Реакции папаина с электрогенерированными галогенами и их аналитическое применение

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реакции папаина с электрогенерированными галогенами и их аналитическое применение

Зиятдинова Гузель Камилевна

Григорьева Лидия Владимировна

Будников Герман Константинович

Кафедра аналитической химии

Химический институт им. А.М. Бутлерова

Аннотация

Найдены стехиометрические коэффициенты реакций папаина с электрогенерированными галогенами, которые составили 1:5 и 1:3 для хлора и брома, соответственно. Разработан способ определения папаина методом кулонометрического титрования электрогенерированными хлором и бромом. Обсуждено возможное участие серосодержащих центров молекулы фермента в реакциях с галогенами. Показана возможность определения микрограммовых количеств папина в модельных растворах с величиной относительного стандартного отклонения 0.03-0.08.

Ключевые слова: гальваностатическая кулонометрия, электрогенерированные галогены, папаин, цистеиновые протеиназы.

Введение

Папаин является одним из протеолитических ферментов - цистеиновых протеиназ, присутствующих в латексе дынного дерева (Carica papaya L.). Название "папаин" было впервые предложено в конце XIX века А. Вюрцем и Е. Бошутом и используется до настоящего времени для обозначения препаратов латекса.

Этот фермент содержится во всех частях растения за исключением корней. Неочищенный или частично очищенный папаин в прошлом был объектом многочисленных исследований. Однако, позднее было установлено, что сухой латекс дынного дерева, кроме папаина, содержит целый набор цистеиновых протеиназ, которые разделяются на три главные группы, собственно папаин, химопапаины А и В и пептидазы А и В. В последние годы папаин и химопапаины были обнаружены также в латексе из вегетативных органов (листьев и черешков) дынного дерева. В 1937 г. Болз и сотр. впервые получили кристаллический папаин, а в 1941 г. Янсен и Болз - кристаллический химопапаин [1].

Три главные группы ферментов латекса папайи различаются по физико-химическим свойствам. Так, они характеризуются разными значениями изоэлектрических точек, которые находятся в зоне рН 9.5, 10.1-10.6 и 11.1 для папаина, химопапаинов и пептидаз, соответственно. Различаются эти группы ферментов и по содержанию титруемых свободных SH-групп. Ферменты первой и третьей групп содержат 1 SH-группу на молекулу белка, ферменты второй группы - 2 [2].

Папаин является наиболее изученным ферментом, хотя на его долю приходится только около 5% общего содержания растворимого белка латекса дынного дерева. Молекулярная масса фермента, определенная Э. Смитом и др. на основании скорости седиментации и диффузии, равна 20.7 кДа. Молекула папаина состоит из одной полипептидной цепи и содержит 212 аминокислотных остатков. Характерной особенностью аминокислотного сос-тава фермента является отсутствие остатков метионина [3].

Папаин относительно устойчив в нейтральной и слабощелочной среде, но быстро и необратимо теряет активность в области кислых значений рН. По сравнению с другими протеиназами растительного происхождения (например бромелаином и фицином) папаин проявляет значительную устойчивость к действию повышенных температур. Фермент стабилен в лиофилизованном неактивированном состоянии. Потеря активности в водных растворах происходит медленно, но зависит от температуры хранения. При инкубации в присутствии активаторов папаин теряет активность в результате автолиза. Впервые процесс автолиза папаина наблюдали при ионнообменной хроматографии. Медленное протекание процесса автолиза является причиной того, что даже наиболее активные препараты фермента оказываются загрязненными низкомолекулярными продуктами [4].

Молекула папаина обладает высокой устойчивостью к денатурирующим воздействиям. Так, оптическое вращение молекулы папаина существенно не меняется в 6-8 М растворе мочевины или в 70% метиловом спирте.

Кристаллический папаин обладает, как правило, низкой активностью в отсутствие активаторов. В роли активаторов могут выступать различные низкомолекулярные тиолы, цианиды и ряд других веществ, обладающих свойствами восстановителей, например цистеин, глутатион, тиогликолевая кислота, тиосульфат и боргидрид натрия.

Для получения максимальной активности папаина необходимо одновременное присутствие восстановителя и веществ, способных связывать ионы металлов. Например, используют смесь цистеина (0.005 М) с этилентетрауксусной кислотой (0.002 М) или с версеном (0.001 М). Эта смесь может быть успешно заменена 2,3-меркаптопропанолом, соединением, которое способно одновременно связывать металлы и действовать как восстановитель. Максимальная активность папаина в присутствии активаторов достигается через 5-10 мин [5].

Природа активаторов, а также отношение папаина к окислительным агентам и веществам, специфически блокирующим сульфгидрильные группы белков, позволили давно сделать вывод, что папаин относится к классу цистеиновых протеиназ. Содержание тиоловых групп у неактивного папаина менее 0.5 моля на моль белка, и это же количество определяется при различных способах денатурации фермента. В то же время в активированном папаине присутствует до 1 моля SH-групп на моль белка. Более того, существует корреляция между содержанием тиоловых групп в молекуле папаина и его удельной активностью [6].

Исследования механизма процесса активации и природы неактивной формы папаина позволили И. Клейну и Дж. Киршу получить убедительные доказательства того, что основной компонент неактивного папаина представляет собой смешанный дисульфид белок - цистеин [7].

Папаин используется в пищевой и легкой промышленности для обработки кож, умягчения мяса и осветления напитков [8]. В последние десятилетия папаин нашел широкое применение в составе лекарственных и косметических средств как основной компонент, влияющий на активность ферментов кожи, регулируя ряд биохимических процессов в ней. Косметический эффект папаина заключается в том, что он удаляет отмершие клетки, выравнивает рельеф кожи и стимулирует обмен клеток эпидермиса. Поэтому исследование папаина и разработка способов его определения представляет актуальную задачу.

Цель работы - оценить возможности гальваностатической кулонометрии с электро-генерированными галогенами для количественного определения папаина.

Результаты и их обсуждение

Кулонометрическое титрование стандартных растворов электрогенерированными хлором и бромом папаина показало, что реакции этих титрантов протекает быстро и количественно. Результаты титрования позволили установить стехиометрические коэффициенты реакций, которые составили 1:5, 1:3 для хлора и брома, соответственно. Иод не взаимодействует с папаином, вероятно, вследствие стерических препятствий и его малой реакционной способности в этом процессе.

Как уже отмечалось выше, папаин является серосодержащим ферментом класса протеиназ. В структуре папаина присутствуют семь остатков цистеина (Cys). Шесть из семи содержащихся в молекуле остатков Cys участвуют в образовании трех дисульфидных мостиков, которые соединяют остатки полуцистина в положениях 22-63, 56-93 и 153-200 (заштрихованные связи на рисунке). Единственная сульфгидрильная группа принадлежит остатку цистеина, расположенному в положении 25. Этот остаток является частью каталитического центра фермента [24].

Молекула фермента имеет близкую к сферической форму и состоит из двух доменов, обозначенных как L- и R-домены. Домены разделены глубоким "желобом", на поверхности которого находится активный центр фермента. Оба домена содержат практически одинаковое число аминокислотных остатков. Положение одного домена относительно другого поддерживается с помощью трех отрезков полипептидных "хребтов", пересекающих основание "желоба", и множеством водородных связей, а также электростатическими и гидрофобными взаимодействиями боковых групп аминокислотных остатков полипептидной цепи. Центральная область R-домена представляет собой гидрофобное ядро [26, 27].

папаин электрогенерированный галоген

Рисунок. Домены в структуре протеолитического фермента папайи - папаина

Прерывистыми линиями намечено направление впадины между двумя доменами, в которой связывается субстрат и размещен каталитический центр. Дисульфидные связи заштрихованы.

Таблица. Результаты кулонометрического определения папаина в модельных растворах (n = 5, Р = 0.95)

Исходя из результатов кулонометрического титрования, можно предположить, что в реакцию с электрогенерированными хлором и бромом вступает тиольная группа каталитического центра фермента, расположенного на поверхности "желоба" между двумя доменами. Она окисляется до сульфоновой группы с участием 6 электронов. Электрогенерированный хлор взаимодействует и с дисульфидным фрагментом в положении 22-63. При этом происходит окисление дисульфида до сульфоксида, а электрогенерированный бром не реагирует вследствие стерических затруднений. Два других дисульфидных мостика не вступают в реакцию с электрогенерированными галогенами, поскольку один находится в гидрофобной области молекулы папаина (R-домена), а второй - на значительном расстоянии от активного центра в перпендикулярной плоскости.

Результаты кулонометрического определения папаина в модельных растворах представлены в таблице.

Экспериментальная часть

Электрогенерацию галогенов осуществляли на потенциостате П-5827М при постоянной силе тока 5.0 мА из водных 0.2 М KBr в 0.1 М Н₂SO₄ и из 0.1 М раствора KI в тартратном буферном растворе с рН 3.56. Конечную точку титрования устанавливали амперометрически с двумя поляризованными платиновыми электродами (Е=300 мВ). Рабочим электродом служила гладкая плати-новая пластинка площадью 1 см², вспомогательным электродом - платиновая спираль, отделенная полупроницаемой перегородкой от анодного пространства ячейки.

Кулонометрическое определение проводили следующим образом. В ячейку объемом 50.0 мл вводили 20.0 мл фонового раствора, опускали электроды и включали генераторную цепь. По достижении определенного значения индикаторного тока в ячейку вносили аликвоту исследуемого раствора (10-60 мкл) и одновременно включали секундомер. Конечную точку титрования фиксировали по достижению первоначального значения индикаторного тока. При этом выключали секундомер и отключали генераторную цепь.

В работе использовали лиофилизированный папаин от Ferak (Berlin, Germany). Стандартные растворы готовили по точной навеске (около 1.0 г), которую растворяли в 50 мл дистиллированной воды.

Выводы

Найдены стехиометрические коэффициенты реакций папаина с электрогенерированными галогенами, которые составили 1:5 и 1:3 для хлора и брома, соответственно. Электро-генерированный иод не взаимодействует с папаином в условиях гальваностатической кулонометрии. На основе полученных данных обсуждено участие серосодержащих центров молекулы фермента в реакциях с галогенами и разработан способ определения папаина.

Литература

1. Blocklehurst K., Baines B.S., Kierstan M.P.J. Papain and other constituents of Cartica papaya L. In: Topics on enzyme and fermentation biotechnology (Ed. by E. Wiseman, E. Horwood). Chichester: Ellis Horwood Ltd. 1981. Vol.5. P.262-335.

2. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука. 1971. 414с.

3. Glazer A.N., Smith E.L. Papain and other plant sulfhydryl proteolytic enzymes. In: The enzymes. Academic press. 1971. Vol.3. P.501-546.

4. Drenth J. Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas. 1980. Vol.99. No.6. P.185-190.

5. Polgar L., Csoma C. Characterization of active site of cysteine proteases. In: Molecular and cellular regulation of enzyme activity (Ed. by A. Barth, R.L. Schwen, H. Possin). Berlin:Verlag. 1986. P.1-10.

6. Beker E.N., Drenth J. The thiol proteases: structure and mechanism. In: Biological macromolecules and assemblies (Ed. By F.A. Iurnak, A. McPherson). N.Y.: J.Wiley&Sons. 1987. Vol.3. P.314-368.

7. Klein I.B., J.F. Kirsch. Biochem. Biophys. Res. Communs. 1969. Vol.34. No.5. P.575-581.

8. Кретович В.Л. Основы биохимии растений. 5 изд. М. 1971. 460с.

Размещено на Allbest.ru