Роль парамагнитных интермедиатов в ферментативном окислении пероксидазой хрена

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

01.04.17 - химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

РОЛЬ ПАРАМАГНИТНЫХ ИНТЕРМЕДИАТОВ В ФЕРМЕНТАТИВНОМ ОКИСЛЕНИИ ПЕРОКСИДАЗОЙ ХРЕНА

Афанасьева Мария Сергеевна

Новосибирск - 2007

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат химических наук Тарабан Марк Борисович

Официальные оппоненты:

кандидат физико-математических наук Стась Дмитрий Владимирович доктор химических наук Фёдорова Ольга Семёновна

Ведущая организация:

Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Защита диссертации состоится «30» января 2008 г. в 15.00 на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 в Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической кинетики и горения СО РАН.

Автореферат разослан « 10 » декабря 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук А.А. Онищук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие методы спиновой химии находят все более широкое применение для исследования сложных химических и биологических процессов. Их использование позволяет решить одну из ключевых задач современной химии - определение строения и свойств короткоживущих интермедиатов химических реакций.

Изучение ферментативных реакций и установление их элементарных стадий имеет особое значение как для понимания механизмов каталитического действия ферментов, так и для исследования актуальной проблемы участия ферментов в процессах регулирования образования и гибели свободнорадикальных частиц в биологических системах.

Совместное применение методов спиновой химии и расчетных методов квантовой химии позволяет получать важную информацию о механизмах реакций, катализируемых ферментами. Кроме того, установление детальных механизмов ферментативного катализа, важно для понимания факторов, обеспечивающих его эффективность и высокую степень специфичности. Спиновые состояния парамагнитных интермедиатов ферментативного каталитического цикла должны обеспечивать такую корреляцию электронных спинов, которая никоим образом (например, вследствие спинового запрета) не нарушила бы закономерной последовательности взаимопревращений в каталитическом цикле. Механизм, обеспечивающий необходимую корреляцию электронных спинов, изучен слабо. В этой связи, методы спиновой химии представляют огромную ценность, поскольку именно их применение позволяет вскрыть роль спиновых состояний и факторы, определяющие селективность ферментативных процессов.

Основные цели работы:

1. Кинетическими методами и методами спиновой химии установить элементарные стадии взаимодействия пероксидазы хрена с субстратами: нативным - никотинамидадениндинуклеотидом (НАДН), и специфичным, синтетическим аналогом НАДН - 1,4-дигидро-2,3-диметил-3,5-дикарбометокси-4-нитрофенилпиридином, нифедипином (НФ).

2. Разработать кинетическую модель, описывающую последовательность взаимопревращений интермедиатов каталитического цикла пероксидазы хрена.

3. В рамках теории радикальных пар дать описание магнитных и спиновых эффектов для многоспиновых ферментативных систем.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование детального механизма первой стадии каталитического цикла пероксидазы хрена. Показано, что при аэробном окислении субстратов без перекиси водорода, начальной стадией цикла является акт одноэлектронного переноса в фермент-субстратном комплексе с образованием ферропероксидазы. Впервые зарегистрированы эффекты ХПЯ в ферментативном процессе. Впервые использовались расчетные методы квантовой химии для описания многоспиновых ферментативных систем. С помощью такого подхода удалось доказать формирование прочного фермент-субстратного комплекса, определить, что в акте одноэлектронного переноса дигидропиридиновый фрагмент НАДН в фермент-субстратном комплексе располагается близко к плоскости гема. Продемонстрировано влияние спинового состояния исходной парамагнитной пары на каталитический цикл пероксидазы хрена. Также получены доказательства одноэлектронного многостадийного окисления НАДН в биологических системах: НАДН > НАДН*+ > НАД* > НАД+. При исследовании системы НАДН - ПХ методом ХПЯ показано, что неконкурентное ингибирование пероксидазы изменяет ее акцепторные свойства, но существенно не влияет на расстояния в фермент-субстратном комплексе.

Практическая ценность работы. Проведенное исследование раскрывает элементарный механизм действия пероксидазы хрена, как катализатора, в аэробных условиях в отсутствии инициатора окисления, перекиси водорода, и меняет представление о проявлениях стадии одноэлектронного переноса в реакциях гем-содержащих ферментов, а также имеет огромное значение для понимания селективного действия ферментов и роли спиновых состояний парамагнитных интермедиатов в обеспечении селективности. Тот факт, что парамагнитные интермедиаты могут находиться в двух состояниях, одно из которых является реакционноспособным и приводит к следующей стадии каталитического цикла, а второе возвращает реакцию к исходным реагентам, создает предпосылки для использования этих знаний для разработки новых биотехнологических процессов с использованием моделей активных центров ферментов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих международных конференциях и симпозиумах: 8th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena, Chapel Hill, NC, USA, September, 2003; Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, Россия, 2004; Biological Research Trust Workshop, The Royal Society, London, United Kingdom, January 15, 2004; 2nd International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances, Novosibirsk, Russia, 2004; XVIII Симпозиум «Современная химическая физика», Туапсе, Россия, 22 сентября - 3 октября, 2006.

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 3 статьях, 1 обзоре и 3 тезисах международных научных конференций и симпозиумов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 77 наименований. Работа изложена на 131 странице, содержит 2 таблицы, 1 схему и 44 рисунка.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении изложена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи работы.

В первой главе представлен обзор литературы, посвященный современным представлениям о реакциях, катализируемых пероксидазой хрена (ПХ), а также методам спиновой химии как инструменту исследования ферментативных процессов. Описаны особенности процессов окисления субстратов (изобутиральдегида и НАДН), катализируемых ПХ, окисления НАДН в колебательной пероксидазно-оксидазной реакции. Рассмотрены методы исследования элементарных процессов, приводящих к свободным радикалам и аспекты применения методов спиновой химии для исследования сложных ферментативных систем. Обсуждаются первые попытки применения методов спиновой химии (магнитного эффекта, МЭ) для установления механизмов ферментативных процессов. При исследовании окисления 2-метил-1-(триметилсилилокси)проп-1-ена, катализируемого ПХ в присутствии перекиси водорода в стационарном режиме была установлена магниточувствительная стадия процесса - стадия каталитического цикла, включающая взаимодействие компаунда II и субстрата.

На основании сопоставления экспериментальных результатов с квантовохимическими расчетами было показано, что радикальная пара, в которой происходит перенос электрона образуется в триплетном состоянии, приводящем к регенерации компаунда II, в то время как ее синглетное состояние приводит к исходной пероксидазе. Так, впервые было продемонстрировано влияние спинового состояния радикальной пары на взаимопревращения активных парамагнитных интермедиатов в каталитическом цикле. При изучении механизма окисления НАДН в режиме осцилляций было зарегистрировано влияние внешнего магнитного поля на изменение концентрации кислорода, но вследствие отсутствия модели описания магнитного эффекта, проведенные исследования не позволили решить вопрос о магниточувствительной стадии процесса, а также установить точный механизм взаимопревращений парамагнитных интермедиатов. Последний раздел литературного обзора посвящен описанию теории магнитных и спиновых эффектов, применяемой для квантово-механических расчетов вероятности рекомбинации парамагнитных пар в многоспиновых системах.

Заканчивается обзор литературы постановкой задачи, в рамках которой планировалось применение методов спиновой химии для исследования радикальных стадий окисления НАДН и его синтетических аналогов, катализируемого пероксидазой хрена, а также для установления структуры и механизмов взаимопревращений парамагнитных интермедиатов этих процессов. Предлагается использовать методики остановленной струи со спектрофотометрической регистрацией в сочетании с экспериментами по наблюдению магнитных и спиновых эффектов для получения информации о магниточувствительных стадиях ферментативного окисления и спиновых состояниях образующихся интермедиатов. Для установления структуры парамагнитных интермедиатов стадии инициирования каталитического цикла пероксидазы хрена анализируются эффекты химической поляризации ядер в акте фотоиндуцированного одноэлектронного переноса на начальной стадии процесса, а также исследуются спектроскопические характеристики промежуточных частиц в условиях остановки каталитического цикла. Для получения выводов о структуре и спиновых состояниях парамагнитных интермедиатов следует провести моделирование экспериментальных магнитных эффектов и эффектов химической поляризации ядер в рамках описания многоспиновых ферментативных систем на основе теории радикальных пар. каталитический пероксидаза хрен магнитный

Во второй главе описаны экспериментальные установки, в частности: быстросканирующий спектрофотометр остановленной струи OLIS-RSM-1000, модифицированный для проведения реакций смешения в магнитных полях различной напряженности, а также установка для исследования фотоиндуцированной химической поляризации ядер в ферментативных системах на базе серийного спектрометра ЯМР Bruker DPX-200 (1H, 200 мГц). Также приведена подробная методика приготовления образцов.

В третьей главе обсуждаются результаты кинетических исследований автоокисления НАДН в средах с различным значением рН и флуориметрическое определение концентраций перекиси водорода, накапливающейся при таком автоокислении. Показано, что даже в кислых средах при выдерживании раствора при комнатной температуре концентрация образующейся перекиси столь мала (таблица 1), что только через двухчасовой промежуток времени достигает значений, достаточных для инициирования процесса окисления НАДН (1) в результате превращения пероксидазы хрена в компаунд I (2).

НАДН + O2 + H+ > НАД+ + H2O2

Per3+ + H2O2 > компаунд I + H2O

Что касается нейтрального и щелочного значений рН, то в данных условиях концентрация образовавшейся перекиси на два порядка ниже, чем в кислых средах, что недостаточно для инициирования каталитического цикла, включающего превращение пероксидазы хрена в компаунд I.

Таблица 1. Концентрация накопленной перекиси водорода при окислении раствора НАДН в различных средах

Основываясь на полученных данных о пренебрежимо малой скорости автоокисления НАДН в нейтральных и щелочных средах, не приводящего к достаточным концентрациям перекиси, а также принимая во внимание термодинамические и кинетические особенности данной реакции, разумно было предположить, что в отсутствии перекиси водорода инициирующей стадией является акт одноэлектронного переноса в фермент-субстратном комплексе [Per3+???НАДН] с образованием ферропероксидазы (Per2+) (3).

Per3+ + HАДН > [Per3+???НАДН] > Per2+ + HАДН?+

Поскольку образующаяся в акте одноэлектронного переноса ферропероксидаза быстро реагирует с растворенным кислородом буферного раствора с образованием компаунда III (4), для доказательства проявления стадии одноэлектронного переноса между НАДН и пероксидазой хрена в процессе ферментативного окисления, была предпринята попытка остановить реакцию окисления НАДН на стадии образования Per2+, проводя взаимодействие между пероксидазой хрена и НАДН в бескислородной среде.

Per2+ + O2 > компаунд III

Эксперимент проводился на установке остановленной струи, которая позволяет получать трехмерные зависимости оптического поглощения смеси от времени реакции и длины волны. Анализ кинетики взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена на разных длинах волн в фиксированный момент времени показал, что спектр поглощения реакционной смеси представляет собой сумму поглощений исходной пероксидазы и интермедиата стадии инициирования реакции, Per2+.

Действительно, после вычета спектра пероксидазы хрена из суммарного спектра реакционной смеси, результирующим оказался известный из литературы спектр Per2+ с максимумом на 435 нм (рисунок 1).

На основании анализа кинетических кривых, зарегистрированных при проведении реакции между ПХ и НАДН в бескислородной среде, был сделан важный вывод о том, что начальной стадией процесса ферментативного окисления НАДН в отсутствии перекиси водорода, является стадия образования восстановленной формы пероксидазы, ферропероксидазы.

Кроме того, было проведено математическое моделирование кинетической кривой окисления НАДН, катализируемого пероксидазой хрена в присутствии кислорода в буферном растворе, в предположении определенной последовательности стадий взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов пероксидазы (5).

Наилучшее совпадение экспериментальной и расчетной кривых (рисунок 2) получено при включении в модель в качестве первой стадии акта переноса электрона между НАДН и пероксидазой хрена приводящего к образованию восстановленной формы пероксидазы, Per2+.

Полученные результаты позволили впервые обосновать предположение о том, что первой стадией окисления НАДН в аэробных условиях в отсутствии перекиси водорода является акт одноэлектронного переноса между субстратом и нативным ферментом с образованием восстановленной формы пероксидазы хрена, так называемой, ферропероксидазы (Per2+). В этом случае каталитический цикл окисления НАДН пероксидазой отличается от общепринятых представлений и включает последовательность стадий, приведенную на рисунке 3.

В четвертой главе обсуждаются результаты исследований методами спиновой химии (ХПЯ и МЭ) реакций окисления НАДН и нифедипина, катализируемых пероксидазой хрена в аэробных условиях в отсутствии перекиси водорода.

Анализ эффективных констант скоростей, извлекаемых для реакции окисления НАДН, позволил построить экспериментальную полевую зависимость магнитного эффекта, рассчитываемого как отношение средних значений эффективных констант в магнитном поле к соответствующим константам в нулевом поле. При этом такая зависимость от внешнего магнитного поля была зарегистрирована только для константы k1 (рисунок 4) в последовательности стадий (5).

Наиболее вероятной магниточувствительной стадией является акт переноса электрона между нативной ПХ и НАДН. Последующее превращение ферропероксидазы в реакции с кислородом (рисунок 3) протекает в кинетическом диапазоне, поэтому скорость образования компаунда III будет намного меньше скорости гипотетически возможной спиновой конверсии в паре (Per2+ O2), следовательно, этот процесс, скорее всего, не будет спиновозависимым. Взаимодействие компаунда III с радикалом НАД? тоже не может быть источником заметного магнитного эффекта, если в результате его встречи с радикалом НАД? в объеме образуется так называемая F-пара, в которой, как известно, не формируются значительные магнитные эффекты. Что касается последующих стадий каталитического цикла, то при взаимодействии компаунда I и НАДН не происходит формирования РП, а стадия образования пероксидазы в результате реакции между компаундом II и молекулой НАДН вообще не учитывалась в аналитической функции, поскольку в исследованном временном диапазоне данная стадия не наблюдалась. Таким образом, имеются достаточные доказательства полагать, что зависимость константы k1 от напряженности внешнего магнитного поля обусловлена его влиянием на скорость образования ферропероксидазы в процессе одноэлектронного переноса между ПХ и НАДН.

Для проверки предположения о формировании магнитного эффекта на первой стадии каталитического цикла был проведен теоретический расчет полевой зависимости магнитного эффекта для парамагнитной пары (Per2+ НАДН+?). Расчет вероятности рекомбинации исследуемой РП проводился в рамках формализма матрицы плотности для двухпозиционной модели. Основы этого подхода подробно описаны в первой главе диссертационной работы. Предполагалось, что наблюдаемая спиновая эволюция в РП определяется взаимодействием электронных спинов с постоянным внешним магнитным полем, изотропным сверхтонким взаимодействием неспаренных электронов с магнитными ядрами и обменным взаимодействием между неспаренными электронами, которое расщепляет термы радикальной пары на дублетный и квартетный.

Экспериментальная зависимость МЭ (рисунок 4) демонстрирует хорошее согласие с теоретической (рисунок 5) в предположении, что РП (Per2+ НАДН+*) образуется в акте одноэлектронного переноса от НАДН к нативной ПХ в квартетном состоянии.

Интеркомбинационная конверсия переводит нереакционноспособное исходное квартетное спиновое состояние в реакционноспособное дублетное. Последнее в результате рекомбинации (обратного переноса электрона) обеспечивает регенерацию исходной ПХ и НАДН (рисунок 6).

Таким образом, проведенные исследования влияния магнитного поля на кинетику процесса каталитического окисления НАДН пероксидазой хрена продемонстрировали, что начальной стадией ферментативного окисления НАДН в отсутствии перекиси водорода является акт одноэлектронного переноса между субстратом и нативным ферментом с формированием РП (Per2+ НАДН+•).

Дополнительным подтверждением наличия стадии одноэлектронного переноса в каталитическом цикле ПХ стали исследования магнитных эффектов в реакциях ферментативного окисления синтетического аналога НАДН, нифедипина (НФ). Было показано, что при окислении нифедипина наблюдается аналогичная последовательность взаимопревращений активных парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена (5), причем магниточувствительной также оказывается эффективная константа первой стадии процесса. Расчет в рамках теории радикальных пар для многоспиновых систем показал, что экспериментальная зависимость МЭ совпадает с теоретической в предположении, что магниточувствительной стадией, также как и в случае реакции с НАДН, является первая стадия каталитического цикла, то есть окисление НФ так же начинается со стадии одноэлектронного переноса и формирования РП (Per2+ НФ+) в квартетном состоянии.

Кроме того, наблюдение эффекта ХПЯ (рисунок 7) при взаимодействии фотовозбужденного НАДН с пероксидазой хрена, который, согласно теоретическим расчетам, формируется в результате квартет-дублетной эволюции в РП (Per2+ НАДН+•) и проявляется только на С(4) атомах НАДН (рисунок 8), не только подтверждает вывод о возможности переноса электрона между НАДН и гемом пероксидазы, но и позволяет сделать два важных вывода.

Первый вывод касается доказательства образования катион-радикала НАДН, которое постулировалось при анализе магнитного эффекта. Такой вывод имеет принципиально важное значение, поскольку является убедительным доказательством возможности одноэлектронного постадийного окисления НАДН в биологических системах: НАДН > НАДН*+ > НАД* > НАД+. Второй вывод основан на особенностях ингибирования пероксидазы продуктами ферментативного окисления и формирования фермент-субстратного комплекса. Показано, что при неконкурентном ингибировании продуктом окисления (НАД+) реакция смешения ПХ и НАДН не наблюдается. Однако такое неконкурентное ингибирование не влияет на фотоиндуцированный перенос электрона между ферментом и субстратом (возможно, при этом меняются акцепторные свойства пероксидазы, например, полуволновой потенциал восстановления), не препятствуя образованию фермент-субстратного комплекса и не оказывая существенного влияния на расстояния между активным центром фермента и связанным с ним в комплекс субстратом.

Наблюдение влияния внешнего магнитного поля на эффективные константы скорости трансформации активных частиц каталитического цикла пероксидазы указывает на зависимость каталитических процессов от спиновых состояний парамагнитных интермедиатов. Действительно, в рекомбинирующем дублетном состоянии РП приводит к образованию исходной пероксидазы, тем самым, нарушая каталитический цикл (или возвращая его в исходную точку), в то время как в соответствии с правилами отбора РП в нерекомбинирующем квартетном состоянии оказывается предшественником следующей стадии каталитического цикла. Таким образом, в зависимости от мультиплетности исходной парамагнитной пары, внешнее магнитное поле может ускорить или замедлить трансформацию реакционноспособных интермедиатов.

Согласие экспериментальных полевых зависимостей магнитных эффектов, зарегистрированных в процессах окисления, катализируемых пероксидазой хрена, с рассчитанными в рамках развитых приближений теории радикальных пар для многоспиновых ферментативных систем, позволяет сделать важные выводы о детальных механизмах процессов, образующих каталитический цикл.

Молекулярная динамика партнеров фермент-субстратного комплекса должна удовлетворять основным приближениям теории РП, а именно: скорости переноса электрона в ферментативном процессе должны быть близки к диффузионным (иначе невозможно проявление магнитного эффекта), времена жизни активных реагирующих интермедиатов не должны быть длиннее микросекунд, а расстояния в фермент-субстратном комплексе находиться в диапазоне расстояний для неконтактных ион-радикальных пар, то есть ~ 7-10 Е. Расчетные полевые зависимости лучше всего совпадали с экспериментальными (для НАДН и нифедипина, НФ) для субмикросекундных времен жизни пары парамагнитных частиц. Поскольку в основе расчетной модели лежит представление о диффузионном движении партнеров, приходится предполагать, что в ферментативном процессе сохраняется определенная подвижность реагентов. Кроме этого, наличие на полевых зависимостях экстремумов в магнитных полях с напряженностью порядка сотен Гаусс однозначно указывает на проявление электронного обменного взаимодействия между партнерами в каталитическом цикле ПХ. Последнее, очевидно, указывает на связывание субстрата в активном центре фермента.

ВЫВОДЫ

1. В результате спектрофлуориметрических исследований процесса автоокисления НАДН показано, что количество перекиси водорода, накапливающееся при автоокислении НАДН, мало и не может обеспечить протекание постулируемой в литературе первой стадии каталитического цикла пероксидазы хрена - превращение ПХ в активный интермедиат компаунд I.

2. На основании анализа кинетических кривых и спектров поглощения короткоживущих интермедиатов, зарегистрированных при взаимодействии пероксидазы хрена и НАДН в бескислородной среде, сделан вывод, что начальной стадией каталитического цикла пероксидазы хрена является образование ферропероксидазы (восстановленной формы нативной пероксидазы).

3. Предложена кинетическая модель каталитического цикла пероксидазы хрена в процессе ферментативного окисления НАДН и нифедипина, включающая последовательное превращение нативной пероксидазы в ферропероксидазу, компаунд III, компаунд I и, наконец, в компаунд II.

4. Обнаружено влияние постоянного внешнего магнитного поля на кинетику превращения парамагнитных интермедиатов пероксидазы хрена. Продемонстрировано совпадение экспериментального эффекта с рассчитанным в предположении, что магнитный эффект формируется в акте обратного переноса электрона в паре ферропероксидаза и катион-радикал НАДН (или нифедипина).

5. Дополнительное подтверждение магниточувствительных квартет-дублетных переходов продемонстрировано с помощью наблюдения эффекта ХПЯ в парамагнитной паре ферропероксидаза и катион-радикал НАДН (Per2+ НАДН*+).

6. Применение методов спиновой химии также позволило сделать ряд важных заключений об особенностях элементарного акта в ферментативных системах на примере пероксидазы хрена:

6.1 Наличие магнитного эффекта указывает на то, что скорость превращений парамагнитных интермедиатов в каталитическом цикле может зависеть от их спиновых состояний и меняться при воздействии внешнего магнитного поля.

6.2 Совпадение расчетных полевых зависимостей магнитных эффектов, а также эффектов ХПЯ с экспериментальными только с учетом электронного обменного взаимодействия указывает на наличие связывания субстрата с ферментом.

6.3 Полученные доказательства участия радикальных состояний НАДН в реакциях ферментативного окисления указывают на возможность постадийного одноэлектронного окисления НАДН в биологических системах: НАДН > НАДН*+ > НАД* > НАД+.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. Afanasyeva M.S., Taraban M.B., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom C.B., Magnetic spin effects in enzymatic reactions: radical oxidation of NADH by horseradish peroxidase // J. Am. Chem. Soc. - 2006. - V. 128, No. 26. - P. 8651-8658.

2. Afanasyeva M.S., Taraban M.B., Polyakov N.E., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom C.B., Elementary steps of enzymatic oxidation of nifedipine catalyzed by horseradish peroxidase // J. Phys. Chem. B. - 2006. - V. 110, No. 42. - P. 21232-21237.

3. Афанасьева М.С., Пуртов П.А., Тарабан М.Б., Лешина Т.В., Гриссом Ч.Б., Исследование фотоокисления NADH, катализируемого пероксидазой хрена, методом химической поляризации ядер // Изв. РАН, Сер. хим. - 2006. - № 7. - C. 1090-1094.

4. Афанасьева М.С., Пуртов П.А., Тарабан М.Б., Лешина Т.В., Спиновая химия ферментативных процессов // Усп. хим. - 2007. - V. 76, No. 6. - C. 651-668.

5. Афанасьева М.С., Применение методов спиновой химии для изучения цикла окисления NADH, катализируемого пероксидазой хрена. Тезисы докладов XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», секция «Химия», Новосибирск, Россия. - 2004. - C. 132.

6. Afanasyeva M.S., Taraban M.B., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom C.B., New reactive intermediates in enzymatic oxidations studied by means of spin chemistry methods. Book of Abstracts of 2nd International Conference on Natural Products and Physiologically Active Substances. Novosibirsk, Russia. September 12-17, 2004. - P.33.

7. Афанасьева М.С., Тарабан М.Б., Пуртов П.А., Лешина Т.В., Гриссом Ч.Б., Магнитные эффекты в процессах ферментативного окисления пероксидазой хрена. Тезисы докладов XVIII Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, Россия. 22 сентября - 3 октября 2006. - С. 85.

Размещено на Allbest.ru