активаторы липазы, кумарины, флавоноиды, ферментные препараты, Angelica archangelica L., Heracleum sphondylium L., Daucus carota L., Coronilla varia L., Vicia tenuifolia Roth., Melilotus officinalis (L.) Pall. та Melilotus albus Medik., Пифламин.

ANNOTATION

Allocation and chemical studying of biologically active substances with lipasetropic actions of plants of families Fabaceae and Apiaceae. - the Manuscript

Yanchenko, P.S.

The dissertation for the candidate scientific degree in pharmacy 15.00.02 - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. National Pharmaceutical University, Kharkiv, 2009.

The dissertation is devoted to the decision of a problem of search lipasetropic agents among vegetative bioactive substance and creations of a medical product with high lipase activity. The method of definition lipasetropic activity of substances is developed, are certain its metrological and statistical characteristics. It is investigated lipasetropic activity of extracts of 7 plants of families Fabaceae and Apiaceae (Angelica archangelica L., Heracleum sphondylium L., Daucus carota L., Coronilla varia L., Vicia tenuifolia Roth., Melilotus officinalis (L.) Pall. and Melilotus albus Medik.), which had activating action. It is investigated 3 preparations Avisane, Piflamine and Flavanabole (activators). It is carried out phytochemical research of the specified plants of Ukrainian flora. It is allocated and identified 48 substances: 27 coumarins, 2 furochromones and 19 flavonoids. 17 substances for the first time are allocated from the certain vegetative objects. For the first time it is investigated lipasetropic activity of 33 individual substances, for the first time the investigated derivatives benzo-б-pyrone. It is determined not less than 8 perspective activators of lipase (4 derivatives benzo-б-pyrone and 4 benzo-г-pyrone) and 5 inhibitor (from them two flavonoids). The combined preparation with high activity of lipase is developed, thus lipolytic activity of a preparation is higher of activity of a similar doze of pancreatine. The technology of reception of a preparation and methods of standardization for the project of the AND is developed.

Key words: lipasetropic activity, inhibitors of lipase, activators of lipase, coumarins, flavonoids, enzyme preparations,...