Особенности биосинтеза оксилипинов в плаунке семейства Selaginellaceae

Полная исследовательская публикация _______ Огородникова А.В., Мухитова Ф.К. и Гречкин А.Н.

Размещено на http://www.allbest.ru/

110 _____ http://butlerov.com/ ______ ©--Butlerov Communications. 2015. Vol.41. No.3. P.109-114. (English Preprint)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Особенности биосинтеза оксилипинов в плаунке семейства Selaginellaceae

Оксилипины составляют большой класс биологически активных соединений - продуктов окислительного метаболизма жирных кислот [1]. Как водоросли [2, 3], так и наземные растения [4, 5] имеют большой набор липоксигеназ, которые катализируют диоксигенирование полиненасышенной жирной кислоты в гидроперекиси, которые, в свою очередь, претерпевают различные вторичные превращения. Эти превращения контролируются неклассическими ферментами P450 семейства CYP74, которые описаны для цветковых растений [6, 7]. Ферменты клана CYP74 недавно обнаружены в некоторых протеобактериях и метазоа [8, 9]. В настоящее время известно четыре типа ферментов CYP74 [6, 7, 10]: алленоксидсинтаза (AOС), гидропероксидлиаза (ГПЛ), дивинилэфирсинтаза (ДЭС) и эпоксиалкогольсинтаза (ЭАС). Многие оксилипины, которые синтезируются в ходе липоксигеназного метаболизма, имеют большое значение для клеточного сигналлинга и защиты растений [4, 6].

Липоксигеназный путь и оксилипины нецветковых наземных растений гораздо менее изучены, чем у цветковых. Недавние работы по Physcomitrella patens [11-15] скорее исключение. Чтобы восполнить существующий пробел, мы предприняли настоящую работу по изучению липоксигеназного метаболизма в плаунке Selaginella martensii. Мы обнаружили, что в надземных частях S. martensii реализуется 13-липоксигеназное направление и проявляется ДЭС и АОС активности. При катализе этими ферментами образуется значительное коли-чество оксилипинов, они были идентифицированы и описаны в данной работе. В данной статье впервые описан липоксигеназный путь в плаунке, входящем в отдел Lycopodiophyta, который включает древнейшие существующие сосудистые растения.

Растения S. martensii, выращенные в комнатных условиях, были заказаны в Нидерландах и приобретены в магазине города Казани. Линолевая и б-линоленовая кислоты были приобретены у компании Sigma (США). Катализатор Адамса и силилирующие реагенты были приобретены у Fluka (Швейцария).

Листья и стебли селагинеллы (навески массой 15 г.) измельчали в охлаждённой ступке в холодной смеси растворителей (+4°С) гексанэтилацетат (1:1). Далее экстракт растворяли в смеси хлороформ - изопропанол (2:1) и пропускали через патрон с аминным картриджем Supelclean LC-NH₂ (Supelco, Bellefonte, PA, USA)_. Затем вещества с картриджа элюировали смесью этилацетат - уксусная кислота (98:2) и подвергали этерификации диазометаном, с последующим силилированием. Полученные Ме/ТМС производные анализировали методом газовой хроматомасс-спектрометрии электрон-ного удара (GCMS-QP5050A, колонка OPTIMA-5 MS (30 мЧ0.25 мм) в режиме программирования температуры 120 ^оС - 240 ^оС.

Был изучен профиль оксилипинов в плаунке Selaginella martensii Spring. Надземные зеленые ткани S. martensii были проэкстрагированы, прометилированы и просиланизированы. Эти МеТМС производные были проанализированы методом газовой хроматомасс-спектрометрии. Анализ показал, что в образце плаунка содержится целый ряд оксилипинов. Структурные формулы двух основных групп оксилипинов - дивиниловых эфиров и циклопентенонов приведены на рис. 1а, б. Хроматограммы по полному ионному току представлены на рис. 2.

а) б)

Рис. 1. Структурные формулы дивиниловых эфиров (а) и циклопентенонов (б), обнаруженных в плаунке Selaginella martensii

Время удерживания, мин

Рис. 2. Хроматограммы оксилипинов (Ме/ТМС) плаунка Selaginella martensii по полному ионному току

В масс-спектрах основных оксилипинов 1-3 и 4-9 имеется молекулярный ион М⁺ при значении m/z 308 и 306 соответственно (рис. 3). Соединения 1-3 имеют сходные масс-спектры, см., например, спектр соединения 2 (рис. 3а). Их спектры полностью соответствуют спектрам этеролевой кислоты (Ме эфиры) и ее геометрическим изомерам [16-18]. Оксилипины 5-7 (M⁺ при m/z 306) также имеют идентичные масс-спектры. Спектр соединения 7 приведен на рис. 3б. Спектры соединений 5-7 соответствуют спектрам этероленовой кислоты (Me эфир) и ее геометрическим изомерам [16-18].

Рис. 3. Масс-спектр электронного удара и схемы фрагментации дивиниловых эфиров 2 (а) и 7 (б) плаунка Selaginella martensii

В масс спектрах соединений 4, 8 и 9 также присутствует молекулярный ион M⁺ с m/z 306. Соединения 4 и 8 имеют идентичные спектры. Масс спектр соединения 8 представлен на рисунке 3а. Спектр соответствует cis-12-oксo - 10,15 (Z) - фитодиеновой кислоте (12-oксo-ФДК) Me эфир [19]. Масс спектры и времена удерживания соединений 4 и 8 соответствуют таковым для trans-12-оксо-ФДК и cis-12-oксo-ФДК (Me эфиры), соответственно. Масс спектр соединения 9 имеет другую фрагментацию (рис. 4б), соответствующую 12-oксo-9 (13), 15 (Z) - фито-диеновой кислоте (Me эфир) [20]. В условиях каталитического гидрирования соединение 9 превращается в эквимолекулярную смесь trans и cis изомеров 12-оксофитоновой кислоты (Me). В этом масс спектре имеем M⁺ с m/z 310 (0.1%), [M⁺ - MeO] с m/z 279 (1%), [M⁺ - Me(CH₂)₄ + H] с m/z 240 (4%), [M⁺ - (CH₂)₇COOMe] с m/z 153 (14%), 83 (100%). Аналогично, при гидрировании соединений 4 и 8 образуются trans и cis изомеры12-оксофитоновой кислоты (Me). Полученные результаты позволяют нам приписать структуры Me эфиров trans-12-oксo-ФДК, cis-12-оксо-ФДК и 12-оксо-9 (13) - ФДК соединениям to 4, 8 и 9, соответственно.

Пик одного из минорных соединений 10 элюируется вскоре после метилстеарата (не представлено) и, несмотря на его относительно малое содержание, представляет определенный интерес. Его масс-спектр представлен на рис. 4в. Схема фрагментации показана там же. Молекулярный ион с m/z 278 и характеристические фрагменты дают возможность идентифицировать соединение 10 как cis - 2,3 - динор-12-oксo-ФДК, более короткий гомолог соединения 8 [21]. Каталитическое гидрирование соединения 10 приводит к образованию практически эквимолярной смеси trans и cis изомеров 2,3 - динор-12-оксофитоновой кислоты (Me). В их масс спектрах имеются следующие фрагментарные ионы: [M⁺ - MeO] - m/z 279 (1%), [M⁺ - Me(CH₂)₄ + H] - m/z 212 (7%), [M⁺ - (CH₂)₇COOMe] - m/z 153 (15%), 83 (100%).

Наряду с выше описанными продуктами дивинилэфирсинтазы и алленоксидсинтазы, детектируются и некоторые другие оксилипины, такие как 9-оксононановая кислота, азелаи-новая и (3Z) - травматиновая кислоты. Их характеристики идентичны (не представлено) таковым, описанным в нашей недавней публикации [22]. Появление таких короткоцепочечных со-единений связано, по-видимому, с гидропероксидлиазной активностью в образце S. martensii.

Рис. 3. Масс-спектр электронного удара и схемы фрагментации циклопентенонов 8 (а), 9 (б) и 10 (в) плаунка Selaginella martensii.

Полученные нами результаты показывают, что S. martensii обладает высокой 13-липоксигеназной активностью, также высокоактивны ферменты, метаболизирующие гидроперекиси жирных кислот - ДЭС и АОС. В образцах ткани S. martensii содержится большое количество оксилипинов, в том числе, геометрические изомеры этеролевой (1-3) и этероленовой (5-7) кислот, а также три изомера 12-oксофитодиеновой кислоты (4, 8, 9) и ее низко-молекулярный гомолог - cis - 2,3 - динор-12-oксo-ФДК (10).

AOСинтазные продукты обнаруживались во мхах и раньше. Например, 12-оксо-ФДК (8) была найдена во мхе Leucobryum scabrum [23]. Изомерная 12-oксo-9 (13) - ФДК (9) была выделена из образцов мха Dicranoloma scabrum и Dicranum majus [23,24]. Более того, 6,6,7,7 - тетрадегидро-12-oксo-ФДК был обнаружен во мхах Dicranum scoparium и Dicranum japonicum [24]. Еще одно родственное соединение 5,6,6,7 - тетрадегидро-12-оксо-9 (13) - ФДК было обнаружено в D. japonicum и Dicranoloma scabrum [24]. Следует отметить, что 12-оксо-9 (13) - ФДК (9) детектировалось, как минорный продукт алленоксидсинтазы в некоторых высших растениях, например, в подвергнутых стрессу листьях ячменя [25] и бобах (Phaseolus lunatus L.) [15].

Алленоксидсинтазы [13, 26], так же как и алленоксидциклазыa Physcomitrella patens, не-давно были клонированы [27]. Циклазный продукт, (9S, 13S) - 12-оксо-ФДК является предшественником жасмоната у цветковых растений [3, 4]. Существование этого метаболического пути и присутствие жасмоната во мхах дискуссионно. Так, согласно [13,28], метилжасмонат был обнаружен в P. patens. Напротив, в работе [14,29] метилжасмонаты не были детектированы в этом объекте. Не обнаружили их и мы в плаунке S. martensii в настоящей работе.

Дивиниловые эфиры играют важную защитную роль в жизни растений. ДЭС были обнаружены у многих цветковых растений DESs [6, 10]. С другой стороны, не все секвенированные геномы растений содержат гены ДЭС. Обнаружение дивиниловых эфиров в S. martensii расширяют наши знания о распространении ДЭС. Ранее дивиниловые эфиры были найдены в образцах красных [30] и коричневых водорослей [31]. Таким образом, плаунки являются промежуточным звеном между водорослями и цветковыми растениями.

Геном of S. martensii до сих пор не секвенирован. Секвенированный геном родственного плаунка Selaginella moellendorffii включает некоторые гены ферментов клана CYP74 (под-семейства J, K, L и M) и липоксигеназы. Еще предстоит клонировать эти гены и изучить кодируемые ими рекомбинантые белки.

Плаунки принадлежат к наиболее примитивным наземным растениям. Однако, результаты настоящей работы, так же как и литературные данные по Physcomitrella, показывают, что нецветковые наземные растения, несмотря на их «примитивность» обладают своеобразным липоксигеназным каскадом. Наши данные показывают, что ферментативный аппарат липоксигеназного каскада в растениях не претерпел существенных изменений в ходе эволюции.

Литература

липоксигеназный метаболизм плаунок оксилипин

[1] W.H. Gerwick, M. Moghaddam, M. Hamberg. Oxylipin metabolism in the red alga Gracilariopsis lemaneiformis: mechanism of formation of vicinal dihydroxy fatty acids. Arch. Biochem. Biophys. 1991. No.290. P.436-444.

[2] W.H. Gerwick. Structure and biosynthesis of marine algal oxylipins. Biochim. Biophys. Acta. 1994. No.1211. P.243-255.

[3] A. Andreou, F. Brodhun, I. Feussner. Biosynthesis of oxylipins in non-mammals. Prog. Lipid Res. 2009. No.48. P.148-170.

[4] A.N. Grechkin. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway. Prog. Lipid Res. 1998. No.37. P.317-352.

[5] E.H. Oliw. Plant and fungal lipoxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002. No.68-69. P.313-323.

[6] R.K. Hughes, S. De Domenico, A. Santino. Plant cytochrome CYP74 family: biochemical features, endocellular localisation, activation mechanism in plant defence and improvements for industrial applications. ChemBioChem. 2009. No.10. P.1122-1133.

[7] A.R. Brash. Mechanistic aspects of CYP74 allene oxide synthases and related cytochrome P450 enzymes. Phytochemistry. 2009. No.70. P.1522-1531.

[8] D.-S. Lee, P. Nioche, M. Hamberg, C.S. Raman. Structural insights into the evolutionary paths of oxylipin biosynthesis enzymes. Nature. 2008. No.455. P.363-370.

[9] D.R. Nelson, J.V. Goldstone, J.J. Stegeman. The cytochrome P450 genesis locus: the origin and evolution of animal cytochrome P450s. Phil. Trans. R. Soc. B. 2013. No.368. P.20120474.

[10] A.N. Grechkin. Hydroperoxide lyase and divinyl ether synthase, Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002. No.68-69. P.457-470.

[11] T. Senger, T. Wichard, S. Kunze, C. Gцbel, J. Lerchl, G. Pohnert, I. Feussner. A multifunctional lipoxygenase with fatty acid hydroperoxide cleaving activity from the moss Physcomitrella patens. J. Biol. Chem. 2005. No.280. P.7588-7596

[12] M. Stumpe, J. Bode, C. Gцbel, T. Wichard, A. Schaaf, W. Frank, M. Frank, R. Reski, G. Pohnert, I. Feussner. Biosynthesis of C9-aldehydes in the moss Physcomitrella patens. Biochim. Biophys. Acta. 2006. No.1761. P.301-312.

[13] P.K.G.S.S. Bandara, K. Takahashi, M. Sato, H. Matsuura, K. Nabeta. Cloning and functional analysis of an allene oxide synthase in Physcomitrella patens. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009. No.73. P.2356-2359.

[14] M. Stumpe, C. Gцbel, B. Faltin, A.K. Beike, B. Hause, K. Himmelsbach, J. Bode, R. Kramell, C. Wasternack, W. Frank, R. Reski, I. Feussner. The moss Physcomitrella patens contains cyclopentenones but no jasmonates: mutations in allene oxide cyclase lead to reduced fertility and altered sporophyte morphology. New Phytol. 2010. No.188. P.740-749

[15] B. Schulze, R. Lauchli, M.M. Sonwa, A. Schmidt, W. Boland. Profiling of structurally labile oxylipins in plants by in situ derivatization with pentafluorobenzyl hydroxylamine. Anal Biochem. 2006. No.348. P.269-283.

[16] A.N. Grechkin, F.N. Fazliev, L.S. Mukhtarova. The lipoxygenase pathway in garlic (Allium sativum L.) bulbs: detection of the novel divinyl ether oxylipins. FEBS Lett. 1995. No.371. P.159-162.

[17] A.N. Grechkin, A.V. Ilyasov, M. Hamberg. On the mechanism of biosynthesis of divinyl ether oxylipins by enzyme from garlic bulbs. Eur. J. Biochem. 1997. No.245. P.137-142.

[18] M. Hamberg. A pathway for biosynthesis of divinyl ether fatty acids in green leaves. Lipids. 1998. No.33. P.1061-1071.

[19] I.R. Chechetkin, A. Blufard, M. Hamberg, A.N. Grechkin. A lipoxygenase-divinyl ether synthase pathway in flax (Linum usitatissimum L.) leaves. Phytochemistry. 2008. No.69. P.2008-2015.

[20] B.A. Vick, D.C. Zimmerman, D. Weisleder. Thermal alteration of a cyclic fatty acid produced by a flaxseed extract. 1979. No.14. P.734-740.

[21] H. Weber, B.A. Vick, E.E. Farmer. Dinor-oxo-phytodienoic acid: a new hexadecanoid signal in the jasmonate family. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997. No.94. P.10473-10478.

[22] L.S. Mukhtarova, F.K. Mukhitova, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin. Hydroperoxide lyase cascade in pea seedlings: Non-volatile oxylipins and their age and stress dependent alterations. Phytochemistry. 2011. No.72. P. 356-364.

[23] T. Ichikawa, K. Yamada, M. Namikawa, K. Sakai, K. Kondo. New cyclopentenonyl fatty acids from Japanese mosses. J. Hattori Bot. Lab. 1984. No.56. P.209-213.

[24] T. Ichikawa, M. Namikawa, K. Yamada, K. Sakai, K. Kondo. Novel cyclopentenonyl fatty acids from mosses, Dicranum scoparium and Dicranum japonicum. Tetrahedron Lett. 1983. No.24. P.3337-3340.

[25] R. Kramell, O. Miersch, R. Atzorn. Parthier, B., Wasternack, C., Octadecanoid-derived alteration of gene expression and the «oxylipin signature» in stressed barley leaves. Implications for different signaling pathways. Plant Physiol. 2000. No.123. P.177-188.

[26] J. Scholz, F. Brodhun, E. Hornung, C. Herrfurth, M. Stumpe, A.K. Beike, B. Faltin, W. Frank, R. Reski, I. Feussner. Biosynthesis of allene oxides in Physcomitrella patens. BMC Plant Biol. 2012. P.12:228.

[27] T. Hashimoto, K. Takahashi, M. Sato, P.K.G.S.S. Bandara, K. Nabeta. Cloning and characterization of an allene oxide cyclase, PpAOC3, in Physcomitrella patens. Plant Growth Regul. 2011. No.65. P.239-245.

[28] J.P. Oliver, A. Castro, C. Gaggero, T. Cascуn, E.A. Schmelz, C. Castresana, I. Ponce de Leуn. Pythium infection activates conserved plant defense responses in mosses. Planta. 2009. No.230. P.569-579.

[29] I. Ponce De Leуn, E.A. Schmelz, C. Gaggero, A. Castro, A. Бlvarez, M. Montesano. Physcomitrella patens activates reinforcement of the cell wall, programmed cell death and accumulation of evolutionary conserved defence signals, such as salicylic acid and 12-oxo-phytodienoic acid, but not jasmonic acid, upon Botrytis cinerea infection. Mol. Plant Pathol. 2012. No.13. P.960-974.

[30] Z.D. Jiang, W.H. Gerwick. Novel oxylipins from the temperate red alga Polyneura latissima: evidence for an arachidonate 9 (S) - lipoxygenase. Lipids. 1997. No.32. P.231-235.

[31] P.J. Proteau, W.H. Gerwick. Divinyl ethers and hydroxy fatty acids from three species of Laminaria (brown algae). Lipids. 1993. No.28. P.783-787.

Размещено на Allbest.ru