Аминокислотный состав надземной части Geranium pratense, Geranium sylvaticum, Geranium palustre

Полная исследовательская публикация Разаренова К.Н., Захарова А.М., Протасова И.Д. и Жохова Е.В.

Размещено на http://www.allbest.ru/

74 _______________ http://butlerov.com/ ______________ ©--Butlerov Communications. 2012. Vol.31. No.8. P.73-78.

Тематический раздел: Биохимические исследования. Полная исследовательская публикация

Подраздел: Хроматографический анализ. Регистрационный код публикации: 12-31-8-73

г. Казань. Республика Татарстан. Россия. _________ ©--Бутлеровские сообщения. 2012. Т.31. №8. __________ 73

УДК 615.322

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия

Аминокислотный состав надземной части Geranium pratense L., Geranium sylvaticum L., Geranium palustre L

Разаренова Ксения Николаевна

Захарова Анна Михайловна

Род герань (Geranium L.) насчитывает около 400 видов, распространенных по всему миру [1]. На территории России и сопредельных государств СНГ произрастает порядка 70 видов рода герань [11]. Почти повсеместно в России произрастают герань луговая - Geranium pratense L. и герань лесная - Geranium sylvaticum L. На Северо-Западе России помимо G. pratense и G. sylvaticum часто встречаемый вид - герань болотная - Geranium palustre L. [4].

Указанные виды находят применение в народной медицине в качестве вяжущих, гемо-статических, противовоспалительных и антимикробных средств при болезнях пищеваритель-ной системы (диарея, гастриты, колиты, энтероколиты), при воспалительных заболеваниях ротовой полости, кровотечениях различного генеза, при подагре, ревматизме [9].

В надземной части данных видов обнаружены фенольные соединения (дубильные вещества, флавоноиды, фенольные кислоты), углеводы, витамины, органические кислоты [9].

Актуальной задачей современной фармацевтической науки является поиск растительных источников биологически активных веществ для создания на их основе препаратов различного фармакологического действия. Указанные представители рода герань являются перспектив-ными объектами для введения в фармацевтическую практику ввиду богатства химического состава, широкого спектра биологической активности и достаточной ресурсоведческой базы.

Аминокислоты, являясь частью сложного комплекса биологически активных соединений в растении, самостоятельно оказывают фармакологический эффект, а также способствуют синтезу, усвоению и потенцированию действия других растительных компонентов [2].

Среди указанных представителей рода Geranium аминокислотный состав был изучен ранее только у G. pratense. В надземной части G. pratense, заготовленной в республике Баш-кортостан, было идентифицировано 20 аминокислот и определено их количественное содер-жание [7]. Литературные данные по аминокислотному составу G. sylvaticum и G. palustre отсутствуют. аминокислотный хроматография изопропиловый спирт

Целью данной работы является исследование аминокислотного состава надземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre.

Наибольшее распространение для разделения и количественного определения амино-кислот получил метод жидкостной хроматографии [3]. Отсутствие хромофорных групп в большинстве молекул аминокислот требует стадии дериватизации для их определения при использовании оптических детекторов. Нами был использован фенилизотиоцианат в качестве дериватизирующего агента. Получение предколоночных дериватов аминокислот с фенилизо-тиоцианатом (ФИТЦ) имеет ряд преимуществ перед другими производными: в реакцию вступают все важнейшие аминокислоты; реакция проходит количественно и за короткое время с получением стабильных производных; побочные продукты, мешающие определению фенил-тиокарбаматных производных аминокислот, не образуются.

Экспериментальная часть

Объектами исследования служили образцы сырья G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre, заго-товленные в фазу цветения-начала плодоношения в июле-августе 2011 года в Ленинградской области. Надземная часть G. pratense и G. palustre была собрана в п. Пудость Гатчинского района. Сырье G. sylvaticum было заготовлено в окрестностях п. Стеклянный Всеволожского района. При заготовке осу-ществляли сбор как розеточных вегетативных побегов (срезали листья с остатком черешка не длиннее 3 см), так и полурозеточных генеративных побегов (срезали облиственные верхушки побегов длиной до 20-25 см) [8].

Сушку осуществляли воздушно-теневым способом, разложив сырье тонким слоем и периоди-чески перемешивая.

Для исследования хроматографическими методами из высушенного измельченного до размера частиц 2 мм сырья G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre были получены сухие извлечения на спирте этиловом 40%. Извлечения готовили методом 3-кратной мацерации при соотношении сырья и экст-рагента 1:10 в режиме нагревания на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа.

Объединенные отфильтрованные через бумажный фильтр экстракты концентрировали с исполь-зованием роторно-пленочного испарителя до густого остатка, а затем сушили над безводным кальция хлоридом при пониженном давлении и температуре 50-60 °С. Полученный сухой остаток измельчали до получения сыпучего порошка коричневого, зеленовато-коричневого или темно-желтого цвета.

Предварительное обнаружение аминокислот проводили методом восходящей одномерной бу-мажной хроматографии (БХ) в системе растворителей н-бутанол - кислота уксусная ледяная - вода (4:1:2) с использованием приема двойного разгона растворителей. Проявитель - раствор нингидрина в ацетоне 2% [10].

Перед нанесением на хроматографическую бумагу около 0.5 г сухого извлечения, полученного вышеописанным способом, растворяли в 2 мл спирта этилового 40%. Полученный раствор наносили на линию старта в количестве 10 мкл и хроматографировали в вышеописанных условиях.

Качественный и количественный состав аминокислот устанавливали методом высокоэффектив-ной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Анализ дериватов аминокислот и триптофана проводили на жидкостном хроматографе LC-20 Prominence производства фирмы Shimadzu со спектрофотометрическим детектором (254 нм); колонка с обращенной неподвижной фазой С18 (Supelco 250х4.6 мм, 5 мкм, производства фирмы Supelco) и соответствующей предколонкой; подвижная фаза - смесь раствора натрия ацетата 0.06 моль/л, рН = 5.5 (компонент А), раствор спирта изопропилового 1% в ацетонитриле (компонент В) и раствор натрия ацетата 0.06 моль/л, рН = 4.05 (компонент С). Хроматографический анализ проводили в режиме градиентного элюирования. Скорость потока подвижной фазы - 1.2 мл/мин [6].

Использовали стандартные образцы следующих аминокислот (Sigma): аспарагин (асп), глутамин (глу), гидроксипролин (о-про), серин (сер), глицин (гли), гистидин (гис), аргинин (арг), треонин (тре), аланин (ала), пролин (про), тирозин (тир), валин (вал), лизин (лиз), изолейцин (илей), лейцин (лей), фенилаланин (фен), метионин (мет), цистин (цис), цистеин (цис-цис), триптофан (три), а также фенилизотиоцианат (Fluka), ацетонитрил (о.с.ч., Криохром), изопропиловый спирт (о.с.ч.), ацетат натрия (х.ч.), соляная кислота (х.ч.), гидроксид натрия (о.с.ч.).

Для построения градуировочной зависимости навески стандартных образцов растворяли в раст-воре кислоты хлористоводородной 1 моль/л. Аликвоты стандартного раствора 5, 10, и 15 мкл поме-щали в три пробирки.

Для удаления кислоты хлористоводородной аликвоты высушивали досуха на водяной бане при температуре 60 °С в токе воздуха. К высушенным аминокислотам добавляли 0.10 мл раствора натрия гидроксида 0.15 моль/л, перемешивали, а затем добавляли 0.35 мл раствора фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте и 0.05 мл бидистиллированной воды.

Раствор оставляли на 20 мин при комнатной температуре, после чего высушивали досуха при температуре 60 °С. Сухой остаток растворяли в 1 мл бидистиллированной воды. Полученные растворы подвергали хроматографическому анализу (рис. 1).

Прибор: Shimadzu LC-20 AD Prominence, детектор диодная матрица. Колонка:

Supelco DiscoveryTM LC-18, 4.6x250мм, 5 мкм. Элюент: ацетатный буфер - смесь ацетонитрила с изопропиловым спиртом, режим градиентного элюирования, л: 254 нм.

Рис. 1. Хроматограмма стандартной смеси аминокислот после дериватизации ФИТЦ.

Для анализа образцов на общий состав аминокислот методом ВЭЖХ точную навеску сухого извлечения (~100 мг) растворяли в 5 мл спирта этилового 40% и выдерживали в ультразвуковой ванне 10 минут. Отбирали аликвоты (0.1-0.2 мл) и помещали их в пробирку. Высушивали досуха на водяной бане при температуре 60 °С в токе воздуха аналогично стандартным растворам. К высушенным аликвотам добавляли 0.10 мл раствора натрия гидроксида 0.15 моль/л, перемешивали.

Затем прибавляли 0.35 мл раствора фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте и 0.05 мл би-дистиллированной воды. Раствор вновь тщательно перемешивали и оставляли на 20 мин при ком-натной температуре, после чего высушивали досуха при температуре 65 °С. Сухой остаток растворяли в 1 мл бидистиллированной воды.

Полученные растворы подвергали хроматографическому анализу. Все аминокислоты, кроме триптофана и суммы цистин-цистеин определяли описанным способом.

Определение триптофана проводили без дериватизации фенилизотиоцианатом путем хромато-графического анализа приготовленного ранее раствора навески сухого извлечения в спирте этиловом 40%.

Для определения суммы цистеина и цистина, пробу предварительно окисляли надмуравьиной кислотой, затем определяли цистеиновую кислоту в виде фенилтиокарбаматного производного. Для получения надмуравьиной кислоты, в пробирке вместимостью 10 см3 смешивали одну часть пероксида водорода и 9 частей муравьиной кислоты, тщательно перемешивали.

Навеску сухого извлечения помещали в выпарительную чашку, добавляли 5 см3 окислительной смеси и полностью высушивали на водяной бане при температуре 60 єС, периодически помешивая. Сухой остаток растворяли в 5 мл спирта этилового 40%. Аликвоту полученного раствора переносили в пробирку.

Проводили дериватизацию фенилизотиоцианатом, отфильтровывали и образец вводили в хроматографическую колонку.

Результаты и их обсуждение

В результате предварительного исследования сухих извлечений из сырья G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre методом БХ после проявления раствором нингидрина в ацетоне 2% на хроматограммах в видимом свете были обнаружены пятна с характерным фиолетовым, крас-но-фиолетовым и желтым окрашиванием, что свидетельствует о наличии свободных амино-кислот в надземной части исследуемых видов рода Geranium.

Результаты исследования методом ВЭЖХ представлены в таблица. На рис. 2-4 приведены полученные в вышеописанных условиях хроматограммы сухих экстрактов G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre.

Таблица. Содержание свободных аминокислот в G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre (мг/г воздушно-сухого сырья)

В результате анализа качественного состава и количественного содержания аминокислот в траве G. pratense выявлено 20 аминокислот (таблица, рис. 2), из которых доминируют аргинин, серин, аспарагин. В надземной части G. sylvaticum обнаружены 19 аминокислот, из них по количественному содержанию преобладают аргинин, пролин, метионин, аланин (рис. 3). Трава G. palustre из 19 идентифицированных аминокислот в значительном количестве накапливает аргинин, пролин, метионин, серин, изолейцин (рис. 4).

Рис. 2. Хроматограмма  сухого экстракта G. pratense после модификации ФИТЦ.

Прибор: Shimadzu LC-20 AD Prominence, детектор диодная матрица. Условия: см. рис.1.

Среди обнаруженных свободных аминокислот G. pratense - 10 незаменимых (гистидин, аргинин, треонин, валин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, метионин, триптофан).

Эти же незаменимые аминокислоты (за исключением треонина) идентифицированы и в надземной части G. sylvaticum и G. palustre.

Рис. 3. Хроматограмма  сухого экстракта G. sylvaticum после модификации ФИТЦ.

Прибор Shimadzu LC-20 AD Prominence, детектор диодная матрица. Условия: см. рис.1.

Рис. 4. Хроматограмма  сухого экстракта G. palustre после модификации ФИТЦ.

Прибор Shimadzu LC-20 AD Prominence, детектор диодная матрица. Условия: см. рис. 1.

Общее содержание аминокислот составило 8.76, 13.17 и 13.46 мг/г воздушно-сухого сырья для G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre соответственно.

Следует отметить значительное количество метионина в надземной части G. sylvaticum и G. palustre, а также изолейцина в сырье G. palustre. Рекомендуемая в литературе лечебная доза травы G. sylvaticum и травы G. palustre - 10 г в день в форме настоя [5].

Эта доза травы G. sylvaticum способна удовлетворить 15% суточной потребности орга-низма взрослого человека в метионине [12]. 5% суточной потребности взрослого человека в метионине и изолейцине [12] будут удовлетворены при приеме настоя травы G. palustre в рекомендуемой дозе.

Полученные результаты являются основой для более глубокого изучения растений рода Geranium как источников природных биологически активных веществ.

Выводы

1. Проведен качественный и количественный анализ свободных аминокислот надземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre методом обращенно-фазовой ВЭЖХ фенилтиокарбамат-ных производных.

2. В траве G. pratense выявлено 20 аминокислот, из которых 10 незаменимых. В надземной части G. sylvaticum и G. palustre обнаружены 19 аминокислот, среди них 9 незаменимых.

Литература

[1] C. Aedo, F. Muтoz Garmendia, F. Pando. World checklist of Geranium L. (Geraniaceae). Anales Jard. Bot. Madrid. 1998. Vol.56. No.2. P.211-252.

[2] Plant amino acids: biochemistry and biotechnology. Ed. by Bijay K. Singh. New York. 1999. 621p.

[3] The Japanese Pharmacopea. 15th edition. Shibuya, Tokyo, Japan. 2006. Р.1814-1822.

[4] Бобров Е.Г. Род Geranium - герань. Флора СССР. М.; Л. 1949. Т.24. 742с.

[5] Брезгин Н.Н. Лекарственные растения Верхневолжья. Ярославль. 1973. 224с.

[6] Методика выполнения измерений массовой доли аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. М-02-902-142-07.

[7] Никитина В.С., Шендель Г.В. Содержание фенольных соединений и аминокислот в надземной части Geranium pratense и G. sibiricum (Geraniaceae). Раст. ресурсы. 2008. Т.44. Вып.2. С.74-81.

[8] Разаренова К.Н, Жохова Е.В. Определение содержания экстрактивных веществ и динамика их накопления в надземной и подземной частях герани лесной, г. луговой и г. болотной. Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сб. научных трудов. Пятигорск. 2011. Вып.66. С.167-171.

[9] Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Rutaceae-Elaeagnaceae. Л.: Наука. 1988. 357с.

[10] Хроматография на бумаге. Под ред. И.М. Хайса, К. Мацека. М. 1962. 851с.

[11] Черепанов С.А. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР). СПб. 1995. 992с.

Аннотация

Методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием предварительной модификации амино-кислот раствором фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте исследован аминокислотный состав сырья G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre.

Ключевые слова: аминокислоты, ВЭЖХ, Geranium pratense, Geranium sylvaticum, Geranium palustre, фенилизотиоцианат.

Размещено на Allbest.ru