Полная исследовательская публикация __________ Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б. и Чухно А.С.

Размещено на http://www.allbest.ru/

136 _____________ http://butlerov.com/ _____________ ©--Butlerov Communications. 2013. Vol.34. No.6. P.135-140.

Тематический раздел: Физико-химические исследования. Полная исследовательская публикация

Подраздел: Биохимия. Регистрационный код публикации: 13-34-6-135

г. Казань. Республика Татарстан. Россия. _________ ©--Бутлеровские сообщения. 2013. Т.34. №6. _________ 135

УДК 544.72.544.77

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия

Электрокинетические свойства гемоглобина в водных растворах 1-, 2- и 3-зарядных ионов

Чухно Александр Сергеевич

Данная статья является второй из цикла статей, посвященных природным порфиринам. В первой статье [1] приводятся результаты исследований устойчивости и электрокинети-ческих свойств водных дисперсий лошадиного и бычьего гемоглобинов в растворах KCl, KCl + HCl, KCl + KOH в зависимости от рН, ионной силы раствора и времени адсорбции. Уста-новлено, что: кислотно-основное равновесие для водных дисперсий гемоглобина устанавли-вается в течение восьми часов; определены значения изоэлектрических точек для дисперсий лошадиного гемоглобина и для дисперсий бычьего гемоглобина; показано, что с ростом ион-ной силы раствора наблюдается уменьшение электрокинетического потенциала в соответст-вии с классической теорией ДЭС (двойного электрического слоя) [1].

Учитывая, что гемоглобин относится к полиамфолитам [2], на его поверхности в водных растворах адсорбируются одновременно ионы Н+ и ОН-. В общем виде можно записать две условные поверхностные реакции:

где S - символ поверхности.

Соответственно в зависимости от того, адсорбция каких ионов преобладает, поверхность приобретает либо положительный, либо отрицательный заряд [3, 4].

Благодаря этому возможно поддержание постоянного значения рН крови. Например, в результате физических нагрузок в организм может поступить большое количество молочной кислоты. Если такое же количество молочной кислоты прибавить к объему дистиллированной воды, равному объему циркулирующей крови, то концентрация ионов Н+ возросла в ней в 40 000 раз. Реакция же крови при этих условиях практически не изменяется, что объясняется наличием буферных систем крови [5]. Однако в крови помимо Н+ и ОН- ионов присутствуют множество других ионов (Na+, K+, Mg2+, Ca2+, HCO3-, Cl-, HPO42-, SO42-,... ионы органических веществ, например, аминокислот), которые в свою очередь также оказывают влияние на адсорбцию протонов и гидроксилионов на гемоглобине, его буферную емкость, конфор-мацию, устойчивость и, в конечном счете, способность переносить кислород.

Изучение электрокинетических свойств водных дисперсий гемоглобина в зависимости от состава водной фазы (рН, присутствие различных ионов) позволит охарактеризовать его коллоидные свойства, определяющие поведение и свойства дисперсных систем, содержащих гемоглобин.

Исследования электрокинетических свойств водных дисперсий гемоглобина интересны не только своей новизной, но и тем, что позволяют выявить особенности поведения биологи-чески активного вещества, показать границы применимости коллоидных закономерностей, выведенных прежде всего для неорганических соединений.

Поэтому в задачи данной работы входило проанализировать влияние различных катио-нов и анионов в водных дисперсиях бычьего гемоглобина на его электрокинетические свойст-ва (электрокинетический потенциал и положение изоэлектрической точки в зависимости от природы ионов, их заряда, концентрации и рН) и установить выполняются ли основные закономерности классической теории ДЭС, так как в целом ряде работ обнаружено их нарушение для систем, содержащих растворы ВМВ [6, 7].

Экспериментальная часть

В качестве объектов исследований использовался бычий гемоглобин (hemoglobin from bovine blood), выделенный и очищенный компанией Fluka Analytical, Швеция. Все химические реактивы, используемые в работе, были класса ХЧ. Для приготовления растворов использовалась бидистил-лированная вода. В работе использовалась 0.1% дисперсия гемоглобина, приготовленная следующим образом: навеска гемоглобина растиралась в ступке в небольшом количестве исследуемого раствора до образования густой пасты, затем добавлялся весь объем раствора, далее полученную смесь переносили в ячейку для диспергирования и обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут (использовался ультразвуковой генератор марки УЗГ15-0.1/22).

Электрокинетический потенциал (ж-потенциал) частиц гемоглобина определялся методом мик-роэлектрофореза [8, 9]. Погрешность измерений электрокинетического потенциала не превышала 10%.

Величина электрокинетического потенциала рассчитывалась по уравнению Гельмгольца-Смолуховского. Уравнение использовалось без поправок, так как выполнялись условия ka>>1, где k - обратная толщина ДЭС, а - радиус частиц. рН растворов для каждой соли создавалось концентрацией соответствующей кислоты: KCl - HCl, K3PO4 - Н3PO4, C3H5O(COOК)3 - C3H5O(COOН)3, K2SO4 - Н2SO4, К2СО3 - H2СO3.

Как было показано в первой статье адсорбционное равновесие в системе гемоглобин - водный раствор наступает в течение восьми часов, поэтому для удобства все измерения проводились через сутки [1].

Результаты и их обсуждение

Рассмотрим влияние одно, двух и терехзарядных анионов на электрокинетический потенциал водных дисперсий гемоглобина в зависимости от рН.

В крови содержатся в больших количествах хлорид, фосфат* - ионы и в несколько мень-ших сульфат-ионы.

Присутствие этих ионов, если они сорбируются только за счет электростатического взаимодействия, должно влиять на положительные значения электрокинетического потен-циала, то есть для области значений рН, меньших значения рН изоэлектрической точки вод-ных дисперсий бычьего гемоглобина рНИЭТ = 6.6 ± 0.1.

Из зависимости (рис. 1) видно, что влияние "фосфат"-ионов на значение электрокине-тического потенциала водных дисперсий бычьего гемоглобина будет таким же, как и для хлорид-ионов.

Это объясняется тем, что ортофосфорная кислота трехосновная и в кислой области анионы этой кислоты представлены гидрофосфат-ионами и дигидрофосфат-ионами, причем концентрация однозарядных ионов будет преобладать.

Рис. 1. Зависимость электрокинетического потенциала от рН для водных дисперсий бычьего гемоглобина в присутствии хлорида и фосфата калия (концентрация солей 5·10-4 моль/л)

Рис. 2. Зависимость электрокинетического потенциала от рН для водных дисперсий бычьего гемоглобина в присутствии цитрат, сульфат и хлорид-ионов (концентрация солей 5·10-4моль/л)

Рассмотрим влияние одно-, двух- и трехзаряных анионов на значения электрокинети-ческого потенциала в зависимости от рН (рис. 2).

Довольно сложно найти вещество, содержащееся в крови и дающее трехзарядные анионы в рассматриваемом диапазоне рН, так как большинство таких веществ диссоциирует ступенчато, например, фосфорная кислота. Поэтому в качестве "трехзарядных ионов" возьмем цитрат-ионы, так как цитрат натрия 1-замещённый используют для консервирования крови, чтобы связать большую часть ионов кальция. Без ионов кальция кровь дольше хранится, не происходит коагуляции - слипания эритроцитов и других клеток крови [10].

Слабая трехосновная кислота в растворе подвергается электролитической диссоциа-ции. Константы диссоциации лимонной кислоты в водных растворах довольно близки (при 25 °С: рК1 = 3.128, рК2 = 4.761, рК3 = 5.396 [11]) и содержание трехзарядных анионов и в рассмат-риваемом диапазоне рН (рН = 4.2-6.5) довольно велико в отличие от уже рассмотренной фос-форной кислоты (рК1 = 2.148, рК2 = 7.198, рК3 = 11.9 [11]).

В ряду хлорид-, сульфат-, цитрат-ионы с увеличением заряда иона значения электро-кинетического потенциала уменьшаются, что соответствует классической теории ДЭС (рис. 2).

В области рН < 5 происходит сближение значений электрокинетического потенциала для сульфат- и цитрат-ионов, что связано с уменьшением количества трехзарядных цитрат-ионов и увеличением количества двухзарядных гидроцитрат-ионов, а затем появления и однозарядных дигидроцитрат-ионов (табл. 1).

Также рассматриваемые ионы сорбируются неспецифически, так как значения изо-электрических точек гемоглобина, полученных в присутствии этих ионов в пределах погреш-ности совпадают с изоэлектрической точкой гемоглобина в растворах потенциалопределяю-щих ионов Н+ и ОН-.

Как известно, гемоглобин переносит не только кислород от органов дыхания к тканям, но и углекислый газ от тканей к органам дыхания. В соответствии с полученными данными (рис. 3) карбонат-ионы по сравнению с хлорид-ионами смещают изоэлектрическую точку гемоглобина в кислую область от значений рН = 6.6±0.1 до рН = 6.3±0.1. Это свидетельствует о том, что карбонат-анионы специфически сорбируются на гемоглобине.

У гемоглобина в щелочной области противоионами будут катионы, в кислой - анионы. Поэтому влияние анионов на электрокинетические свойства гемоглобина при рН равных рН крови не так важно, как влияние катионов. рН крови человека - слабощелочная (рН ? 7.4), при этом у взрослого человека содержание калия (противоионов) в крови 3.5-5.0 ммоль/л. анион катион гемоглобин микроэлектрофорез

Рассмотрим влияние концентрации одно- и двухзарядных катионов на значение электро-кинетического потенциала (рис. 4).

В соответствии с теорией ДЭС значения электрокинетического потенциала по абсолютной величине с увеличением заряда и концентрации противоионов уменьшаются. Влияние ионов кальция, магния, калия и натрия также соответствует их положению в лиотропном ряду.

Табл. 1. Присутствие одно-, двух- и трехзарядных форм цитрат-ионов в растворе в зависимости от рН

Рис. 3. Зависимость электрокинетического потенциала от рН для водных дисперсий бычьего гемоглобина в присутствии карбонат и хлорид-ионов (концентрация солей 5·10-4 моль/л)

Рис. 4. Зависимость значений элетрокинетического потенциала водных дисперсий бычьего гемоглобина от отрицательного логарифма концентрации одно- и двухзарядных катионов металлов

Рис. 5. Зависимость значений элетрокинетического потенциала водных дисперсий бычьего гемоглобина от отрицательного логарифма концентрации катионов железа(II и III)

Рассмотрим также зависимости электрокинетического потенциала от концентрации катионов для сульфатов железа(II и III) (рис. 5). Как видно из рисунка, и те и другие ионы вызывают перезарядку поверхности в отличие от катионов кальция и магния.

В данном случае это объясняется тем, что во-первых ионы железа сильно гидролизу-ются, гидролизованные ионы в растворе поляризуются и способны адсорбироваться в сверх-эквивалентных количествах, кроме того железо, являясь переходным металлом способно образовывать комплексы как с ионами в растворе, так и на поверхности гемоглобина, вследст-вие ярко выраженных акцепторных свойств катионов железа.

Увеличение концентрации сульфатов железа сказывается на значениях рН дисперсий гемоглобина (табл. 2), что также способствует процессу перезарядки поверхности.

Зависимости электрокинетического потенциала от концентрации одно- и двух-зарядных катионов хорошо согласуются с зависимостями электрокинетического потенциала от рН в присутствии этих ионов (рис. 6).

Табл. 2. Зависимость электрокинетического потенциала от концентрации сульфата железа(II и III) и от рН

В области рН > рНИЭТ отрицательные значения элкектрокинетического потенциала гемо-глобина уменьшаются по абсолютной величине в ряду Na+>K+> Mg2+>Ca2 в соответствии с их зарядом и положением в лиотропном ряду.

В области рН<рНИЭТ положительные значения электрокинетического потенциала умень-шаются с увеличением ионной силой раствора, которая будет больше для хлоридов двухза-рядных ионов.

Следует отметить, что на рис. 2 и рис. 6 ярко выражено влияние природы противоионов. Сопоставим эти рисунки. На рис. 2 приведены данные электрокинетического потенциала для различных анионов и одного вида катионов - калия. Видно, что влияние анионов сказывается только в положительной области, где анионы являются противоионами.

Рис. 6. Зависимость значений элетрокинетического потенциала от рН водных дисперсий бычьего гемоглобина в присутствии различных одно- и двухзарядных катионов металлов (концентрация солей 5·10-4 моль/л)

Обратная картина имеет место на рис. 6, где приведены данные для различных катионов и одного вида анионов - хлора. Видно, что влияние катионов проявляется только в отрица-тельной области значений электрокинетического потенциала, где рН>рНИЭТ, и не сказывается области рН<рНИЭТ.

Впервые проведены комплексные исследования электрокинетических свойств гемогло-бина в растворах одно, двух- и трехзарядных анионов и катионов (K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+, CO32-, HPO42-/H2PO4-, Cl-, SO42-, C3H5O(COO)33-) в зависимости от их концентрации, заряда, рН и времени адсорбции.

Выводы

1. Ионы K+, Na+, Ca2+, Mg2+, HPO42-/H2PO4-, Cl-, SO42-, C3H5O(COO)33- сорбируются на гемоглобине за счет простого электростатического взаимодействия как противоионы, так как не смещают значения изоэлектрической точки по сравнению с потенциал определяющими ионами Н+ и ОН-.

2. Катионы Fe2+ и Fe3+ сорбируются на гемоглобине не только за счет простого электро-статического взаимодействия, но и специфически, так как они вызывают перезарядку поверхности вследствие сверхэквивалентной адсорбции.

3. Анионы СО32- смещает изоэлектрическую точку гемоглобина по сравнению с потен-циал определяющими ионами Н+ и ОН-, что свидетельствует о их специфической сорб-ции.

4. Влияние электролитов на электрокинетические свойства гемоглобина соответствует классической теории ДЭС.

Литература

[1] Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно А.С. Электрокинетические свойства гемоглобина в водных растворах НСl и KCl. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.30. №6. С.103-107.

[2] Дамаскин Б.Б., Петрий О.А., Цирлина Г.А. Электрохимия. 2ое изд., испр. и перераб. М.: Химия, Колосс. 2006. 624с.

[3] Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. 4-е изд. испр. и доп. СПб: Лань. 2010. 416с.

[4] Чухно С., Дмитриева И.Б., Мартынов Д.В. Изоэлектрическая точка белков в водных растворах азолов. Вестник СПбГУ. 2011. Сер.4. Вып.2. С.124-134.

[5] Покров В.П., Коротько Г.Ф. Физиология человека. М.: Медицина. 2001. 656с.

[6] J.M. Peula-Garcia, R. Hidalgo-Alvarez, de las F.J. Nieves. Colloid stability and electrokinetic characterization of polymer colloids prepared by different methods. Colloids & Surface. A. 1997. Vol.127. No.1-3. P.19-24.

[7] Меньшикова А.Ю., Скуркис Ю.О., Дмитриева И.Б., Кучук В.И., Евсеева Т.Г., Шабсельс Б.М. Влияние модификации белком при неполном заполнениии поверхности на электроповерхностные свойства микросфер сополимеров стирола и акролеина. Коллоид. журн. 2001. Т.63. №5. С.1-8.

[8] Чухно А.С., Дмитриева И.Б., Мартынов Д.В. Влияние солей одно-, двух- и трехзарядных катионов металлов на сорбцию Н+ и ОН- ионов на декстране. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.27. №14. С.47-54.

[9] I.B. Dmitriyeva, K.P. Tikhomolova, A.S. Chukhno, P.P. Prokopovich, V.M. Starov. Investigation of the electrosurface properties of NiO and Fe2O3 in azole solutions. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. 2007. Vol.241. No.1-3. P.45-59.

[10] Рагимов А.А., Еременко А.А., Никифоров Ю.В. Трансфузилогия в реаниматологии. М.: ООО "Медицинское информационное агентство". 2005. 784с.

[11] Учаева И.М., Дмитриенко Т.Г. Справочник физико-химических величин: Учебное пособие. Саратов: ООО «Принт-Клуб». 2009. 163с.

Аннотация

Методом микроэлектрофореза изучено влияния одно-, двух- и трёхзарядных анионов и катионов (K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+, CO32-, HPO42-/H2PO4-, Cl-, SO42-, C3H5O(COO)33-) на электрокинетические свойства водных дисперсий гемоглобина. Установлено, что значения электрокинетического потенциала гемоглобина зависят от заряда, размера ионов и ионной силы раствора в соответствии с классической теорией двойного электрического слоя. Показано, что карбонат-ионы и катионы железа (II и III) сорбируются на гемоглобине специфически, остальные ионы - неспецифически, так как не смещают значение изоэлектрической точки гемоглобина по сравнению с потенциал определяющими ионами Н+ и ОН-.

Размещено на Allbest.ru