Изучение влияния биологических воздействий на характер структурных изменений целлюлозы методом ЯМР релаксации

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

В последние годы большое значение уделяется разработке новых средств защиты растений, а так же интенсификации производства дрожжей и другой продукции микробиологического назначения, Эта актуальная проблема усугубляется еще и недостаточностью пищевого и ограниченностью энергетического сырья для постоянно возрастающего населения нашей планеты.

Очевидно, что решение этих задач должно быть связано с расширением исследований в области гидролиза целлюлозы и, прежде всего, с использованием самых современных методов анализа вещества. В этой связи, внимание исследователей привлекают новые методы ферментативного гидролиза целлюлозы с целью получения глюкозы, спирта, кормовых продуктов, обогащенных витаминами и белками и т.п. Однако, до сих пор в понимании меха-низма целлюлолитического разложения целлюлозы нет полной ясности. Прежде всего, следует отметить отсутствие единого мнения исследователей о том, какую роль в ходе гидролиза играют различные компоненты ферментативного комплекса, а, во-вторых, какие изменения в надмолекулярной и химической структуре целлюлозы происходят на разной стадии указанного микробиологического воздействия. Вторая часть задачи вплоть до настоящего времени не нашла своего разрешения в рамках традиционных методов физико-химического анализа по причинам их сравнительно низкой эффективности.

Эта проблема представляет интерес и с точки зрения защиты целлюлозных материалов, в первую очередь, тканей, бумаги и картона, от разрушающего действия ферментов, продуцируемых грибами, насекомыми, микроорганизмами. В особенности это относится к музеям, книгохранилищам, архивам, картинным галереям и библиотекам.

С другой стороны, исследования кинетики и динамики ферментативной деструкции целлюлозы открывают большие перспективы в познании структурной организации и свойств самой целлюлозы а так же в понимании характера взаимодействия ее волокон с водой, поскольку обычный гидролиз растительных полисахаридов всегда происходит в водной среде.

В настоящем исследовании целлюлоза хлопкового волокна подвергалась действию как целой нефракционированной ферментной системой, так и отдельной фракцией эндо-1,4-глюканазы, выделенных из гриба Geotrichum candidum Link., а также эндо-1,4-глюканазой, содержащейся в ферментном препарате фирмы Rapidas, в котором отсутствует целлобиогидролаза С1-фермента. Анализировалась также микрокристаллическая целлюлоза фирмы Chemapol и длинноволокнистый хлопок, обработанный последовательно этиловым спиртом и серным эфиром, путем выдерживания его в растворителях в течение 24 часов при комнатной температуре. Изучались также образцы хлопка. Для этого 10 г хлопка, предварительно обработанного этиловым спиртом, а затем диэтиловым эфиром, выдерживали в 300 мл раствора 8Н мочевины при комнатной температуре в течение 30 часов, 4 раза при этом меняя раствор мочевины. После обработки мочевиной, хлопок тщательно промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе.

Аналогичным способом мочевиной был обработан хлопок, предварительно подвергнутый частичному ферментативному гидролизу. Сахара, экстрагируемые из хлопка мочевиной, определялись сернофенольным методом.

Для обработки различных образцов хлопкового волокна (0.5 г) был использован ферментный препарат, полученный из фильтрата культуральной жидкости гриба Geotrichum candidum Link. Осаждением тремя объёмами этилового спирта. Для обработки хлопкового волокна (предварительно экстрагированного спиртом и эфиром и набухшего в растворе мочевины) применяли целлюлозу французской фирмы «Rapidas». При этом, хлопковое волокно (0,5 г) инкубировали в 20 мл раствора, содержащего 0.05 М ацетатный буфер, рН = 4.7, и 5 мг ферментного препарата, в течение 15 часов при 40С. После обработки ферментами, хлопок промывали на стеклянном фильтре 300 мл горячей (95-100С) дистиллированной водой и высушивали на воздухе.

Для обработки хлопка использовали также специально полученную для этих целей ферментную фракцию, содержащую эндо-1-b-глюканазу. Для получения фракции эндо-1,4-глюканазы ферментный препарат G. Candidum очищали на сефадексе 6-50; фракции, содержащие эндо-b-глюканазу, наносили на колонку с ДЭАЭ-сефадексом А-50, уравновешенную ацетатным буфером 0.1 М, рН 3.5. Фракцию эндоглюконаз, полученную с колонки при промывании ее градиентом от 0 до 0.5 М раствора NaCl в том же буфере, снова очищали методами гельфильтрации на колонке с биогелем Р-150. Последним этапом очистки была ионобменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-сефадесом А-50, в ацетатном буфере 0.1 М, рН 4.7. Полученная фракция эндо-1,4-глюконазы, не сорбировавшаяся при этих условиях, содержала, по-видимому, очень небольшое количество целлобиогидролазы, так как была в отличие от исходного препарата почти и не активна при действии на хлопковое волокно. В опыт для обработки хлопкового волокна было взято 0.7 единиц эндо-1,4-глюканазы. Для каждого объекта исследований из необработанного и обработанного тем или иным способом хлопка, готовили образцы с фиксированным влагосодержанием (w)в диапазоне от 2 до 70% (% воды от массы сухого хлопкового волокна). Образцы хлопка с сорбированной влагой выдерживали в герметических камерах в течение двух суток для того, чтобы произошло равномерное влагораспределение по всему объему целлюлозы.

С целью исследования структурных изменений в хлопковом волокне, происходящих при действии на него ферментов, был использован хлопок, предварительно обработанный спиртом и диэтиловым эфиром.

Измерения ЯМР 1Н релаксационных параметров целлюлозы были выполнены на релаксометре Spin Track [1] с рабочей частотой 20 МГц. Регистрировать спад свободной индукции (ССИ) удавалось с периодом нечувствительности приемного тракта менее 8 мкс, что оказалось очень важным для ана-лиза сигналов от полисахаридов с временами спин-спиновой релаксации, не превышающими 20 мкс.

Спады ССИ измерялись как отклики спиновой системы на одиночный 90o импульс длительностью 1.8 мкс. Поскольку спады ССИ использовались и для анализа формы временного спада, и для преобразования в спектральную линию, измерения проводились на частоте, отличной от резонансной на 100 кГц, с целью минимизации помех. Время регистрации ССИ составляло 2 мс с шагом выборки отсчетов квадратурного сигнала в 0.2 мкс, количество накоплений составляло 100, время повторения сканов при накоплении сигнала было равно 1000 мс.

Времена спин-спиновой релаксации определялись при аппроксимации спадов поперечной релаксации экспоненциальной функцией. Для образцов целлюлозы влажностью до 5% снимались спады ССИ и Спинового Эха, а для более влажных образцов (>5%) применялась последовательность Карра-Парселла-Мейбума-Гилла (CPMG) [2]. Длительности 90o и 180o импульсов составляли 1.8 и 3.6 мкс соответственно.

Результаты и их обсуждение.

При определении активности целлюлозной системы ферментов, гидролизующих целлюлозу до растворимых сахаров, часто применяется хлопковое волокно, предварительно обработанное этиловым спиртом и серным эфиром. Поэтому было исследовано состояние воды в исходном хлопковом волокне, обработанным указанными растворителями, путём измерения времен спин-спиновой релаксации Т2, связанной с молекулярной подвижностью сорбирован-ной воды, в зависимости от влагосодержания волокон w. целлюлоза гидролиз индукция спиновый

Было также изучено изменение Т2 от w для образца хлопкового волокна, обработанного растворителями, а затем раствором мочевины, которая разрывает водородные связи и вызы-вает набухание целлюлозы. По современным представлениям ферментативный гидролиз высокоупорядоченной целлюлозы в природе происходит при обязательном участии двух типов ферментов: 1,4-в-D-глюкан-глюканогидролаза - эндоглюканаза; 1,4-в-D-глюкан-целлобиогид-ролаза - целлобиогидролаза (С1-фермент) [3] Первый гидролизует глюкозидные связи в целлюлозе неупорядоченным способом, второй, отщепляет целлобиозные остатки с нереду-цирующего конца молекулы субстрата. Однако, ни один из названных типов ферментов не производит глубокого гидролиза такой целлюлозы без участия другого фермента. Причина этого явления, вероятно, кроется в надмолекулярной структуре целлюлозы и остается до конца не выясненной вследствие того, что не изучен процесс взаимодействия этих ферментов с высокоупорядоченной кристаллической целлюлозой.

Обработка мочевиной обычно приводит к разрыву водородных связей в полимерах, в том числе и в целлюлозе, при этом одновременно происходит вымачивание из него восстанавливающих веществ (таблица).

Таблица 1. Количество восстанавливающихся сахаров, экстрагируемых из хлопка 8М раствором мочевины

Рис. 1. Зависимость времени спин-спиновой релаксации Т2 от влагосодержания w образцов хлопковой целлюлозы: 1 - хлопок исходный; 2 - хлопок, обработанный спиртов и эфиром; 3 - хлопок, обработанный спиртом, эфиром и мочевиной

На рис. 1 представлена зависимость Т2 от влагосодержания (w) для образцов хлопка, обработанного спиртом и эфиром (кривая 2), и затем, мочевиной (кривая 3), а также хлопка исходного, ни чем предварительно не обработанного (кривая 1). Для всех кривых характерно увеличение Т2 с ростом влагосодержания, что свидетельствует об увеличении молекулярной подвижности сорбированной воды, которая при низких значениях влагосодержания заполняет микропоры и при более высоких мезопоры и пустоты в структуре сорбента.

В областях пониженных абсолютных влагосодержаний образцов, менее 12%, наблюдается интенсивный спад поперечной релаксации, свидетельствующий о доминирующем вкладе в релаксацию вращательных степеней свободы молекул адсорбата, а также об усилении роли протонного обмена между молекулами воды и целлюлозы. Такая ситуация обычно наблюдается в области полимолекулярной, и, особенно, при мономолекулярной адсорбции.

Для кривой 2 (рис. 1) характерно более медленное увеличение Т2 с ростом влагосо-держания w, чем для кривой 1. Это свидетельствует о том, что после обработки хлопкового волокна спиртом и эфиром происходит уменьшение трансляционной подвижности воды, связанное с тем, что из его пор удаляются сопутствующие компоненты, входящие в состав хлопкового волокна, затрудняющие процесс сорбции воды, и препятствующие ферментативному гидролизу. Дополнительная обработка образца мочевиной усиливает описанный выше эффект (кривая 3). Целлюлозные микрофибриллы, на поверхности которых были разорваны доступные реагенту межцепочечные водородные связи, адсорбируют значительно большее количество воды. Судя по кривой 3 на рис. 1, можно сказать, что на активированных таким образом фибриллах хлопкового волокна существенно возросло содержание воды связаной с помощью сил моно- и полимолекулярной адсорбции: 22% влаги в обработанных образцах против 12-13% в исходном хлопке (кривая 1, рис. 1).

На рис. 2 показаны зависимости времени поперечной релаксации Т2 от влагосодержания w для хлопковых целлюлоз, подвергнутых обработке ферментами после предварительного воздействия на них эфиром, спиртом и в отдельных случаях мочевиной. Обработку проводили небольшими концентрациями ферментов в стационарных условиях, поэтому, гидролиз волокна мог пройти только в небольшой степени поэтому хлопок не потерял своей волокнистой струк-туры.

Рис. 2. Зависимость времени спин-спиновой релаксации Т2 от влагосодержания w образцов: 1 - хлопок исходный; 2 - хлопок, обработанный спиртом, эфиром и целлюлазой; 3 - хлопок, обработанный спиртом, эфиром, фракцией эндо-1,4-в-глюконаз; 4 - хлопок, обработанный спиртом, эфиром, мочевиной и препаратом фирмы Rapidas; 5 - хлопковая целлюлоза, обработанная спиртом, эфиром, целлюлазой G. Cadidum с последующей обработкой мочевиной

Кривая 2 на рис. 2 была получена для образца хлопкового волокна, обработанного спиртом, эфиром и затем целлюлотическим ферментным препаратом G. Candidum, который содер-жит как эндо-1,4-в-глюканазу, так и С1-фермент.

Кривая 5 отображает зависимость Т2 = f(w) для такого же образца хлопка, но допол-нительно обработанного мочевиной (без обработки мочевиной характер зависимости Т2 пред-ставлен кривой 2).

Кривая 4 получена для хлопка, обработанного спиртом, эфиром, мочевиной, а затем препаратом целлюлазы французской фирмы Rapidas. Известно, что этот препарат имеет высокую активность эндо-1,4-в-глюканаз, но, по-видимому, не содержит целлобиогидролазы (С1) [3].

Кривая 3 представляет зависимость Т2 = f(w) для хлопкового волокна, обработанного спиртом, эфиром, а затем фракцией препарата G. Candidum и в значительной степени очищен-ным от С1-фермента. Под действием эндо-1,4-в-глюканазы за 15 часов действия фермента произошел гидролиз хлопкового волокна на 1.8% (определяли по количеству восстанавливающих сахаров в реакционной смеси).

Обращает на себя внимание тот факт, что кривые рис. 2, полученные для образцов хлопка, обработанного ферментами, резко отличаются от кривых рис. 1, полученных для исходного хлопка и образцов, претерпевших только обработку растворителями и мочевиной. Первые показывают сравнительно малые значения спин-спиновой релаксации Т2 даже при больших влагосодержаниях (25-50% влажности). Это свидетельствует о росте активной удельной поверхности хлопкового волокна и о появлении большого количества новых активных центров сорбции - гидроксильных и карбонильных групп, появившихся в результате расщепления ферментами макромолекул целлюлозы. Все это приводит к разрыву меж- и внутримолекулярных водородных связей в микрофибриллах целлюлозы, следовательно, к увеличению общего количества относительно свободных протонсодержащих поверхностных активных центров ее фрагментов, что и находит отражение в изменении параметров ЯМР релаксации [4, 5]. Результатом этого процесса является ограничение молекулярной подвижности сорбата даже при относительно высоком содержании влаги в образцах.

Ввиду того, что целлюлоза, обработанная ферментом, представляет собой частично гид-ролизованную целлюлозу, в которой, как можно предполагать, прежде всего разрушились легкодоступные аморфные участки, нами были исследованы гидрофильные свойства микро-кристаллической целлюлозы, полученной кислотным гидролизом [3] Оказалось, что зависи-мость Т2 от w для микрокристаллической целлюлозы, полученной в условиях, когда прежде всего гидролизуется ее аморфная область, очень близка к кривой 2 на рис. 2. Известно, что микрокристаллическая целлюлоза по консистенции порошкообразное вещество и представляет собой разрушенные волокна, состоящие из агрегатов монокристаллов с большой удельной поверхностью вследствие их малых размеров (нанодиапазона) и обладающих способ-ностью активно связывать воду [5, 6].

Гидролиз хлопкового волокна под действием ферментов по описанной методике не превысил 2%, хлопковое волокно после ферментативной обработки не только не потеряло своей волокнистой структуры, но в значительной степени сохранило свою прочность, вследст-вие этого способность хлопкового волокна после ферментативной обработки связывать воду почти в таком же количестве, как микрокристаллическая целлюлоза, должно свидетельст-вовать либо об особых свойствах ферментов, способствующих появлению большого числа центров сорбции на поверхности микрофибрилл целлюлозы, либо по особой структуре хлопкового волокна, нарушение поверхности которого при гидролизе открывает внутренние микропространства, недоступные прежде для проникновения в них влаги. Несмотря на то, что второе предположение в какой-то мере имеет место при действии ферментов на хлопковое волокно, тем не менее появление большого количества центров сорбции, мы склонны отно-сить за счет аморфизации поверхности микрофибрилл целлюлозы при их диспергировании, происходящей под действием ферментов. Эндо-1,4-в-глюканаза, взаимодействуя с субстратом, разрывает водородные связи между молекулами целлюлозы на значительном расстоянии от гидролизуемой связи. Освобождаемые гидроксильные группы на «разрыхленных» ферментом участках приобретают способность активно сорбировать воду. А вновь образованные концы молекул, в силу своей относительной близости друг к другу, в процессе колебательно-вращательных движений, возможно, вступают между собой во взаимодействие, значительно изменяющее надмолекулярную структуру образцов [6, 7].

Анализируя представленные зависимости, можно прийти к выводу, что результатом такой надмолекулярной перестройки является сетчатая микропористая структура сорбента, в микропространствах которой трансляционная молекулярная связь воды значительно сокращена, что по-видимому, и нашло отражение в укорочении значений Т2 при высокой влажности образцов.

Необходимо отметить, что микрокристаллическая целлюлоза так же имеет области с неупорядоченной поверхностью. Возможно, это обстоятельство в значительной степени определяет ее высокую влагоёмкость.

Интересным представляется то, что хлопковое волокно, обработанное спиртом и эфи-ром, а затем фракцией, содержащей эндо-1,4-в-глюканазу фирмы Rapidas, в которой также практически отсутствует целлобиогидролаза (рис. 2, кривая 4), имело зависимость времени спин-спиновой релаксации Т2 от влагосодержания (w) аналогичную той, которая свойственна образцам, полученным при обработке не фракционированной ферментной системой G. Cadidum (рис. 2, кривые 2 и 6). Таким образом, те резкие изменения в надмолекулярной структуре целлюлозы, которые обнаруживаются методом ЯМР и описаны выше, производят один тип ферментов целлюлозной системы эндо-1,4-в-глюканазы. Именно этот фермент (а не С1-фермент) ответственен за увеличение влагосодержания и за снижение упорядоченности целлюлозы в процессе ее ферментного гидролиза.

Возможно, С1-фермент в ферментной системе G. Cadidum действительно являясь целло-биогидролазой, удаляет с поверхности фибрилл ставшие доступным для него после действия эндо-1,4-в-глюканаз олигосахариды, гидролизуя их и переводя их в раствор в виде дисаха-рида.

С1-фермент, таким образом, обнажая поверхность целлюлозных фибрилл от коротких целлюлозных цепей, дает возможность эндо-1,4-в-глюканазе осуществлять новую атаку на освобождённых участках, тем самым непрерывно способствуя своим участием углублению процесса гидролиза.

Выводы:

1. Впервые показана возможность применения импульсного метода ЯМР для анализа процессов ферментативного гидролиза целлюлозы.

2. Показано, что при обработке целлюлозы спиртом и эфиром и особенно спиртом, эфиром и затем мочевиной, поверхность становится более способной к энзиматическому гидролизу.

3. Действие эндо-1,4-в-глюканазы на целлюлозу вызывает резкое изменение в её надмолеку-лярной структуре, что выражается в сокращении трансляционной молекулярной подвиж-ности воды.

Литература

1. www.nmr-design.com

2. Чижик В.И. Ядерная магнитная релаксация. С.-Петербург: Изд-во СПГУ. 2004. 385с.

3. Грунин Ю.Б. Анализ системы целлюлоза-вода модифицированными методами протонного магнитного резонанс. Докторская диссертация. Рига. 1989.

4. Грунин Ю.Б., Грунин Л.Ю., Таланцев В.И., Никольская Е.А., Масас Д.С. Надмолекулярные перестройки в целлюлозе в ходе гидратации. Биофзика. 2015. Т.60. Вып.1. С.53-64.

5. L.Yu. Grunin, Yu.B. Grunin, V.I. Talantsev, E.A. Nikolskaya, D.S. Masas. Features of the Structural Organization and Sorption Properties of Cellulose. Polymer Science. Ser. A. 2015. Vol.57. No.1. P.43-51.

6. Y.B. Grunin, L.Y. Grunin, V.I. Talancev, E.A. Nikolskaya. Microstructure of Cellulose: NMR Relaxation Study. Polymer Science. Series A. 2012. Vol.54. №3. С.201-208.

7. Смотрина Т.М., Сергеев Р.В., Новиков П.С., Масленникова С.Н., Большакова Е.Е. Релаксационные и гидрофильные свойства целлюлозы осины и ели для бумажного производства. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.32. № 10. С.76-80.

Размещено на Allbest.ru