Определение констант диссоциации карбоксильных и аминогрупп на альбумине методом потенциометрического титрования

Полная исследовательская публикация ___________ Дмитриева И.Б., Кергенцев А.А. и Чухно А.С.

Размещено на http://www.allbest.ru/

142 _____ http://butlerov.com/ ______ ©--Butlerov Communications. 2015. Vol.41. No.3. P.141-146. (English Preprint)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Определение констант диссоциации карбоксильных и аминогрупп на альбумине методом потенциометрического титрования

Ранее в работах [1-21] приведены результаты, изучения влияния различных факторов на адсорбцию ионов водорода и гидроксид-ионов для различных белков и полисахаридов. В настоящей работе продолжено изучение белковых систем на примере водных дисперсий яичного альбумина. Проведено определение количества функциональных групп альбумина, участвующих в обмене протонами и гидроксид-ионами, рассчитаны средние константы диссоциации этих групп. В дальнейшем данные исследования позволят изучить устойчивость подобных систем, как в водных [22-27], так и неводных средах [28-29], изучить влияние на белки и полисахариды новых веществ [30-31] и создать новые формы с уже используемыми [32-35].

Яичный альбумин, выделенный и очищенный компанией Fluka Analytical, Швеция, предназначен для микробиологии,

Неорганические реактивы соответствовали марке х.ч. и использовались без дополнительной очистки.

Определения сорбции ионов Н⁺ и ОН ^- на альбумине проводились методом непрерывного потен-циометрического титрования [2, 6] в атмосфере азота, для исключения влияния углекислого газа. В ячейку для потенциометрического титрования вводился исследуемый раствор - 20 мл, 30 минут пропускался воздух, освобожденный от СО₂ и проба титровалась раствором КOH (0.016 моль/л) или НС1 (0.010 моль/л). Для дозирования титранта использовалась микробюретку. Растворы КOH готовились на дистиллированной воде, предварительно освобожденной от СО₂ воздуха кипячением в течение 30 минут. Титрант добавлялся порциями по 0.1 мл с интервалом в 1 минуту, после каждой добавленной порции титранта регистрировалось изменение значений рН раствора. В работе использовался рН-метр 150М с точностью измерения ±0.05 единиц рН. Вначале титровался исходный раствор без сорбента, затем с сорбентом. В качестве сорбента использовали яичный альбумин. Масса навески альбумина при титровании составляла 0.1 г.

На рис. 1. приведен пример кривых титрования раствора КС1 и водной дисперсии альбумина в растворе КС1.

Далее строили зависимости рН от объема добавленной НCl (КOH). Кривые титрования с сорбентом и без него, сравнивали и рассчитывали количества сорбированных ионов Н⁺ или ОН^- , как функцию рН:

сорбция ион гидроксид альбумин

(1)

где V₁ - объём раствора HCl (КOH), пошедший на титрование пробы в присутствие сорбента, мл; V₀ - то же без сорбента, мл; m - масса навески сорбента, г; c - концентрация HCl (КOH), моль/мл.

Рис. 1. Кривые потенциометрического титрования раствора КС1 0.01 моль/л и водной дисперсии яичного альбумина в растворе КС1 0.01 моль/л

Рис. 2. Кривая кондуктометрического титрования водной дисперсии альбумина раствором НС1 0.1 моль/л

Количество функциональных групп альбумина, участвующих в обмене протонами и гидроксид-ионами определялось методом кондуктометрического титрования. Навеска альбумина массой 1.00 г. растворялась в 100 мл дистиллированной воды. По истечению суток раствор оттитровывался. В ячейку для кондуктометрического титрования помещалось 100 мл исследуемой дисперсии альбумина и для определения количества карбоксильных групп дисперсия титровалась раствором KOH (с = 0.019 моль•л^-1), для определения количества аминогрупп - раствором НСl (с = 0.010 моль•л^-1). Титрование проводили в атмосфере азота, для исключения влияния углекислого газа. Титрант вводился порциями по 0.1 мл ч с интервалом в 1 минуту. После каждой добавленной порции титранта измерялось значение электропроводности (ж) раствора. Регистрация удельной электропроводности осуществлялась на кондуктометре типа АНИОН-410 с точностью измерения 0.1 мкСм•см^-1. Далее строилась графическая зависимость удельной электропроводности титруемого раствора от объема добавленного титранта. Пример кривой кондуктометрического титрования представлен на рис. 2. Конечная точка титрования определялась по изломам на кривых ж - V_{титранта}, и рассчитывались количества карбоксильных (амино-) групп по следующей формуле:

 (2)

где - количество карбоксильных (аминогрупп), моль•г^-1; - объем титранта КОН (НСl), мл; - концентрация титранта, моль•мл^-1; - масса навески альбумина, г.

Рассмотрим влияние времени старения растворов альбумина на сорбцию ионов водорода и гидроксид-ионов. Предварительно раствор альбумина для водных дисперсий выдерживался в течении 1, 2, 3,… 7 суток, затем проводилось определение сорбции ионов водорода и гидроксид-ионов на альбумине - рис. 3. Из сравнения кривых сорбции для разного времени выдерживания растворов альбумина видно, что кривые практически совпадают для 1-3 суток, наблюдается заметное отклонение только для данных полученных через неделю. Поэтому все дальнейшие исследования проводились через сутки после приготовления растворов. Изменение сорбции во времени связаны с процессами старения белка - окислением, кристаллизацией и других.

Рис. 3. Зависитмость () для водных дисперсий яичного альбумина в растворе КСl (0.01 моль/л)

Рис. 4. Зависитмость () для водных дисперсий яичного альбумина в растворе КСl различных концентраций

На рис. 4 приведена зависимость сорбции протонов и гидроксил-ионов от рН при различных концентрациях хлорида калия. Значение рН, при котором наблюдается равенство количеств сорбированных протонов и гидроксид-ионов соответствует рН_тнз, В области рН < рН_тнз - преобладание сорбции протонов, при рН>рН_тн - гидроксид-ионов. Определенное рН_тнз = 4.8. При увеличении концентрации протонов в водных растворах увеличивается протонизация аминогрупп, и уменьшается диссоциация карбоксильных групп. К обратному эффекту приводит увеличение концентрации гидроксид-ионов. Из рис. 4 видно, что в растворах КС1 не наблюдается смещения точки нулевого заряда, что свидетельствует об отсутствии специфической сорбции катионов калия и хлора на альбумине. При увеличении концентрации хлорида калия (рост ионной силы раствора) происходит увеличение обмена катионов и анионов на Н⁺, ОН^-, что отражается на увеличении сорбции Н⁺, ОН^-.

Количество кислотных и основных функциональных групп альбумина, участвующих в обмене протонами и гидроксид-ионами, определялось путем кондуктометрического титрования. По точкам перегиба на кондуктограммах (рис. 2) находился эквивалентный объем добавленного титранта и рассчитывались количество моль основных и кислотных групп, приходящихся на 1 г альбумина по формуле (2). Количество основных групп [- (NH₂)] равно 1,1•10^-3 моль/г, кислотных [- (COOH)] - 1.2•10^-3 моль/г и численно равны предельно возможным величинам сорбции ионов водорода основными группами и гидроксид-ионов кислотными группами .

Далее проводился расчет констант диссоциации кислотных и основных групп альбумина по адсорбционным данным [36-38]. Из определенных методом потенциометрического титрования величин сорбции ионов водорода и гидроксид-ионов на альбумине и определенных методом кондуктометрического титрования предельных значений сорбции для каждого значения рН и концентрации фонового электролита рассчитывались степени диссоциации б₊ и б_-

(3)

где S - символ поверхности.

- для основных групп (4)

- для кислотных групп (5)

Далее для каждой точки вычисляли константы диссоциации функциональных групп альбумина по уравнениям:

 (6)

Ш для основных групп концентрационные константы диссоциации

(7)

Ш для кислотных групп.

Строили зависимости pQ₁, pQ₂ от +с^1/2, где с - концентрация хлорида калия. Методом двойной экстраполяции определяли ,: для каждой полученной зависимости (для каждой концентрации хлорида калия) проводили экстраполяцию на =0 (при рН_тнз); через полученные точки проводили прямую до пересечения с осью ординат (экстраполяция к нулевой концентрации соли с>0) [36-38]. Полученные значения -= 3.3,= 6.35.

Зная значения констант диссоциации карбоксильной и аминогрупп, рассчитываем значение рН_тнз

рН_тнз = (pK_a1+ pK_a2)/2 = (3.3 + 6.35)/2 = 4.83. (8)

Значения рН_тнз, рассчитанные и определенные экспериментально очень близки (рис. 4).

Таким образом, результаты работы свидетельствуют о том, что заряжение альбумина в водных растворах происходит за счет сорбции протонов и гидроксид-ионов, происходящей одновременно. В кислой области при рН<рН_тнз преобладает сорбция протонов, а в щелочной при рН>рН_тнз преобладает сорбция гидроксид-иона. При увеличении концентрации хлорида калия (рост ионной силы раствора) происходит увеличение обмена катионов и анионов на Н⁺, ОН^-, что отражается на увеличении сорбции Н⁺, ОН^-.

Выводы

1. Исследована сорбция ионов водорода и гидроксид-ионов из водных растворов на яичном альбумине в зависимости от концентрации хлорида калия и рН. Изучено влияние времени существования водных дисперсий альбумина на процессы сорбции. Рассчитаны константы диссоциации карбоксильных и аминогрупп для водных дисперсий альбумина.

2. Установлено, что влияние процессов старения белка (окисления, кристаллизации и другие) заметно сказывается при времени существовании дисперсий более 3 суток.

3. Точка нулевого заряда яичного альбумина в воде и водных растворах хлорида калия рН_тнз= 4.8.

4. Рассчитаны средние константы диссоциации основных и карбоксильных групп для яичного альбумина. Полученные значения -= 3.3,= 6.35.

5. Рассчитанное значение рН_тнз, альбумина равно 4.83 и определенное экспериментально - 4.8, практически совпадают.

Литература

[1] Чухно А.С., Дмитриева И.Б., Мартынов Д.В. Изоэлектрическая точка белков в водных растворах азолов. Вестник СПбГУ. 2011. Серия 4: Физика. Химия. Вып.2. С. 124-133.

[2] Чухно А.С., Дмитриева И.Б., Колодеева С.С., Мартынов Д.В. Адсорбция ионов Н⁺ и ОН ^- на коллагене. Вестник СПбГУ. 2011. Серия 4: Физика. Химия. Вып.3. С. 87-95.

[3] Чухно А.С., Дмитриева И.Б., Банкина А.Н., Бриллиантова Е.Ю. Изучение взаимодействия белков с биологически активными азотсодержащими гетероциклическими соединениями при различных значениях pH. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.34. №5. С. 91-99.

[4] Чухно А.С., Банкина А.Н., Бриллиантова Е.Ю. Кинетика процесса набухания желатины в водных растворах азолов. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.38. №5. С. 84-88.

[5] A. Yu. Men'shikova, Yu.O. Skurkis, V.I. Kuchuk, I.B. Dmitrieva, T.G. Evseeva, B.M. Shabsel's. Effect of the surface structure of poly (styrene-co-acrolein) microspheres and its modification by protein on electrosurface properties. Коллоидный журнал. 2001. Т.63. №5. С. 629-636.

[6] Чухно А.С., Дмитриева И.Б., Мартынов Д.В. Влияние солей одно-, двух- и трехзарядных катионов металлов на сорбцию Н+ и ОН- ионов на декстране. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.27. №14. С. 47-54.

[7] Кергенцев А.А., Чухно А.С., Дмитриева И.Б. Изучение адсорбции веществ неорганической и органической природы на декстране и пектине. Сборник тезисов 16-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука ХХI века» 16-21 апреля 2012 г., Пущино. 2012. С. 57.

[8] Кергенцев А.А., Дмитриева И.Б., Чухно А.С. Определение точки нулевого заряда молекул альбумина в водных дисперсиях при различных концентрациях хлорида калия. Молодой ученый. 2014. №18. С. 123-126.

[9] Кергенцев А.А., Дмитриева И.Б., Чухно А.С. Измерение количества активных центров белковых молекул в водных растворах. Материалы научной конференции, посвященной 186-й годовщине образования Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). Санкт-Петербург. 2-3 декабря 2014 года, СПб: Изд-во СПГТИ(ТУ). 2014. С. 9.

[10] Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно А.С. Электрокинетические свойства гемоглобина в водных растворах НСl и KCl. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.30. №6. С. 103-107.

[11] Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно А.С. Электрокинетические свойства гемоглобина в водных растворах 1-, 2- и 3-зарядных ионов. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.34. №6. С. 135-140.

[12] Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно А.С. Электрокинетические свойства хлорофилла в водных растворах 1-, 2- и 3-зарядных катионов. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.34. №6. С. 130-134.

[13] Чухно А.С., Дмитриева И.Б., Силаева Д.С., Сенина А.С., Кошевенко А.С., Назипова А.Р. Сорбция ионов Н+ и ОН ^- на хлорофилле, влияние рН на устойчивость водных дисперсий хлорофилла. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.34. №5. С. 124-130.

[14] Родионова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Чухно А.С. Влияние состава дисперсионной среды на устойчивость и электрокинетические свойства билирубина. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.37. №1. С. 55-61.

[15] Банкина А.Н., Чухно А.С., Гурина С.В., Дмитриева И.Б., Ананьева Е.П., Бриллиантова Е.Ю., Кергенцев А.А. Исследование специфической адсорбции аминокислот и азолов на мицелии базидиомицета Abortiporus biennis. Сборник научных трудов второй научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые и фармация XXI века». 11-12 декабря 2014. М., ВИЛАР. 2014. С. 333-337.

[16] Чухно А.С., Гурина С.В., Банкина А.Н., Ананьева Е.П., Дмитриева И.Б. Изучение электроповерхностных свойств мицелия базидиомицета Abortiporus biennis в зависимости от рН. Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2014. №5 (10). С. 32-38.

[17] Чухно А.С., Гурина С.В., Ананьева Е.П., Банкина А.Н., Бриллиантова Е.Ю., Дмитриева И.Б. Исследование коллоидных свойств мицелия базидиомицетов с целью использования его как носителя БАВ. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.39. №10. С. 76-82.

[18] Чухно А.С., Ананьева Е.П., Гурина С.В., Банкина А.Н., Бриллиантова Е.Ю., Дмитриева И.Б. Влияние солей одно- и двух - зарядных катионов металлов на сорбцию Н⁺ и ОН^- ионов на мицелии базидиомицетов. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.39. №10. С. 68-75.

[19] Банкина А.Н., Чухно А.С., Гурина С.В., Дмитриева И.Б., Ананьева Е.П., Бриллиантова Е.Ю., Кергенцев А.А. Изучение сорбции аминокислот и азолов на мицелии базидиомицета Abortiporus biennis. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2014. Т.12. №12. С. 31-32.

[20] Чухно А.С., Ананьева Е.П., Бриллиантова Е.Ю., Дмитриева И.Б., Гурина С.В. Исследование электроповерхностных свойств мицелия базидиомицета Poliporus ciliatus в зависимости от рН. Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2015. №1 (12). С. 30-35.

[21] Шкляева А.С., Васильева О.В., Кучук В.И. Исследование физико-химических свойств водной дисперсии энтеросорбентаполисорба мп. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.35. №8. С. 94-99.

[22] Назипова А.Р., Дмитриева И.Б., Чухно А.С. Изучение устойчивости водных дисперсий декстрана в растворах одно-, двух- и трёхзарядных электролитов. Молодой ученый. 2014. №21. С. 6-10.

[23] K.I. Evstratova, L.A. Bakholdina, V.I. Kuchuk, T. Yu. Ivanovskaya. Adsorption activity of polyphepan with respect to some heavy metal cations. Pharmaceutical Chemistry Journal. 1999. Т.33. №8. С. 437-440.

[24] Загорская Л.Л., Голикова Е.В., Гарибин Е.А., Молодкина Л.М., Кучук В.И. Ближняя и дальняя АГ регация частиц в золе G-AL₂O₃. I. Исследование агрегативной устойчивости отрицательно за ряженного золя G-AL₂O₃. Физика и химия стекла. 2010. Т.36. №4. С. 542.

[25] Широкова И.Ю., Кучук В.И., Беляев А.П., Шевченко Н.Н., Голикова Е.В. Агрегативная устойчивость дисперсных систем. Часть 1. Исследование электроповерхностных свойств и кинетики коагуляции монодисперсных полимерных частиц с карбоксилированной поверхностью. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.37. №2. С. 29-38.

[26] Широкова И.Ю., Терещенко М.С., Шпилина И.Д., Кучук В.И., Беляев А.П., Шевченко Н.Н., Голикова Е.В. Агрегативная устойчивость дисперсных систем. Часть 2. Исследование электроповерхностных свойств и агрегативной устойчивости монодисперсных полимерных частиц с аминированной поверхностью. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.39. №9. С. 98-106.

[27] Голикова Е.В., Кучук В.И., Григорьев В.С., Шарыпин В.В. Устойчивость и коагуляция золя природного алмаза в растворах LID. Физика и химия стекла. 2011. Т.37. №4. С. 518-538.

[28] Жуков А.Н., Варжель В.И., Грибанова Е.В., Дмитриева И.Б., Лапшина Г.Л., Откупщикова В.Г., Трубинская «лектроповерхностные свойства твердых тел в неводных и смешанных средах

[29] т.а. отчет о НИР №96-03-34313 (Российский фонд фундаментальных исследований).

[30] Кучук В.И., Широкова И.Ю., Голикова Е.В. Физико-химические свойства водно-спиртовых смесей гомологического ряда низших алифатических спиртов. Физика и химия стекла. 2012. Т.38. №5. С. 625-633.

[31] Евдокимов А.А., Сенина А.С., Москвин А.В., Фридман И.А., Яковлев И.П., Гурина С.В. Синтез, строение и биологическая активность некоторых амидразонов. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.39. №8. С. 87-90.

[32] Куваева Е.В., Федорова Е.В., Яковлев И.П., Ксенофонтова Г.В., Карасавиди А.О. Синтез и биологическая активность N-арилбензамидинов. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.39. №8. С. 76 - 81.

[33] Беляев А.П., Рубец В.П., Антипов В.В., Рыбников А.О., Беляева С.А. Кристаллизация парацетамола ромбической формы. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.37. №3. С. 113-119.

[34] Беляев А.П., Рубец В.П., Антипов В.В., Бордей Н.С. Фазовые превращения при формировании кристаллов парацетамола из паровой фазы. Журнал технической физики. 2014. Т.84. №7. С. 156-158.

[35] Беляев А.П., Рубец В.П., Антипов В.В., Бордей Н.С. О механизме начальной стадии образования наноструктур в условиях сверхнизких температур. Наносистемы: физика, химия, математика. 2012. Т.3. №5. С. 103-110.

[36] Бордей Н.С., Беляев А.П., Антипов В.В., Рубец В.П. Фазовые превращения парацетамола при термическом испарении и конденсации в вакууме. Молодой ученый. 2015. №1 (81). С. 119-124.

[37] J.A. Davis, R.O. James, J.O. Leckie. Surface ionization complexation at the oxide - water interface. Journal of Colloid and Interface Science. 1978. Т.63. №3. P.480-499.

[38] J.A. Davis, J.O. Leckie. Surface ionization complexation at the oxide - water interface. II Surface properties of amorfous iron oxyhydroxide and adsorption of metal ions. Journal of Colloid and Interface Science. 1978. Т.67. №1. P.90-107.

[39] J.A. Davis, J.O. Leckie. Surface ionization complexation at the oxide - water interface. III Adsorption of anions. Journal of Colloid and Interface Science. 1980. Т.74. №1. P.32-43.

Размещено на Allbest.ru