Изменение структуры хитин-глюкановых комплексов грибов в результате сорбции ионов меди(II)

Полная исследовательская публикация ______________________ Смотрина Т.В. и Киселева Л.А.

Размещено на http://www.allbest.ru/

136 _____________ http://butlerov.com/ _____________ ©--Butlerov Communications. 2013. Vol.34. No.4. P.135-139.

Тематический раздел: Биохимические исследования. Полная исследовательская публикация

Подраздел: Химия хитин-клюкановых комплексов. Регистрационный код публикации: 13-34-4-135

г. Казань. Республика Татарстан. Россия. _________ ©--Бутлеровские сообщения. 2013. Т.34. №4. _________ 135

Изменение структуры хитин-глюкановых комплексов грибов в результате сорбции ионов меди(II)

Смотрина Татьяна Валерьевна

Киселева Лариса Александровна

Известно большое число минеральных, синтетических и органических сорбентов, используемых для удаления тяжёлых металлов из промышленных стоков и выбросов. Преимущества органических сорбентов перед минеральными определяются их высокой эффективностью, специифичностью и селективностью.

Среди органических сорбентов особое место занимают природные полимерные материалы, такие как хитин и его производное - хитозан. Хитин является основным структурным компонентом клеточных стенок грибов, наружных покровов ракообразных, а также насекомых. Хитин клеточных стенок грибов вместе с глюканами образует хитин-глюкановый комплекс (ХГК), обладающий высокой сорбционной способностью по отношению к ионам тяжелых металлов и радионуклидам [1].

В последние годы опубликовано большое число работ, посвященных изучению сорбционных свойств хитина и его производных. Но, несмотря на значительный объем имеющихся экспериментальных данных, основные представления о закономерностях и механизме сорбции ионов металлов этими полисахаридами составлены при изучении относительно чистых препаратов, полученных из ракообразных.

При этом следует учитывать, что надмолекулярная организация хитина грибов отличается от таковой для ракообразных и насекомых, и влияние этих особенностей на сорбционные свойства остается недостаточно ясным.

Количественное соотношение между хитином и глюканом в ХГК, определяющее сорбционные свойства препарата по отношению к ионам тяжелых металлов, зависит от источника, условий культивирования гриба одного вида, а также от способа извлечения ХГК. Наиболее изученными в этом аспекте являются мицелиальные грибы [2-4], при этом исследованию ХГК высших грибов не уделяется должного внимания.

Согласно имеющимся литературным данным увеличение содержания глюкановой компоненты в ХГК увеличивает его сорбционную емкость [5]. Но, учитывая, что сорбция ионов металлов происходит преимущественно по донорно-акцепторному механизму за счет комп-лексообразования с атомами азота хитиновой компоненты, интерес представляет изучение влияния количественного соотношения компонентов ХГК на его сорбционную способность.

Целью данной работы являлось изучение механизма сорбции ионов Cu²⁺ и строение медьсодержащих ХГК мицелиальных и высших грибов, отличающихся условиями культивирования и выделения. Выбор катиона обусловлен наличием большого числа работ по сорбции ионов меди(II) природными полисахаридами, в том числе хитином, хитозаном, целлюлозой и другими [6-8].

Экспериментальная часть

хитин глюкановый сорбционный кристалличность

Объектами исследования являлись образцы ХГК, выделенные из низших грибов Aspergillus niger и высших грибов Pleurotus Ostreatus. Образцы ХГК, полученные в результате обработки отходов производства лимонной кислоты из грибов Aspergillus niger, выращенных на различных средах, а также ХГК Pleurotus Ostreatus были выделены в соответствии с запатентованным методом [9] и предо-ставлены лабораторией экспериментальной микологии Института микробиологии им. С.Н. Вино-градского РАН.

Табл. 1. Состав хитин-глюкановых комплексов грибов Aspergillus niger и Pleurotus ostreatus

Состав исследуемых ХГК представлен в табл. 1. Состав образцов ХГК Aspergillus niger 1 и 2 выращены на различных средах (г/л): ХГК 1 - сахароза - 30.0, аспарагин - 1.0, NH₄NO₃ - 0.6, KH₂PO₄ - 1.0, MgSO₄7H₂O - 0.5; ХГК 2 - сахароза - 30.0, аспарагин - 2.0, KH₂PO₄ - 1.0, MgSO₄7H₂O - 0.5, CaCO₃ - 5.0.

Содержание меди в образцах ХГК (после выдерживания в 0, 1 М растворе CuSO₄ в течение двух суток до установления сорбционного равновесия) определяли атомно-абсорбционным методом на спектрофотометре Analist-80 (Perkin Elmer, USA) пламенным методом с коррекцией неселективного поглощения. Атомизация проводилась в пламени ацетилен - воздух. В качестве источника излучения использовали лампу с полым катодом на Cu Lumina (USA). Пробоподготовку проводили по методу «мокрого озоления» путем нагревания небольшой навески пробы с концентрированной азотной кислотой и последующим разбавлением полученного раствора бидистиллированной водой. Полноту растворения навески контролировали визуально.

Для сравнительного изучения структуры образцов ХГК различного происхождения до и после сорбции ионов меди (II) из водных растворов использовали метод рентгеноструктурного анализа.

Исследования проводили на установке ДРОН-3М в режиме на просвет с использованием фильтрованного никелем Cu-K-излучения. Съемку проводили в режиме непрерывного сканирования.

Межплоскостные расстояния рассчитывали на основе угловых положений кристаллических рефлексов (по центру тяжести) на дифрактограммах. Основой для расчета межплоскостных расстояний являлось уравнение Вульфа-Брэгга ( = 1.54 Е).

Степень кристалличности образцов определяли по отношению площадей кристаллических рефлексов к общей площади кривой. Общую степень кристалличности образцов определяли в области углов 2 = 8-50^о. Степень кристалличности хитиновой компоненты в ХГК определяли в области углов 10-28^о (область основного хитинового рефлекса).

Результаты и их обсуждение

На рис. 1 представлены дифрактограммы ХГК Aspergillus niger и Pleurotus ostreatus, которые содержат ряд рефлексов, отвечающих структуре -хитина и характерных для хитина животного происхождения.

При сравнении интенсивностей основного хитинового рефлекса при 2и =19.4^о видно, что ХГК Pleurotus ostreatus содержит больше хитина при меньшей его упорядоченности по сравнению с ХГК Aspergillus niger. На это указывает большая ширина этого рефлекса при большей интенсивности (рис. 1).

В отличие от дифрактограмм хитина животного происхождения, для хитин-глюкановых комплексов наблюдается пик при 2и = 29.1^о, что, по-видимому, связано с присутствием глюканов.

Для проверки этого предположения были исследованы образцы ХГК, выделенные из гриба Aspergillus niger, выращенного на различных средах, и имеющие различное соотношение хитина и глюканов.

Дифрактограммы указанных образцов представлены на рис. 2. На дифрактограммах наблюдается интенсивный кристаллический рефлекс при 2и = 29.2^о с размерами кристаллитов 100-110 Е и довольно четкие рефлексы в области 2и = 33-44^о.

Интенсивность (I) основных «хитиновых» рефлексов у Aspergillus niger №1 выше, чем у Aspergillus niger №2, что указывает на бульшее содержание хитина в ХГК, а интенсивность рефлекса при 2и = 29.2^о напротив меньше. Поэтому, можно предположить, что этот рефлекс обусловлен наличием глюканов.

Рис. 1 Дифрактограммы ХГК Pleurotus ostreatus (1) и Aspergillus niger (2)

Рис. 2. Дифрактограммы ХГК Aspergillus niger с соотношением хитин: глюканы: 1 - 1:1.4; 2 - 1:2.4

Общая степень кристалличности (СК) у Aspergillus niger 2 выше, чем у 1 при большей сорбционной способности по отношению к ионам меди(II). Определенные же по хитиновому рефлексу СК для Aspergillus niger 2 меньше, при большем значении межплоскостного рас-стояния (d), по сравнению с №1 (табл. 1).

Табл. 1. Сравнительные характеристики рефлексов на дифрактограммах ХГК Aspergillus niger с различным содержанием хитина и глюканов

Вероятно, повышенная сорбционная емкость ХГК Aspergillus niger 2 с бульшим содержанием глюканов связана с меньшей СК хитина, а значит и с большей доступностью функциональных групп хитиновых макромолекул.

Из вышесказанного можно сделать вывод, что только на основании сравнения общей величины СК ХГК нельзя делать предположения о сорбционной способности объектов. В большей степени, по-видимому, играет роль степень доступности активных центров.

Сравнение дифрактограмм образцов ХГК гриба Pleurotus ostreatus, выделенных различными способами (рис. 3), показывает, что способ получения ХГК из грибов существенно влияет на структуру получаемого комплекса. Необходимо отметить, что основным отличием способа получения ХГК из Pleurotus ostreatus 2 от Pleurotus ostreatus 1 являются более «мягкие» (без использования концентрированных растворов кислот и щелочей) условия выделения ХГК.

Полученные дифрактограммы отличаются друг от друга как интенсивностью и шириной основных рефлексов, что указывает на различную упорядоченность структуры, так и числом и соотношением интенсивностей в данной структуре, что может быть вызвано различной упаковкой цепей макромолекул.

Менее выраженные максимумы на дифрактограммах Pleurotus ostreatus 1 свидетельствуют об аморфизации ХГК при выделении его с помощью концентрированных кислот и щелочей. Отношение интенсивностей рефлексов при 2и = 19.4^о и 2и = 29.2^о, пропорциональное отношению содержания хитина и глюканов в ХГК, на более высокий выход хитина в «жестких условиях».

Рис. 3. Дифрактограммы ХГК Pleurotus ostreatus, выделенных различными способами: 1 - «жесткие условия»; 2 - «мягкие условия»

При сравнении полуширины хитинового рефлекса (6.7^о и 5.6^о - для образцов 1 и 2 соответственно) можно заключить, что в ХГК, полученном в жестких условиях, хитин обладает более дефектной структурой за счет разрыва части межмолекулярных водородных связей и нарушения ориентации макромолекулярных цепей полимера.

Сравнительный анализ дифрактограмм исходного и медьсодержащего хитин-глюкановых комплексов Aspergillus Niger (рис. 4) позво-лил обнаружить рост интенсивностей рефлексов при 2и = 12.4^о; 26^о и 29.2^о и появление новых рефлексов в области основного хитинового максимума, что свидетельствует об образовании комплекса Cu-ХГК.

Полученные данные коррелируют с результатами, описанными в работе [10] на примере кадмийсодержащих ХГК.

Общая степень кристалличности образцов исходной и катионной форм ХГК Aspergillus niger (СК = 63% и 64% соответственно) практически не меняется при одновременном увели-чении СК хитиновой компоненты от 37% в исходном образце до 57% в Cu-ХГК комплексе.

Такая тенденция позволяет предположить, что в результате сорбции ионов металла в ХГК происходит перераспределение кристаллической и аморфной фаз. Исчезновение рефлекса при 2и = 29^о может свидетельствовать об аморфизации глюкановой компоненты, а появление нескольких кристаллических рефлексов при 2и = 19.36^о - об упорядочении хити-новой структуры за счет координации макромолекул хитина с ионами Cu²⁺.

Аналогичные изменения наблюдаются при сравнении дифрактограмм исходного и медьсодержащих образцов ХГК, выделенного из гриба Pleurotus ostreatus (рис. 5).

Табл. 2. Сравнительные характеристики рефлексов на дифрактограммах исходного и медьсодержащих (отмытый водой и неотмытый) образцов ХГК Pleurotus ostreatus

Исходный образец ХГК (до проведения сорбции) имеет более четкий рефлекс при 2и = 29.1^о, который на дифрактограммах медьсодержащих образцов менее выражен. Основной хитиновый рефлекс при 2и = 19.3^о для неотмытого образца Cu-ХГК имеет разрешенную структуру, что свидетельствует об упорядоченности хитиновой компоненты в процессе сорбции.

При отмывании катионных форм водой удаляются ионы меди, связанные с полимерной матрицей слабыми электростатическими взаимодействиями, поэтому наблюдаемые для отмытого Cu-ХГК наименьшая полуширина «хитинового» рефлекса () при наибольшем отношении интенсивностей рефлексов хитиновой и глюкановой компонент (I_хит./I_глюк. = 3.86; 6.1; 8.1 для исходного ХГК, неотмытого и отмытого водой Cu-ХГК соответственно) также свидетельствуют об упорядочении хитина в процессе комплексообразования с ионами металла (табл. 2).

Выводы

1. Методом рентгеноструктурного анализа проанализированы структурные особенности хитин-глюкановых комплексов (ХГК) мицелиальных и высших грибов Aspergillus niger и Pleurotus Ostreatus, отличающихся способом культивирования и выделения, а также характер изменения надмолекулярной структуры ХГК грибов в результате сорбции ионов меди(II). Показано, что на сорбционную способность наибольшее влияние оказывает не общая степень кристалличности ХГК, а общая степень кристалличности хитиновой компоненты, определяющая доступность атомов азота ацетамидных и аминогрупп.

2. Координация ионов Cu²⁺ с макромолекулами хитина в процессе сорбции приводит к упорядочению хитиновой компоненты хитин-глюкановых комплексов мицелиальных и высших грибов Aspergillus niger и Pleurotus Ostreatus.

Литература

[1] Шабрукова Н.В., Зябликова Т.А., Зайнетдинова Д.Р. и др. О наличии полипептидной мостиковой связи в хитин-глюкановом комплексе. Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2001. №4. C.1-4.

[2] Винтер М.В., Дедюхина Э.Г., Крыницкая А.Ю. Исследование синтеза арахидоновой кислоты грибами Mortierella alpina на средах, содержащих глицерин в качестве единственного источника углерода и энергии. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.26. №9. С.77-82.

[3] Винтер М.В., Дедюхина Э.Г., Крыницкая А.Ю. Отходы производства биодизельного топлива как субстрат для культивирования грибов Mortierella alpina. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.26. №9. С.83-87.

[4] Шубаков А.А., Михайлова Е.А. Общая химическая характеристика полисахаридов и полисахарид-белковых комплексов клеточной стенки гриба Aspergillus niger. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.28. №20. С.53-57.

[5] Феофилова Е.П. Хитин грибов: распространение, биосинтез, физико-химические свойства и перспективы использования. Хитин и хитозан. М.: Наука. 2002. С.100-111.

[6] Горбачева И.Н., Смотрина Т.В., Смирнов А.К. и др. Свойства полимерных композиций на основе полисахаридов и их получение в условиях твердофазного деформирования под давлением. Химические волокна. 2003. №1. С.18-23.

[7] Осман Аслан, Таланцев В.И., Грунин Ю.Б.Исследование пористой и надмолекулярной структуры ионообменной целлюлозы. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.30. №4. С.99-104.

[8] Красильникова С.В., Грунин Ю.Б., Смирнова Л.Г. Изучение сорбции ионов Cu²⁺ и Mn²⁺ на древесной целлюлозе. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.32. №13. С.105-109

[9] Козлов В.П., Наумов Е.Г., Немцев Д.В. и др. Способ получения хитозанглюканового комплекса. Пат. РФ № 2121505. Заявл. 15.06.1995. Опубл. 10.11.1998.

[10] М. Bhanoori, G. Venkateswerlu. In vivo chitin-cadmium complexation in cell wall of Neurospora crassa. Biochitiea et Biophysiea Acta. 2000. Vol.1519. P.21-28.

Размещено на Allbest.ru