Полная исследовательская публикация _________________________________________ Моисеев Д.В.

Размещено на http://www.allbest.ru/

138 _____________ http://butlerov.com/ ____________ ©--Butlerov Communications. 2013. Vol.36. No.11. P.134-138.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Определение алкалоидов в траве чистотела большого и листьях маклеи сердцевидной методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Алкалоиды - группа азотсодержащих органических соединений растительного происхождения, преимущественно гетероциклических, чаще всего обладающих слабоосновными свойствами. Современные классификации используют объединение алкалоидов в классы по структуре углеродного скелета (индольные, изохинолиновые, пиридиновые алкалоиды и другие) [1].

Качественный состав алкалоидоносных растений обычно представлен несколькими алкалоидами. При выделении алкалоидов из растительного сырья первоначально производится экстракция смеси алкалоидов, а затем разделение индивидуальных веществ в смеси. Большинство методов выделения и очистки алкалоидов из растительного сырья основаны на использовании свойств оснований алкалоидов, которые, как правило, хорошо растворимы в органических растворителях и плохо растворимы в воде, а соли - наоборот.

При извлечении алкалоидов в виде оснований растительное сырье обрабатывается щелочными растворами для перевода солей алкалоидов в основания, после чего основания алкалоидов извлекаются неполярными или слабополярными органическими растворителями (1,2 - дихлорэтан, хлороформ, диэтиловый эфир, бензол и другиен).

Затем для очистки от примесей полученный раствор оснований алкалоидов обрабатывается слабым раствором кислоты, при этом алкалоиды образуют соли, нерастворимые в органических растворителях и переходящие в воду [1, 2].

При необходимости водный раствор солей алкалоидов снова подщелачивают и обрабатывают органическим растворителем. Процесс продолжается, пока не получен раствор смеси алкалоидов достаточной чистоты. Для дальнейшего разделения на индивидуальные соединения используются хроматографические методы.

При извлечении алкалоидов в виде солей сырье обрабатывается слабым раствором кислоты (например, уксусной) в воде, этаноле или метаноле.

Полученный раствор подщелачивают для перевода солей алкалоидов в основания, которые извлекаются органическим растворителем (если экстракция производилась с помощью спирта, его предварительно необходимо отогнать, а остаток растворить в воде).

Раствор оснований алкалоидов в органическом растворителе подвергается очистке, как указано выше.

Для идентификации алкалоидов можно использовать их физико-химические свойства: определение температуры плавления, определение удельного вращения оптических изомеров, а также сравнение их УФ-, ИК-, ЯМР ¹H спектров со спектрами стандартных образцов.

Однако данные методы требуют высокой степени чистоты исследуемых образцов веществ и поэтому дороги и трудоемки. Оптимальными методами по стоимости и трудоемкости анализов для характеристики качественного и количественного алкалоидного состава расти-тельного сырья являются хроматографические методы (ВЭЖХ, ГЖХ и ТСХ).

С точки зрения получения данных о химической структуре веществ в растениях наиболее информативным вариантом детектирования в ВЭЖХ является последовательное применение фотодиодноматричного и масс-спектрометрического детекторов.

Для облегчения проведения комплекса работ по идентификации биологически активных веществ растительного происхождения создаются хроматографические химико-аналитические библиотеки веществ, представляющие собой хроматограммы и спектры поглощения веществ, записанные в определенных стандартизированных хроматографических условиях.

В справочнике Clarke's Analysis of Drugs and Poisons приводится свыше 20 различных стандартных систем растворителей для метода ТСХ и более 15 для метода ВЭЖХ, используемых для идентификации токсических веществ в биожидкостях. Обычно, для идентификации веществ, относящихся к одной группе (например, антидепрессанты), приводятся коэф-фициенты удерживания в 2-3 различных хроматографических системах, которые подбираются индивидуально исследователями.

Из веществ растительного происхождения в данный справочник включены наркотические вещества (опиаты, каннабиоиды, кокаин), сердечные гликозиды и некоторые индивидуальные алкалоиды [3]. Ранее нами была представлена подобная база данных для веществ растительного происхождения, относящихся к флавоноидам и включающая спектры поглощения и коэффициенты емкости для трех различных хроматографических сорбентов [4].

В настоящей статье охарактеризованы коэффициенты емкости и спектры поглощения для 14 алкалоидов, относящихся к третичным и четвертичным аммониевым основаниям.

Материалы и методы. В научной литературе приводится множество различных методик определения алкалоидов в растениях методом ВЭЖХ. Главные недостатки большинства из них: во-первых, в статьях приводятся времена удерживания веществ, а не коэффициенты емкости; во-вторых, условия хроматографического анализа одних и тех же объектов сильно различаются. При выборе систем растворителей основной посылкой стало то, что время проведения одного предварительного анализа растительного объекта не должно превышать 2 часа и режим элюирования должен быть изократическим (то есть состав подвижной фазы не должен изменяться в течение анализа).

Концентрация растворов стандартных образцов составляла 0.1-0.2%, готовили путем растворения навески в 12% уксусной кислоте, объем раствора 500 мкл. Хроматографическая чистота стандартных образцов составляла более 99%.

Работа выполнялась на жидкостном хроматографе фирмы Agilent HP 1100, в комплекте с системой подачи и дегазации на четыре растворителя G1311A, диодно-матричным детектором G1315B, термостатом колонок G1316A, устройством для автоматического ввода образцов (авто-сэмплер) G1313A. Сбор данных, обработка хроматограмм и спектров поглощения проводилась с помощью программы Agilent ChemStation for LC 3D.

Качественно новые свойства могут приобретать хроматографические системы, в состав которых введен динамический модификатор. Под этим термином понимается соединение, которое постоянно поступает в колонку с подвижной фазой (ПФ) и, находясь в динамическом равновесии с другими компонентами системы, изменяет механизм сорбции и селективность хроматографической системы.

Одним из наиболее важных направлений динамического модифицирования ПФ является ион-парная хроматография.

Особое значение этот метод приобретает при хроматографирования ионогенных соединений на неполярных сорбентах. Для разделения оснований, к которым относятся большинство алкалоидов, используются натриевые соли алкилсульфокислот с числом атомов углерода 4-12 [5, 6].

Хроматографические колонки подбирались по принципу различной полярности (хроматографические колонки Zorbax SB с сорбентами Phenyl, С-18, С-8, размер частиц 5 мкм, длина колонки 250 мм, диаметр 4,6 мм, производитель Agilent Technologies).

Для обеспечения более высокой ассоциации ион-парного реагента (ИПР) с сорбатом создавали значение рН = 2.5 при помощи концентрированной фосфорной кислоты (таблица).

Концентрация ИПР составляла 0.005 М, что достаточно для проявления модифицирующего эффекта (0.01-0.001 М).

Соотношение компонентов водной фазы и органического модификатора (ацетонитрил) составляло 60:40 (по объему), температура колонки 30°С. В максимумах пиков были записаны спектры поглощения при длинах волн 200-400 нм, шаг 2 нм.

Коэффициенты емкости по формуле: k' = (t-t₀)/t_0, где t - время удерживания вещества, t₀ - мертвое время колонки (определяется по времени удерживания несорбируемого компонента - нитрит натрия, л = 210 нм).

Коэффициенты емкости алкалоидов на хроматографических колонках с различными сорбентами

Для соединений, способных при данном значении рН образовывать с ИПР адсорбированный комплекс, характерно увеличение коэффициента емкости в ряду сорбентов Phenyl-, C-8, C-18. Для производных метилксантина (кофеин, теобромин и теофиллин) при значении рН ПФ равном 2.5 образования комплексов с противоионом не происходит и в приведенном ряду сорбентов коэффициент емкости будет снижаться, что, по-видимому, связано с конкурентными взаимодействиями соли алкилсульфокислоты и вещества с сорбентом.

Технология производства сорбентов у различных производителей может различаться. Например, содержанием углерода в неподвижной фазе, площадью поверхности сорбента, формой силикагеля, степенью прививки активных групп, наличием эндкеппинга и другие.

Однако механизм разделения веществ близких по химической структуре на хроматографических колонках различных производителей будет одинаков.

Поэтому в нормативную документацию по контролю качества лекарственных средств (фармакопейные статьи, Фармакопеи США, Великобритании, Европы и другие) вносятся только геометрические параметры хроматографических колонок с указанием сорбента (напри-мер, октильный силикагель) без указания конкретного производителя колонок, при этом зачастую приводятся значения времен удерживания или коэффициентов емкости примесей по отношению к стандартному веществу.

Для проверки правильности коэффициентов емкости рекомендуется использовать относительные коэффициенты емкости (то есть, по сути, селективность разделения (б) иденти-фицируемого вещества и какого-нибудь общедоступного стандарта, например, кофеина).

Селективность разделения (б = k'_???/k'_станд.) будет практически неизменна при незначительном изменении условий хроматографирования, что связано с одинаковым механизмом разделения.

Полученные данные использовались для идентификации и разработки методик количественного определения алкалоидов в траве чистотела большого и листьях маклеи сердцевидной. Эти растения включены в Государственную фармакопею Республики Беларусь и являются представителями флоры (чистотел большой) или успешно культивируются в условиях умеренно-континентального климата (маклея сердцевидная). Качественный состав исследуемых растений с помощью метода тонкослойной хроматографии охарактеризован в работе [7].

Рис. 1. Хроматограмма уксуснокислого экстракта из травы чистотела большого (1 - хелидонин, 2 - коптизин, 3 - сангвинарин, 4 - неидентиф. вещество, 5 - берберин, 6 - хелеритрин)

Рис. 2. Хроматограмма уксуснокислого экстракта из листьев маклеи сердцевидной (1 и 2 - неидентиф. вещества, 3 - сангвинарин, 4 - хелеритрин)

Экстракцию суммы изохинолиновых алкалоидов из растительного сырья проводили по методике Европейской фармакопеи для травы чистотела.

Полученный уксуснокислый экстракт фильтровали через фильтр с диаметром пор 0.45 мкм и инжектировали в хроматограф. Хроматограммы полученных экстрактов представлены на рис. 1, 2. Определение проводили на хроматографической колонке Zorbax SB С-18, размер частиц 5 мкм, длина колонки 250 мм, диаметр 4.6 мм в условиях описанных выше.

Как видно из рис. 1, 2 пики алкалоидов на хроматограммах хорошо разрешены между собой, в траве чистотела идентифицированы пять, а в листьях маклеи два основных алкалоида.

Выводы

1. Определены коэффициенты емкости 14 алкалоидов в трех хроматографических системах. Предлагаемые условия хроматографирования позволяют в течение 1.5-2 часов проводить предварительную идентификацию алкалоидов в растительном сырье.

2. Полученные данные по коэффициентам емкости 14 алкалоидов в трех хроматографических системах использованы для определения качественного состава листьев маклеи сердцевидной и травы чистотела большого, выращенных в условиях умеренно-континентального климата.

Литература

хроматографический додоцилсульфат натрий аткалоид

[1] Фармакогнозия. Лекарственное сырье растительного и животного происхождения: учебное пособие. под ред. Г.П. Яковлева. 2-е изд., испр. и доп. СПб.: СпецЛит. 2010. 863 с.

[2] Булатов А.А., Бузук Г.Н., Ловкова М.Я. Изменчивость качественного и количественного состава алкалоидов чистотела большого в течение вегетации. Химико-фармацевтический журнал. 1990. №5. С. 50-53.

[3] Watts Jo. Clarke's Analysis of Drugs and Poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material Fourth Edition. Pharmaceutical press, London. 2011. 2473p.

[4] Моисеев Д.В., Шелюто В.Л., Бузук Г.Н. Идентификация флавоноидов в растениях методом ВЭЖХ. Химико-фармацевтический журнал. 2011. №1. С. 35-38.

[5] Рудаков О.Б., Востров И.А., Федоров С.В., Филиппов А.А., Селеменев В.Ф., Приданцев А.А. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. Воронеж: Водолей. 2004. 528c.

[6] Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига: Зинатне. 1988. 390 с.

[7] Бузук Г.Н. Влияние температуры сушки на компонентный состав и количественное содержание алкалоидов в сырье некоторых видов лекарственных растений. Растительные ресурсы. 1991. Т.27. №3. С. 100-108.

Размещено на Allbest.ru