Исследование кислотного гидролиза хитин-глюканового и хитозан-глюканового комплексов

60 ___________________ http://chem.kstu.ru _____________ ©-- Chemistry and Computational Simulation. Butlerov Communications. 2002. No. 8. 57.

Тематический раздел: Структурные исследования _________________________________________ Полная исследовательская публикация

Подраздел: Биохимия и биотехнология Регистрационный код публикации: bch2

©-- Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2002. № 8. ________ Ул. К. Маркса, 68. 420015 Казань. Татарстан. Россия. ________ 57

ИССЛЕДОВАНИЕ КИСЛОТНОГО ГИДРОЛИЗА ХИТИН-ГЛЮКАНОВОГО И ХИТОЗАН-ГЛЮКАНОВОГО КОМПЛЕКСОВ.

Хитин и хитозан, его N-деацетилированное производное, - биополимеры, нашедшие широкое применение в последнее время в пищевых, фармацевтических и биотехнологических отраслях благодаря таким своим качествам, как нетоксичность, биодеградируемость и биосовместимость. Олигосахариды хитина и хитозана, получаемые кислотным или ферментативным гидролизом этих биополимеров, обладают различными биологическими свойствами. Они обладают иммуностимулирующими свойствами 1, являются субстратами для хитинолитических ферментов, таких как лизоцим, хитиназа, хитозаназа и глюкозаминаза 2, ингибируют рост грибов и фитопатогенов и запускают в растениях механизмы самозащиты 3. В настоящее время для получения этих олигосахаридов используют крабовый хитин, в то время как некоторые мицелиальные грибы содержат в своем составе довольно большие количества хитина, который находится в них большей частью в виде ковалентно-связанных хитин-глюкановых комплексов. Выделение хитин-глюкановых комплексов из отработанной биомассы грибов микробиологических производств, в том числе из биомассы мицелиального гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты и их частичный гидролиз с целью получения биологически активных олигосахаридов для растениеводства явился бы наиболее рациональным путем использования этих отходов.

Известно, что исчерпывающий гидролиз хитина в концентрированных кислотах протекает с образованием уксусной кислоты и соли Д-глюкозамина, а хитозана, его деацетилированного производного, с образованием соли Д-глюкозамина:

В слабых кислотах хитин гидролизуется с образованием N-ацетил-Д-глюкозамина и соли Д-глюкозамина:

Однако низкотемпературный кислотный гидролиз хитина приводит к деградации хитина и его производных до биологически активных фрагментов - водорастворимых хитоолигосахаридов 4, 5.

Гидролиз ХГК, выделенного из биомассы гриба Aspergillus niger, в отличие от хитина и хитозана, неизучен. Нами предполагалось только, что на процесс его гидролиза влияют полипептидные мостики, связывающие, как и в некоторых других грибах 6, 7, цепи хитина и глюканов в этом комплексе 8, 9.

Целью нашей работы является выявление особенностей гидролиза ХГК концентрированными кислотами.

Результаты и дискуссия

Ранее нами было замечено, что гидролиз ХГК при комнатной температуре в концентрированных кислотах (серной, соляной) сопровождается выделением из гидролизатов пузырьков аммиака. При этом титриметрический метод анализа, использованный при изучении гидролиза ХГК 55% серной кислотой, показал, что кислотность гидролизата изменяется с течением времени. Поскольку процесс гидролиза ХГК и, соответственно, изменение кислотности его гидролизата усложняется отщеплением ацетильных групп, то в целях упрощения исследований в дальнейшем в этом эксперименте использовали хитозан-глюкановый комплекс (ХзГК), полученный деацетилированием ХГК в 50% растворе гидроокиси натрия в среде аргона:

Одновременно с деацетилированием в данной реакции идут процессы деградации полимерного комплекса, т.е. отщепления олигосахаридов глюкановых и хитозановых цепей и растворения их в реакционной смеси, что приводит к уменьшению молекулярной массы и выхода ХзГК.

В случае использования ХзГК процесс гидролиза также сопровождается выделением пузырьков аммиака и уменьшением кислотности гидролизата, наименьшая кислотность гидролизата устанавливалась на девятые сутки и затем практически не менялась. Улавливание выделяющегося газа в колбу с дистилированной водой и определение ее щелочности показало изменение рН с 6 до 9, а качественная реакция на NH₄⁺-ионы обнаружила их присутствие в воде, что свидетельствует о дезаминировании ХзГК в процессе гидролиза. Присутствие NH₄⁺-ионов в виде хлористого аммония обнаружено и в продуктах гидролиза ХГК и ХзГК концентрированной соляной кислотой.

Исследование продуктов гидролиза хитин-глюканового и хитозан-глюканового комплексов концентрированной соляной кислотой методом тонкослойной хроматографии на силикагельсодержащих пластинках “Silufol” в различных системах растворителей: н-бутанол : уксусная кислота : вода (9:6:1), н-бутанол : уксусная кислота : вода (4:5:1), пропанол : пиридин : вода (10:3:3), н-пропанол : этилацетат : вода (7:2:2) показало, что в продуктах гидролиза присутствуют, кроме хлористого аммония, еще три соединения. Сравнение факторов R_f и цвета пятен этих соединений с R_f и цветом пятен свидетелей: Д-глюкозамина хлоргидрата, глюкозы и фруктозы показало их идентичность. Качественная реакция Селиванова на кетогексозы также подтвердила присутствие фруктозы в гидролизатах. Интенсивность пятен фруктозы в продуктах гидролиза ХГК небольшая по сравнению с интенсивностью пятен глюкозы, в некоторых случаях при нанесении на пластинку метки с небольшим количеством продуктов гидролиза фруктозное пятно даже не проявлялось, в продуктах гидролиза ХзГК интенсивность пятен фркутозы и глюкозы примерно одинаковы.

Это можно объяснить только тем, что содержание фруктозы является или продуктом гидролиза тех звеньев хитиновой цепи хитин-глюканового и хитозан-глюканового комплексов, которые связаны с пептидными мостиками, или же фруктозное звено входит в состав этих боковых мостиковых цепочек. Содержание мостиковых цепочек в ХзГК значительно больше, чем в ХГК, поскольку при деацетилировании ХГК в 50% растворе гидроокиси натрия одновременно протекают также процессы обрыва хитозановых и глюкановых цепей в виде растворимых в реакционной смеси олигосахаридов, а нерастворимость пептидогликановых фрагментов приводит, естественно, к тому, что выделяемый из реакционной смеси ХзГК представляет собой, как показано в работах 6, 7, в основном, нерастворимый в щелочной среде пептидогликан:

Спектры ¹Н ЯМР гидролизатов не противоречат выводам о присутствии в продуктах гидролиза ХГК 12N соляной кислотой хлоргидрата Д-глюкозамина, глюкозы и фруктозы. Так, сигналы протонов водорода -СН₂ОН и -СН(ОН)- групп глюкозы и фруктозы должны проявляться в области 3.3-3.6 и 3.4-3.85 м.д., соответственно, но вследствие наложения они проявляются в виде неразрешимого мультиплета в области 3.3-3.75 м.д., а сигналы протонов водорода при первом углеродном атоме глюкозы проявляются в виде дублетов в области 4.52 м.д. и 5.09 м.д., что соответствует присутствию обеих таутомерных форм глюкозы, альдегидной и циклической полуацетальной. В спектре присутствуют также сигналы протонов водорода ацетильных групп водорастворимых хитоолигосахаридов в области 2.2 м.д. в виде неразрешимого мультиплета, который со временем исчезает. В спектре ЯМР ¹Н выявлены также сигналы небольшой интенсивности в области 5.38 и 5.60 м.д., относящиеся, вероятно, к фрагментам пептидной цепочки.

Таким образом, гидролиз хитин-глюканового и хитозан-глюканового комплексов в концентрированных серной и соляной кислотах приводит не только к деацетилированию хитиновых звеньев и разрыву гликозидных связей, но и дезаминированию, о чем свидетельствует обнаружение в продуктах гидролиза не только N-ацетил-Д-глюкозамина и Д-глюкозамина, но и аммиака, глюкозы и фруктозы. Количество фруктозы, образующейся при гидролизе ХзГК, значительно выше, чем при гидролизе ХГК, что связано, вероятно, с наличием в ХзГК большего числа фрагментов хитиновой цепи, связанных с боковыми мостиковыми цепочками.

Экспериментальная часть

В работе использовали биомассу мицелиального гриба A. niger производственных штаммов Р1 и Р2, выращенного поверхностным способом по методике, данной в работе 8. ХГК выделяли по методике, данной в работе 10.

Хитозан-глюкановый комплекс (ХзГК) получали деацетилированием ХГК в 50% растворе гидроокиси натрия в среде аргона при температуре 90-95 С. Выход 22.2%.

Гидролиз ХГК и ХзГК концентрированной соляной кислотой проводили при соотношении ХГК (или ХзГК) : 12N НСI = 1 : 20 и температуре 801 С в течение 1 часа с последующим удалением соляной кислоты в токе воздуха или под вакуумом.

Гидролиз ХзГК 55% серной кислотой проводили при соотношении ХзГК : 55% H₂SO₄ = 1 : 20 при комнатной температуре в течение 21 суток, по прошествии 1, 2, 3, 7, 9 и 21 суток определяли кислотность гидролизата титрованием 1N NaOH.

Присутствие NH₄⁺ -ионов определяли по стандартной методике качественного анализа на NH₄⁺ -ионы.

Анализ продуктов гидролиза ХГК и ХзГК 12N соляной кислотой проводили методом ТСХ на силикагельсодержащих пластинках “Silufol” в следующих системах растворителей:

· бутанол-уксусная кислота-вода (9:6:1). R_f продуктов гидролиза ХГК: 0.44, 0.57. R_f продуктов гидролиза ХзГК: 0.44, 0.57, 0.71. R_f свидетелей: 0.45 (Д-глюкозамин гидрохлорид), 0.58 (глюкоза), 0.71 (фруктоза);

· бутанол-уксусная кислота-вода (4:5:1). R_f продуктов гидролиза ХГК: 0.33, 0.94, 0.95. R_f продуктов гидролиза ХзГК: 0.32, 0.94, 0.95. R_f свидетелей: 0.34 (Д-глюкозамин хлоргидрат), 0.92 (глюкоза), 0.95 (фруктоза);

· пропанол-этилацетат-вода (7:2:2). R_f продуктов гидролиза ХГК: 0.63, 0.70, 0.83. R_f продуктов гидролиза ХзГК: 0.62, 0.67, 0.85. R_f свидетелей: 0.65 (Д-глюкозамин хлоргидрат), 0.78 (глюкоза), 0.84 (фруктоза);

· пропанол-пиридин-вода (10:3:3). R_f продуктов гидролиза ХГК: 0.59, 0.78. R_f продуктов гидролиза ХзГК: 0.61, 0.77. R_f свидетелей: 0.61 (глюкоза), 0.77 (фруктоза).

Проявление полученных хроматограмм осуществляли анилинфталатным проявителем.

Присутствие фруктозы в гидролизатах ХГК и ХзГК подтверждено также качественной реакцией Селиванова на кетогексозы 11.

Спектры ЯМР ¹Н снимали на спектрометре ЯМР Tesla 567 A высокого разрешения с Фурье-преобразователем и с рабочей частотой 100 Мгц (растворители: соляная кислота + дейтеровода и соляная кислота + дейтероацетон).

Выводы

Гидролиз хитин-глюканового и хитозан-глюкановых комплексов, выделенных из биомассы гриба Aspergillus niger, 12N соляной и 55% серной кислотами приводит к образованию N-ацетил-Д-глюкозамина, Д-глюкозамина, аммиака, глюкозы и фруктозы. Количество фруктозы, образующейся при гидролизе хитозан-глюканового комплекса, значительно выше, чем при гидролизе хитин-глюканового комплекса, что связано, вероятно, с наличием в хитозан-глюкановом комплексе большего количества хитиновых фрагментов, соединённых с мостиковыми пептидными цепочками.

Литература

[1] Максимов В.И., Родоман В.Е. Новые достижения в исследовании хитина и хитозана. Материалы Шестой Международной конференции. М.: Изд-во ВНИРО. 2001. С.208-212.

[2] S.A. Shaikh, M.V. Deshpande. World J. Microbiol. & Biotech. 1993. V.9. P.468-475.

[3] Усов А.И. Успехи химии. 1993. Т.62. Вып.1. С.1119-1144.

[4] S.A. Barker, A.B. Foster, M. Stacey, J.M. Webber. J.Chem.Soc. 1958. P.2218-2227.

[5] K.L. Chang, J. Lee, W.R. Fu. J. of Food and Drug Analysis. 2000. V.8. No.2. P.75-83.

[6] J.H. Sietsma, J.G.H. Wessels. J. of General Microbiology. 1979. V.114. P.99-108.

[7] Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М.: Наука. 1983. 248с.

[8] Шабрукова Н.В., Гамаюрова В.С. Новые достижения в исследовании хитина и хитозана. Материалы Шестой Международной конференции. М.: Изд-во ВНИРО. 2001. С.333-335.

[9] Шабрукова Н.В., Зябликова Т.А., Зайнетдинова Д.Р., Халитов Ф.Г., Гамаюрова В.С. Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2001. № 4. С.1.

[10] Гамаюрова В.С., Котляр М.Н., Шабрукова Н.В., Халитов Ф.Г. Биотехнология. 1997. №6. С.30-33.

[11] Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М.: Просвещение. 1982. 312 с.

Размещено на Allbest.ru