Исследование нетермического воздействия терагерцового излучения на геносенсорные клетки E.coli/pKatG-gfp и E.coli/pСopA-gfp

Размещено на http://www.allbest.ru/

Институт цитологии и генетики СО РАН

Институт ядерной физики СО РАН

Исследование нетермического воздействия терагерцового излучения на геносенсорные клетки E.coli/pKatG-gfp и E.coli/pСopA-gfp

Е.В. Демидова, Т. Н. Горячковская,

Т. К. Малуп, С. В. Банникова, В.M. Попик,

А. И. Семенов, С. Е. Пельтек

Аннотация

терагерцовый излучение нетермический геносенсор

Изучение воздействия терагерцового излучения на живые объекты представляет огромный интерес в связи развитием систем безопасности. Нами было изучено нетермическое воздействие терагерцового излучения на клетки геносенсоров E.coli/pKatG-gfp и E.coli/pCopA-gfp. В качестве источника терагерцового излучения был использован новосибирский лазер на свободных электронах NovoFEL, имеющий рекордные характеристики средней и пиковой мощностей. Показано, что терагерцовое излучение с плотностью мощности 1.4 ватт/см² индуцирует работу генов katG и copA.

Введение

Терагерцовое излучение имеет ряд уникальных свойств. Широкий диапазон частот предполагает обширный спектр материалов, восприимчивых к данному спектру -- от полупроводников до человеческих тканей. Это неионизирующее излучение, хорошо проходящее через мутные среды и мелкодисперсные материалы, что делает перспективным его использование в таких областях как диагностическая медицина [1, 2], спектроскопия [3,4] и системы безопасности [5].

Перспективы широкого применения делают актуальным изучение эффектов терагерцового излучения на живые объекты. Несмотря на неионизирующую природу, необходимо проведение исследований механизмов взаимодействия терагерцового излучения с биомолекулами, а также его влияния на живые системы в целом. Результаты подобных исследований, объединенных интернациональным проектом «THz-BRIGE» [6], конечной целью которого являлась оценка биологических эффектов терагерцового излучения, оказались достаточно противоречивы. В ходе исследований, связанных с этим проектом, во многих случаях было показано, что воздействие терагерцового излучения на биологические образцы было опосредовано в первую очередь тепловым эффектом. Этот вывод не являлся неожиданным, так как терагерцовое излучение сильно поглощается водой [7], что приводит к нагреву биологических образцов, содержащих как правило более 80% воды. Некоторые исследования проекта «THz-BRIGE» выявили генотоксический эффект воздействия терагерцового излучения.. Так, было показано, что экспозиция в течение 6 часов 0.1 ТГц приводит к повышению геномной нестабильности человеческих лимфоцитов [8]. В другом проведенном исследовании, воздействие терагерцового излучения изменяло проницаемость мембран липосом [9]. С другой стороны, исследования воздействия излучения на человеческие лейкоциты периферической крови и культуры кераноцитов и нервных клеток человека показали отсутствие какого-либо эффекта [10]. Было обнаружено, что излучение терагерцового диапазона вызывает частичное и даже полное разрушение водородных связей между комплиментарными цепями ДНК. Такое воздействие на ДНК может существенно менять степень конденсации ДНК в хромосоме и как следствие участвовать в регуляции экспрессии генов и репликации ДНК [11]. В экспериментах на стволовых клетках мыши установлено, что более 10 % генов меняют уровень экспрессии в ответ на длительное (от двух до шести часов) облучение терагерцовым излучением [12]. Дрожжи S. сerevisiae достоверно увеличивают скорости роста микроколоний под воздействием излучения 0,2 - 0,3 ТГц [13]. В тканях гипокотиля проростков посевного льна Linum usitatissimum излучение длиной волны 0,1 ТГц вызывает образование клеток меристемы после облучения в течение двух часов [14].

Для того, чтобы понять, какие клеточные процессы вовлечены в развитие ответной реакции на терагерцовое излучение удобно использовать геносенсорные конструкции. Геносенсор -- это искусственная генетическая репортерная система, чувствительным элементом которой является промотор гена-сенсора, активируемый в ответ на стрессовое воздействие. Существенным элементом этой системы является ген флюоресцентного белка, находящийся под регуляторным контролем промотора гена-сенсора.

К настоящему времени разработан ряд достаточно эффективных геносенсорных конструкций на основе промоторов генов E. coli, которые являются ключевыми звеньями ответов бактериальной клетки на стрессирующее воздействие. Это, в основном, сенсоры, чувствительные к окислительному стрессу [15, 16] и тяжелым металлам [17, 18]. Также разработаны сенсоры, специфически отвечающие на повреждения ДНК, белков и клеточных мембран [19].

Таким образом, стрессирующее воздействие терагерцового излучения можно не только наглядно продемонстрировать, но и определить какой вид стресса при этом испытывает клетка.

Материалы и методы

Эксперименты проводились на базе терагерцового лазера на свободных электронах (ЛСЭ) в «Сибирском центре синхротронного и терагерцового излучения», спроектированного и запущенного в действие Институтом ядерной физики СО РАН [20].

Для контроля температуры жидких образцов при поглощении терагерцового излучения использовали высокочувствительный тепловизор ТКВр-СВИТ101, производства Института физики полупроводников СО РАН [21].

Подготовка клеток геносенсора

В эксперименте использовались рекомбинантные бактерии E. coli JM103, содержащие плазмиду pKat-gfp (геносенсор E.coli/pKatG-gfp) [22] и плазмиду pCopA (геносенсор E.coli/pCopA-gfp). В качестве репортерного белка использовался белок GFPaav, характеризующийся интенсивной флуоресценцией и временем полужизни 60 мин [23]. Для проведения опыта ночные культуры клеток подращивали в свежей среде Luria-Bertani (LB) с 100 мкг/мл ампициллина до среднелогарифмической фазы. Далее клетки переводили на минимальную среду. Для геносенсора E.coli/pKatG-gfp использовалась минимальная среда М9 ( 0,4% глюкоза, 0.2% казаминовые кислоты, 48 mM Na₂HPO₄, 22 mM KH₂PO₄, 18,7 mM NH₄Cl 8,5 mM NaCl, 1 mM MgSO₄, 0,1 mM CaCl₂, ампициллин 100 мкг/мл). Для геносенсора E.coli/pCopA-gfp использовалась минимальная среда GGM (0.5% глюкоза, 40 mM 3-[N-Морфолино]пропансульфоновой кислоты (MOPS), 18 mM NH₄Cl, 13 mM KCl, 5 mM K₂SO₄, 5 mM в-Глицерин фосфата динатриевой соли, 1 mM MgCl₂, 0.07 mM CaCl₂, ампициллин 100 мкг/мл).

Экспонирование бактериальных клеток, содержащих геносенсорную конструкцию

Аликвота культуры объемом 50 мкл помещалась в специально изготовленную кювету между двумя натянутыми полипропиленовыми пленками толщиной 40 мкм. При этом толщина облучаемого объема жидкости составляла 40 мкм (рис. 1). Сечение пучка излучения в плоскости кюветы представляет собой вытянутый эллипс. Для обеспечения равномерного экспонирования образца по всему объему, кювету вращали. Для регулировки средней мощности излучения при условии неизменности пиковой мощности был использован обтюратор. Для изменения плотностей средней и пиковой мощностей образец позиционировался в разных точках фокусировки излучения после обтюратора. Температуру среды в кювете поддерживали на уровне 35 ± 2єС путем настройки обтюратора.

Определение флюоресценции Gfp-белка геносенсорных конструкций после индукции

После воздействия терагерцовым излучением проводилось измерение флюоресценции через каждые 20 минут в течение 200 минут на флуориметре Perkin Elmer VICTOR3. В качестве положительного контроля работы геносенсоров использовали индукцию синтеза Gfp-белка 2.5 мМ перекисью водорода для геносенсора E.coli/pKatG-gfp и 12 мкM сульфатом меди для геносенсора E.coli/pCopA-gfp. В качестве отрицательного контроля служила культура клеток, которая не подвергалась каким-либо воздействиям.

Подсчет количества клеток на агаризованнных средах

Для того, чтобы оценить переживаемость клеток в эксперименте был проведен ряд высеваний клеток на плотную агаризованную среду с ампициллином (100 мкг/мл) сразу после облучения и, затем, после окончания измерения флюоресцентного сигнала, т. е. с интервалом около 3-4 часов. Перед высеванием проводилось разведение культуры в 100 000 раз и засевалось 50 мкл на чашку. Всего было проведено 5 экспериментов с высеванием, где использовались клетки отрицательного контроля и опытного облученного образца геносенсора Е.coli/pKatG-gfp.

Результаты

Проведена серия экспериментов облучения клеток геносенсоров E.coli/pKatG-gfp и E.coli/pCopA-gfp терагерцовым излучением при длине волны 130 мкм. На рисунках 2 и 3 приведены значения уровня экспрессии Gfp-белка при индукции клеток геносенсора терагерцовым излучением с плотностью мощности 1.4 Вт/см² и длиной волны 130 мкм в течение 15 минут. Из рисунков 2 и 3 видно, что облучение терагерцовым излучением в течение 15 мин при длине волны 130 мкм приводит к индукции экспрессии Gfp-белка в клетках геносенсоров E.coli/pKatG-gfp и E.coli/pCopA-gfp. Для каждого случая было проведено три независимых эксперимента. Результаты обрабатывались с применением метода линейной регрессии. При сравнении в одном и том же эксперименте отрицательного контроля и опыта с применением t-критерия Стьюдента получали статистически значимое различие с во всех экспериментах (P<0.01). Из рисунков 2 и 3 видно, что для разных геносенсоров диманика ответной индукции Gfp-белка после облучения имеет разный характер. Для геносенсора E.coli/pCopA-gfp ответная реакция клеток в экспериментах с облучением менее выражена, чем в положительном контроле. Для геносенсора E.coli/pKatG-gfp следует отметить позднее развитие ответной реакции клеток в экспериментах с облучением, при этом в опыте она, как правило, более выражена, чем в положительном контроле. Одной из причин этого наблюдения могло бы быть значительное увеличение количества клеток в экспериментальном облученном образце по сравнению с отрицательным контролем, что может привести, соответственно, и к увеличению количества флюоресцентного белка GFP в эксперименте. Для исследования данного вопроса был проведен ряд высеваний культур из образцов отрицательного контроля и опыта на плотную агаризованную среду сразу после облучения и в конце проведения замеров флюоресценции. Полученные результаты показали отсутствие ощутимых отличий в количестве клеток опытного и контрольного образцов, высеянных после проведения замеров флюоресценции (данные не приводятся). Следовательно, значительное увеличение флюоресценции связано с продолжающейся продукцией белка GFP в клетках геносенсора, облученных терагерцовым излучением.

Обсуждение

Показано, что воздействие терагерцовым излучением приводит к индукции устойчивой экспрессии гена-репортёра, находящегося под регуляторным контролем гена katG, чувствительного к окислительному стрессу, и гена copA, кодирующего АТФазную помпу, которая принимает участие в эффлюксе ионов Cu+ и Ag+. [24]. Гены katG и copA относятся к разным генным сетям стрессового ответа в клетках E. сoli. Индукция katG происходит при контакте клетки с активными формами кислорода (супероксид (O₂), синглетный кислород, Н₂О₂, радикал гидроксила (ОН') и т.п.). Индукция гена copA происходит в среде, содержащей избыток ионов меди или серебра.

В эксперименте наблюдалась различная динамика ответов геносенсора E.coli/pKatG-gfp на перекись водорода и терагерцовое излучение. Характер кривой ответа на перекись водорода имеет максимум через 100-120 минут после добавления индуктора. Показано, что концентрация клеток в образцах отрицательного и положительного контроля одинакова, таким образом, наличие максимума индукции непосредственно связано с индукцией геносенсора и увеличением количества GFP белка. После максимума следует снижение флюоресценции, связанное со снижением уровня экспрессии GFP белка вследствие переработки индуктора, что показано во многих экспериментальных работах [25]. Из рисунка 2 видно, что клетки реагируют на терагерцовое излучение индукцией синтеза GFP белка под регуляторным контролем промотора гена katG. Кинетика индукционного ответа, полученная после воздействия терагерцового излучения, имеет принципиально другой характер. Заметное накопление GFP белка нами наблюдается в через 150-180 минут после начала эксперимента (рис. 2). В пределах измеряемого времени снижение концентрации GFP белка в клетках не происходит. Из приведенных выше данных следует, что в рамках проведенных измерений концентрация GFP белка в клетках после облучения терагецовым излучением постоянно растет.

Динамика ответа геносенсора E.coli/pCopA-gfp на сульфат меди и терагерцовое излучение находит больше схожести. Из рисунка 3 видно, что клетки реагируют на терагерцовое излучение индукцией синтеза GFP белка под регуляторным контролем промотора гена copA. Ответная реакция в виде увеличения флуоресценции начинается примерно одновременно, через 40-60 минут, при этом ярко выражена разница в уровне индукции флюоресцентного белка, которая существенно выше у положительного контроля, чем у облученных клеток.

Реакция клеток геносенсора на терагерцовое излучение свидетельствует о том, что клетка E. coli в условиях облучения терагерцовым излучением испытывает стресс. Причем ответ развивается с участием обеих изученных стрессовых систем. Однако, различия в динамике ответа на терагерцовое излучение и специфические индукторы свидетельствуют о разных путях активации генных сетей стрессового ответа в случае индукции перекисными соединениями или катионами меди по сравнению с терагерцовым излучением. Отсутствие быстрого ответа облученных клеток, характерного для перекисных соединений, и высокого уровня флюоресценции, характерного для одновалентных ионов может свидетельствовать о том, что возможна опосредованная активация транскрипционных факторов окислительного стресса.

Известно, что промотор гена katG содержит сайты связывания транскрипционных факторов OxyR и FNR (для FNR сайт гипотетический) [26], которые осуществляют положительную регуляцию гена katG. OxyR регулон играет центральную роль в защите клеток E. coli против эндогенного окислительного стресса, связанного с активным аэробным ростом. Промотор гена сорА содержит сайт связывания транскрипционного фактора сueR, который связываясь с ионами Cu+ и Ag+ осуществляет положительную регуляцию гена сорА. Точный механизм активации неясен. Также известно, что в промоторной области сорА содержится гипотетический сайт связывания глобального транскрипционного фактора FruR [27]. Примечательно, что гипотетический сайт связывания глобального транскрипционного фактора FruR был также обнаружен у гена crp, который вовлечен в генную сеть окислительного стресса и опосредованно (через OxyR) активирует траскрипцию гена katG. FruR обеспечивает переключение между анаболизмом и катаболизмом сахаров, в случае недостатка сахаров активируя анаболические пути, а в случае их избытка - катаболические. В отсутствие эффекторов - фруктозы-1-фосфата или фруктозы-1,6-дифосфата - белок-регулятор связывается с ДНК, репрессируя гены, необходимые для транспорта и катаболизма сахаров и активируя гены, необходимые для процессов глюконеогенеза. Появление же эффекторов, свидетельствующих о наличии углеводов в среде приводит к дерепрессии генов фосфотрансферазных систем, гликолиза, пути Энтнера-Дудорова и пентозофосфатного пути. При этом инактивируется экспрессия генов цикла Кребса, глиоксилатного пути и глюконеогенеза [28-30].

Таким образом, можно предположить, что при активации промоторов генов katG и copA в результате воздействия терагерцовым излучением задействованы механизмы генерализованного ответа клетки, включающего в себя обе стрессовые системы, изученные в настоящей работе.

Список литературы

1. Ashworth P. C., Pickwell-MacPherson E., Provenzano E., Pinder S. E., Purushotham A. D., Pepper M., Wallace V. P.//Optics Express, 2009. Т. 17 № 15. С. 12444-12454.

2. Suen J. Y., Tewari P., Taylor Z. D, Grundfest W. S., Lee H., Brown E. R., Culjat M. O., Singh R. S.//Studies in Health Technology and Informatics, 2009. Т. 142. С. 364-368.

3. Plusquellic D. F., Siegrist K., Heilweil E. J., Esenturk O.//Chemphyschem, 2007 Т. 8. № 17. 2412-2431.

4. Cao B. H., Zhang G. X., Hou D. B., Huang P. J., Zhou Z. K.//Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi, 2009. T. 29. № 7. С. 1729-1731.

5. Shen F., Ying Y. B.//Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi, 2009. Т. 29. № 6. C. 1445-1449.

6. http://www.frascati.enea.it/THz-BRIDGE/

7. Kristensen T. T. L., Withayachumnankul W., Jepsen P. U., Abbott D.//Optics Express, 2010. Т. 18. № 5. С. 4727-4739.

8. Korenstein-Ilan A, Barbul A, Hasin P.//Radiation research, 2008. Т. 170. № 2. С. 224-234.

9. Ramundo-Orlando A., Gallerano G. P., Stano P., Doria A., Giovenale E., Messina G., Cappelli M., D'Arienzo M., Spassovsky I.//Bioelectromagnetics, 2007. Т. 28. № 8. С. 587-598.

10. Bourne N., Clothier R. H., D'Arienzo M., Harrison P.//Altern Lab Anim., 2008. T. 36. № 6. С. 667-684.

11. Alexandrov B. S., Gelev V., Bishop A. R., Usheva A, Rasmussen K. O.//Phys Lett A., 2010. T. 374 № 10. С. 1214.

12. Bock J., Fukuyo Y., Kang S., Phipps M. L., Alexandrov L. B., Rasmussen K. Ш., Bishop A. R., Rosen E. D., Martinez J. S., Chen H. T., Rodriguez G., Alexandrov B. S., Usheva A.// PLoS One., 2010. Т. 5. № 12. e15806.

13. Hadjiloucas S., Chahal M. S., Bowen J. W.//Phys Med Biol., 2002. T. 47. № 21. С. 3831-3839.

14. Tafforeau M., Verdus M. C., Norris V., White G. J., Cole M., Demarty M., Thellier M., Ripoll C.//Bioelectromagnetics, 2004. T. 25. № 6. С. 403-407.

15. Belkin S., Smulski D. R., Vollmer A. C., Van Dyk T. K., Larossa R. A.//Applied and Environmental Microbiology, 1996. Т. 62. № 7. С. 2252-2256.

16. D'Souza, S.F.//Biosensors and Bioelectronics, 2001. Т. 16. № 6. С. 337-353.

17. Virta M., Tauriainen S., Karp M.// Methods in Molecular Biology, 1998. Т. 102. С. 219-229.

18. Tauriainen S., Karp M., Chang W., Virta M.//Biosensors and Bioelectronics, 1998. Т. 13 № 9. С. 931-938.

19. Kim B.C., Gu M.B.//Biosensors and Bioelectronics, 2003. Т. 18 № 8. С. 1015-1021.

20. Gavrilov N. G., Knyazev B. A., Kolobanov E. I., Kotenkov V. V., Kubarev V. V., Kulipanov G. N., Matveenko A. N., Medvedev L. E., Miginsky S. V., Mironenko L. A., Oreshkov A. D., Ovchar V. K., Popik V. M., Salikova T. V., Scheglov M. A., Serednyakov S. S., Shevchenko O. A., Skrinsky A. N., Tcheskidov V. G., Vinokurov N. A. Status of the Novosibirsk high-power terahertz FEL. //Nuclear instruments and methods in physics research A, 2007. Т. 575. С. 54-57.

21. Kuryshev G. L., Kovchantsev A. P., Vainer B. G.// Avtometriya, 1998. Т. 4. С. 5-12.

22. Khlebodarova T. M., Tikunova N. V., Kachko A. V., Stepanenko I. L., Podkolodny N. L., Kolchanov N. A.//Bioinformatics and Computational Biology, 2007. T. 5. № 2(b). C. 507-520.

23. Andersen J., Sternberg C., Poulsen L. K., Bjorn S. P., Givskov M., Molin S.//Applied and Environmental Microbiology 1998. Т. 64. № 6. С. 2240-2246.

24. Rensing C., Ghosh M., Rosen B.// J. Bacteriol., 1999. Т. 181 № 9. С. 5891 - 5897.

25. Lu C, Albano C. R., Bentley W. E. Rao G.//Biotechnol. Bioeng., 2005. Т. 89. № 5. С. 574-587.

26. http://ecocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE?type=GENE&object=EG10511

27. Изучение эволюции регуляторных систем прокариот методами сравнительно-геномного анализа, к. б. н. Рачеев Дмитрий Андреевич, Институт проблем передачи информации им. А. А. Харкевича, Москва, 2009.

28. Ramseier T. M., Bledig S., Michotey V., Feghali R., Saier M. H.//Mol. Microbiol., 1995. Т. 16. № 6. С. 1157-1169.

29. Saier M. H., Ramseier T. M.//J. Bacteriol, 1996. T. 178. № 12. C. 3411-3417.

30. Saier M. H.//FEMS Microbiol. Lett., 1996. T. 138. № 2-2. С. 97-103.

Приложения

Рисунок 1 Схематичное изображение кюветы для экспонирования биологических образцов

Рисунок 2 График индукции флуоресценции в клетках геносенсора E.coli/pKatG-gfp в результате облучения терагерцовым излучением длиной волны 130 мкм в течение 15 минут. Отрицательный контроль - необлучённые клетки, положительный контроль - в качестве индуктора в культуру клеток добавлена 2.5 мМ перекись водорода. FLU - флюоресценция в относительных единицах

Рисунок 3 График индукции флуоресценции в клетках геносенсора E.coli/pСopA-gfp в результате облучения терагерцовым излучением длиной волны 130 мкм в течение 15 минут. Отрицательный контроль - необлучённые клетки, положительный контроль - в качестве индуктора в культуру клеток добавлен 12 мкМ сульфат меди. FLU - флюоресценция в относительных единицах

Размещено на Allbest.ru