Надмолекулярные комплексы сквалена в реакции электрофильного присоединения

Размещено на http://www.allbest.ru/

Надмолекулярные комплексы сквалена в реакции электрофильного присоединения

Получены надмолекулярные образования из сквалена, тетрагидрофурана в присутствии галоге-новодородов, которые, как и природные везикулы, имеют мембрану, предохраняющую содержимое от воздействия внешней среды. Исходя из этого, можно полагать, что многие детали поведения природных везикул можно моделировать, используя полученные нами надмолекулярные комплексы нового типа на основе сквалена и полярных молекул растворителя, а с другой стороны, намечают путь поиска новых надмолекулярных структур на основе сквалена и полярных низкомолекулярных молекул для использования в производстве нового поколения лекарственных средств, лишенных недостатков везикул на основе фосфатидилхолина.

Надмолекулярные комплексы широко распространены в природе. В живых организмах таким функциональным комплексом являются везикулы - наноразмерные внеклеточные надмолекулярные образования, участвующие не только в процессах пино- и фагоцитоза, но и при передаче информации между клетками, путем выделения их в окружающую среду и распространения кровотоком по всему организму [1]. Такой способ передачи информации был открыт несколько лет тому назад [2] и уже в 2013 году работы по изучению везикулярного транспорта были удостоены Нобелевской премии: «Нобелевская премия по физиологии и медицине (2013): везикулярный транспорт» [3].

Названая Нобелевская премия касается только маленькой части существующих в природе надмолекулярных наноразмерных образований. Последние играют определяющую роль в развитии новых способов доставки лекарственных средств в организме. Однако, везикулы, построенные с использованием фосфатидилхолина, не устраивают разрешительные органы из-за большой части, приходящейся на фосфолипиды, и малой нагруженности вследствие этого активным компонентом. В связи с этим поиск и синтез новых типов везикул не только для доставки действующих веществ в организме, но и для управления реакционной способностью органических веществ представляется чрезвычайно важным этапом развития химии.

Поэтому поиск новых надмолекулярных образований, лишённых отмеченных выше недостатков, представляется чрезвычайно актуальным не только с точки зрения медицины, но и реакционной способности молекул субстрата, включенных в такие образования.

Чрезвычайно перспективным направлением в данной области является использование сквалена для образования и стабилизации наночастиц различного строения, используемых для получения эмульсий с заданными свойствами [4].

Особый интерес представляет возможность стабилизации эмульсий на основе сквалена не фосфатидилхолином и подобными ему молекулами, а низкомолекулярными соединениями, что может решить проблемы размера образующихся частиц и их низкой нагруженности, присущие для липосом, образованных фосфатидилхолином. В данной работе описано явление образования оригинального типа наноразмерных комплексов из полинепредельного соедине-ния сквалена и полярных молекул растворителя [5], имеющих размеры около 10 нм, и относимых к классу экзосом. Образование таких комплексов со скваленом может объяснить многие особенности его биологической активности, которая зависит от того - в чистом виде используется сквален или в составе масла.

Сквален - это ключевой прекурсор биосинтеза стероидов у млекопитающих, растений, бактерий и грибов, и поэтому он используется для моделирования и создания ингибиторов стадии его окисления и циклизации [6]. Также в последнее время активно развивается область наномедицины, заключающаяся в увеличении биологической доступности и эффективности лекарственных средств, за счет их «сшивания» со скваленом, путем его модификации по одной терминальной кратной связи [7].

Основная проблема этих областей - отсутствие реакций, обеспечивающих приемлимую региоселективность. Максимальным достижением является 30% выход гидроксибром-произ-водного сквалена [8]. Учитывая практическую значимость и растущий интерес к созданию лекарственных средств на основе сквалена, нами была поставлена цель получить его новые производные при одновременном увеличении региоселективности.

Для осуществления этого была предпринята попытка гидробромирования сквалена в различных условиях (схема 1):

взаимодействие сквалена с 1 или 2-мя эквивалентами газообразного HBr в хлороформе, хлористом метилене и ТГФ (направление 1);

взаимодействие сквалена с 1 или 2-ми эквивалентами водного раствора HBr (0.05-0.1 н) (направление 2);

проведение реакции с участием в-циклодекстрина (направление 3).

Схема 1. Направления и условия взаимодействия HBr со скваленом

низкомолекулярный фагоцитоз лекарственный

Как оказалось, ни в одном из предполагаемых случаев конверсия сквалена не происходит.

В случае с реакцией взаимодействия сквалена с газообразным HBr, отсутствие продукта присоединения объяснимо низкой реакционной способностью бромоводорода в неполярной среде. Отсутствие реакции в случае использования водного бромоводорода в ТГФ противоречит общепринятым фактам. Полученные нами результаты, на первый взгляд, не понятны и требует отдельного рассмотрения.

Как следует из литературных данных, для сквалена в присутствии фосфолипидов, в частности фосфатидилхолина, характерно образование в водной фазе наночастиц диаметром около 100 нм [9, 10]. По нашему предположению причиной отсутствия взаимодействия сквалена в растворе ТГФ с водным раствором HBr является образование наночастиц, подобных описанным в [10], только функцию фосфолипида моделирует полярный ТГФ с м = 1.63 D.

Данное предположение подтвердилось при исследовании полученной смеси методом динамического светорассеяния (рис. 1), в результате которого показано, что в системе есть наночастицы с диаметром порядка 10 нм. Это первый, известный нам случай, когда стабилизация частицы осуществляется низкомолекулярным растворителем - ТГФ.

Исследование образования и размера наночастицсквалена в смеси ТГФ/H2O в присутствие кислоты проводилось при различном соотношении компонентов, что представлено в табл. 1. Количество сквалена, растворяемого в ТГФ соответствовало 1 ммолю вещества. Объём используемой кислоты рассчитывали исходя из взаимодействия сквалена с бромоводородом в соотношении 1 к 1.

Таблица. 1. Размеры ассоциатов, образующихся в различных смесях сквален-ТГФ-водный раствор HBr

Рис. 1. Распределение частиц по размеру: а. - в смеси №1 и №4; б. - в смеси №2 и №5; в. - в смеси №3 и №6

Исходя из размера частиц и участвующих в их образовании молекул, мы попытались предложить строение образующихся агрегатов:

Сквален представляет собой линейную структуру длиной 30.6±0.15 Е [11].

Исходя из размера ТГФ равного: lТГФ ? 4.4 Е, можно вычислить минимальную длину комплекса сквален-ГФ-HBr без учета Br- (lmin). Она будет равняться:

где lмм - среднее межмолекулярное расстояние, равное 3 Е.

Отсюда

Если учитывать анионы брома, то получим диаметр частиц, соответствующий измеренному диаметру частиц, равному 8.9 нм.

Таким образом, поперечную структуруобразующегося агрегата можно представить в следующем виде:

или с учетом того, что галогеноводороды в растворах димерны, будем иметь следующее сечение мицеллы (молекулы сквалена находятся внутри, а полярная оболочка - снаружи):

В образовании наночастицы D ? 10 нм должно участвовать около 600 молекул сквалена или из 1 моля сквалена образуется частиц. Добавление ПАВ (бензилдиметилтетрадециламмоний бромид) к системе из сквалена-ТГФ-воды-HBr разрушает наночастицы D ? 10 нм, превращая их в более мелкие с D ? 6.5 нм. Исходя из размера наноассоциатов ориентировочное число молекул сквалена в ядре составляет ? 300.

Рис. 2. Фрагмент ЯМР 1Н спектра экстракта смеси сквален: диоксан: бромистоводородная кислота (0.11 М)

Как и следует ожидать в смеси с диоксаном подобные ассоциаты не образуются и сква-лен подвергается электрофильному присоединению по кратной связи с образованием смеси продуктов, что следует исходя из данных ЯМР 1Н спектроскопии экстракта смеси бромгид-рированиясквалена в водном диоксане.

Наличие продуктов присоединения по кратной связи при соотношении реагентов 1 к 1 подтверждается уменьшением интегральных соотношений интенсивностей сигналов в области 5 м.д. и группы сигналов в области от 1 до 2.5 м.д., которое в случае со скваленом должно быть 3 : 22, а в случае полученной смеси составило 3 : 34, к тому же о наличии продуктов присоединения по кратной связи свидетельствуют дублеты в области 4 м.д., относящийся к протону продукта присоединения, принадлежащему исходной кратной связи, и два синглета при 1.39 и 1.40 м.д., которые соответствуют CH3-группам при четвертичном атоме углероде в sp3-гибридизации (рис. 2).

Таким образом, можно заключить, что полученные надмолекулярные образования, как и природные везикулы, имеют мембрану, которая предохраняет содержимое от воздействия внешней среды. Исходя из этого, можно полагать, что многие детали функционирования природных везикул можно моделировать, используя полученные нами надмолекулярные комплексы нового типа на основе сквалена и полярных молекул растворителя, а с другой стороны, намечают путь поиска новых надмолекулярных структур на основе сквалена и полярных низкомолекулярных молекул для использования в производстве нового поколения лекарственных средств.

Экспериментальная часть

В работе использовали сквален марки Sigma-Aldrich. Спектры ЯМР 1Н регистрировали на приборах JEOL (400 МГц) и Bruker Avance (300TMи 400ТМ). В качестве внутреннего стандарта были использованы остаточный сигнал протона растворителя с химическим сдвигом д = 7.27 (СDCl3), д = 2.5 (d6-ДМСО), д = 4.8 (D2O). Для качественного анализа состава реакционных смесей и эмульсий исполь-зовали пластинки Силуфол УФ-254 (15Ч20 см) при 25 °С и Sorbfil (100Ч150 мм).

Измерения для эмульсий проводились методом динамического светорассеяния с использованием прибора «Zetasizer Nano ZS Zen3600 Malvern». Результаты регистрировались в виде зависимости распределения объемной (массовой) доли частиц от величены их гидродинамического диаметра. Эмульсии готовили путем последовательного смешения компонентов. Сквален (410 мг, 1 ммоль) растворяли в ТГФ (для смеси №1 и 4 объемом 25 мл, для смеси №2 и 5 объемом 7 мл, для смеси №3 и 6 объемом 5 мл) и затем прикапывали экспериментально подобранное количество бромистоводородной кислоты заданной концентрации (для смеси №1 концентрация кислоты составила 0.11 М, объем 9 мл, для №2 1.1 М и 1 мл, для №3 8.8 М и 114 мкл, для смесей №4-6 использовали только воду в количестве, эквивалентном кислоте, соответственно), смесь активно встряхивали до получения однородной эмульсии. Полученные эмульсии стабильны в течение 20-40 мин.

Аналогично процедуру проводили с использованием диоксана. Сквален массой 300 мг (0.73 ммоль) растворяли в диоксане объемом 43 мл (меньшее количество диоксана не дает однородной смеси) и прикапывали 9 мл бромистоводородной кислоты концентрации 0.11 М. Полученную смесь перемешивали и выдерживали в течение суток, после чего трижды экстрагировали МТБЭ, органические слои промывали раствором соды, сушили над Na2SO4 и концентрировали с помощью роторного испарителя под вакуумом. Полученную реакционную смесь анализировали на содержание продуктов конверсии сквалена методом ЯМР-спектроскопии.

низкомолекулярный фагоцитоз лекарственный

Выводы

Cпособность сквалена к образованию устойчивых эмульсий существенным образом влияет на его реакционную способность даже в системах, для которых ранее не наблюдалось явления образования наночастиц.

С одной стороны, это указывает на невозможность проведения селективного присоединения по кратной связи в условиях реакции электрофильного присоединения с помощью формирования различного рода мицелл, с другой, открывает новые возможности для создания наночастиц медицинского назначения с отличными от наиболее распространенных фосфолипидных липосом свойствами и лишенных присущих им недостатков.

Литература

1.B.T. Pan et al. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. J. Cell Biol. 1985. Vol.101. P.942-948.

2.S. Bloemendal, U. Kьck. Cell-to-cell communication in plants, animals, and fungi: A comparative review. Naturwissenschaften. 2013. Vol.100. P.3-19.

3.J.E. Rothman. The Principle of Membrane Fusion in the Cell (Nobel Lecture). Angew. Chemie Int. Ed. 2014. P.12676-12694.

4.L.H. Reddy, P. Couvreur. Squalene: A natural triterpene for use in disease management and therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. Elsevier B.V. 2009. Vol.61. No.15. P.1412-1426.

5.A.V. Kalistratova, E.N. Ofitserov. Nanoparticles, is it good for chemistry? All-Russian Conf. with Int. Particip. «Modern Prog. Chem. unsaturated Compd. alkynes, alkenes, arenes heteroarenes», Dedic. to Sci. Herit. Mikhail Grigor'evich Kucherov. Saint Petersburg. 2014. P.140.

6.Фурсова А.В., Офицеров Е.Н. Химический состав растений рода Amaranthus. Часть 2. Ингиби-рование биосинтеза и метаболизма сквалена. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.25. №7. С.50-75.

7.D. Desmaлle, R. Gref, P. Couvreur. Squalenoylation: a generic platform for nanoparticular drug delivery. J. Control. Release. Elsevier B.V. 2012. Vol.161. No.2. P.609-618.

8.Фурсова А.В., Офицеров Е.Н. К синтезу ингибиторов 2,3-скваленэпоксидазы на основе сквалена реакцией Михаэлиса-Беккера. Бутлеровские сообщения. 2011. Vol.25. №7. P.76-80.

9.C.B. Fox et al. Effects of emulsifier concentration, composition, and order of addition in squalene-phosphatidylcholine oil-in-water emulsions. Pharm. Dev. Technol. 2011. Vol.16. No.5. P.511-519.

10.M.R. Rasch et al. Chains, sheets, and droplets: assemblies of hydrophobic gold nanocrystals with saturated phosphatidylcholine lipid and squalene. Langmuir. 2012. Vol.28. No.43. P.15160-15167.

11.N. Nicolaides, F. Laves. The stereochemistry of squalene. A new method for the determination of cis-trans isomerism. J. Am. Chem. Sociaty. 1954. Vol.76. P.2596-2597.

Размещено на Allbest.ru