О наличии полипептидной мостиковой связи в хитин-глюкановом комплексе

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Кафедра промышленной биотехнологии. Казанский государственный технологический институт. Ул. К. Маркса, 68. г. Казань 420015. Россия.

Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН. Ул. Арбузова, 8. г. Казань 420088. Россия.

О наличии полипептидной мостиковой связи в хитин-глюкановом комплексе

Шабрукова Наталья Васильевна,

Зябликова Татьяна Александровна,

Зайнетдинова Диана Равильевна,

Халитов Фарид Гусманович

и Гамаюрова Валентина Семеновна

Резюме

мицелиальный гриб растворимый хитозан

Тематическое направление: Природные полисахариды. Часть II.

Примечание: Предыдущее сообщение этой серии смотри в Бутлер.Сооб. 1999, № 1. 73. (код n2v1) Поступила в редакцию 26 сентября 2001 г. УДК 576.32/36;541.6

Исследования в области практического использования биомассы мицелиального гриба Aspergillus niger показали, что хитин-глюкановые комплексы, выделяемые из него, обладают высокими адсорбционными свойствами к ионам тяжелых металлов, являются хорошими энтеросорбентами и возможно использование их в качестве лечебной добавки к продуктам питания. Однако неизвестность природы связи между составными компонентами этого природного полимера препятствует как прикладным исследованиям в этой области, так и более широкому практическому использованию этих комплексов.

Целью работы является установление природы связи хитин-глюкан в хитин-глюкановом комплексе, выделенном из биомассы гриба Aspergillus niger, и возможности получения из него растворимого хитозана.

Комплексным анализом результатов, полученных спектральными методами (ИК, ЯМР 1Н и 13С спектроскоскопии), дезаминированием и элементным анализом производных хитин-глюканового комплекса доказано наличие в структуре хитин-глюканового комплекса ковалентно связанных пептидных цепочек, выполняющих связующую роль между его хитиновыми и глюкановыми цепями. Наличие пептидных цепочек в структуре хитин-глюканового комплекса дает ответ и на многие вопросы, связанные с его природой, в частности, объясняет более интенсивное, по сравнению с хитином, поглощение в области проявления амидных связей в его ИК спектрах и спектрах его производных и нерастворимость в слабых растворах органических кислот деацетилированных производных хитин-глюканового комплекса.

Ключевые слова: гриб Aspergillus niger, хитин-глюкановый комплекс, хитозан, хитозан-глюкановый комплекс, пептидные цепочеки.

Введение

Исследования в области практического использования биомассы мицелиального гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты, показали, что хитин-глюкановые комплексы, являющиеся структурными полисахаридами клеточных стенок этого гриба, обладают высокими адсорбционными свойствами к ионам тяжелых металлов (1-3), являются хорошими энтеросорбентами и возможно использование их в качестве лечебной добавки к продуктам питания [4]. Однако неизвестность природы связи между составными компонентами этого природного полимера создает препятствия как в прикладных исследованиях в этой области, так и в более масштабном практическом использовании этих комплексов.

1. Результаты и дискуссия

Наши попытки получить растворимые в растворах слабых органических кислот производные хитин-глюканового комплекса (ХГК) путем его дезацетилирования различными способами, известными из химии хитина: обработкой раствором гидроокиси натрия в присутствии боргидрида натрия при 90 С (соединение I), обработкой 40-50% растворами гидроокиси натрия в инертной атмосфере при температуре 95*5 С (соединения II и III) и т.д. - во всех случаях приводили к получению соединений, обладающих незначительной растворимостью в разбавленных органических кислотах. Такое поведение этих соединений не могло быть связано только с наличием в них глюканов.

I. Взаимодействие хитин-глюканового комплекса и его производных с азотистой кислотой.

Исследование этих соединений показало, что содержание азота в них уменьшилось по сравнению с ХГК в большей или меньшей мере в зависимости от способа его дезацетилирования, но при этом в этих образцах наблюдается высокое содержание азота первичных аминогрупп, определенное методом дезаминирования (табл. 1).

Табл. 1 Элементный анализ и анализ содержания азота первичных аминогрупп в полученных образцах

Взаимодействие аминогрупп хитозана с азотистой кислотой, которое происходит при использовании этого метода, протекает по иному механизму, чем первичных аминов, и ведет не только к выделению азота и воды, но и обрыву полимерной цепи и образованию 2,5-ангидроманнозы [7]. Но метод дезаминирования не может дать завышенных результатов по содержанию аминного азота при наличии в хитозановой компоненте хитозан-глюканового комплекса только ацетамидных и первичных аминных групп, поскольку обрыв цепи и образование 2,5-ангидроманнозы не влияют на количество выделившегося азота.

Сравнительный анализ ИК спектров этих соединений и исходного ХГК показал, что они практически идентичны, незначительно меняется лишь соотношение интенсивностей полос поглощения. Так, интенсивные полосы с максимумами 1560 см-1 (амид II) и 1660 см-1 (амид I), характерные для ХГК, присутствуют и в спектрах полученных соединений. В области 1300-1400 см-1 ИК спектров этих соединений проявляются полосы 1320 и 1380 см-1, соответствующие колебаниям С-Н и С-N связей амидных групп; в области проявления колебаний С-О связей 1100-1200 см-1 наблюдается широкая интенсивная полоса с максимумами 1080 и 1150 см-1, относящаяся к различным спиртовым и эфирным группировкам (рис. 1).

Однако по литературным данным [8] известно, что при переходе от хитина к хитозану наиболее сильные спектральные изменения наблюдаются в области 1550-1650 см-1; а именно, уменьшается интенсивность полос поглощения амид I и амид II и появляется дополнительная полоса в области ~1600 см-1, относящаяся к деформационным колебаниям N-Н связей. Поскольку в нашем случае в ИК спектрах полученных образцов этих изменений не наблюдается, а анализы показали высокое содержание азота первичных аминогрупп, было сделано предположение, что часть звеньев хитиновой цепи ХГК связана не с ацетамидными групппами, а с пептидными цепочками, через которые осуществляется связь с глюканами. В таком случае полученные соединения могут дать такую же картину ИК спектров, что и ХГК. А метод дезаминирования, примененный для определения содержания азота первичных аминогрупп в полученных соединениях показал ошибочные результаты вследствие того, что и a-аминогруппы пептидов, как известно [9], реагируют с азотистой кислотой с выделением азота при комнатной температуре, т.е. взаимодействие их в упрощенном виде протекает по приведенной схеме:

Рис. 1 ИК спектры соединений: 1 - ХГК; 2 - соединение II; 3 - соединение IV

Размещено на http: //www. allbest. ru/

В этом случае объяснимо и завышенное содержание азота первичных аминных групп в соединении III, поскольку при анализе этим методом некоторые a-аминокислоты и, соответственно, пептиды выделяют большее по сравнению со стехиометрическим количество газа.

Дополнительным подтверждением, что при анализе полученных соединений методом дезаминирования происходит взаимодействие азотистой кислоты не только с аминогруппами хитозановых звеньев, но и с пептидными цепочками, является наличие a-оксикислот в конечных продуктах реакции, которое определено качественной реакцией на них c использованием суспензии гидрата двуокиси марганца (6).

II. Спектральные исследования.

В то же время, в отличие от щелочного дезацетилирования ХГК при атмосферном давлении, которое по данным ИК спектроскопии не приводит к образованию в полученных образцах первичных аминных групп, взаимодействие активированного щелочью ХГК с оксидом пропилена в запаянной ампуле при 70 С в течение 30 часов, данное в части I, привело не только к присоединению оксида пропилена по гидроксильным группам хитиновой компоненты ХГК, но и к отщеплению ацетильных и пептидных групп от атома азота при углеродном атоме С-2 глюкопиранозных циклов и образовании первичных аминных групп хитозана. Свидетельством этого является значительное уменьшение (почти исчезновение) амидных полос в ИК спектре этого эфира и появление интенсивной полосы 1610 см-1, относящейся к деформационным колебаниям N-Н связей (рис. 1, соединение IV). Такой ход реакции и образование в конечном результате гидроксипропилоксипропилового эфира хитозана подтверждено также спектрами ЯМР данного соединения.

Так, в спектре ЯМР 13С этого соединения присутствуют сигналы, относящиеся к ядрам атомов углерода глюкопиранозных колец хитозана: 102.2 м.д. (С-1), 61.6 м.д. (С-2), 72.2 м.д. (С-3), 69.4 м.д. (С-4), 78.2 м.д. (С-5), 56.0 м.д. (С-6); присоединенных оксипропильных групп: 16.7 и 18.8 м.д. (СН3), 66.8 и 67.1 м.д. (СН), 74.0 и 75.1 м.д. (ОСН2) и на уровне шумов - карбонильной группы в области 174 м.д., и отсутствуют сигналы ядер углерода пептидных групп и глюканов. Эти результаты тем не менее это не отрицают наличия пептидных цепочек между хитиновой и глюкановой компонентами ХГК, поскольку разрыв пептидных мостиков или их полный отрыв от хитиновых звеньев могут привести к полному удалению глюканов, присутствующих в ХГК. К тому же в спектре ЯМР 1Н этого же соединения, кроме сигналов протонов водорода, относящихся к оксипропильным группам и хитозановым звеньям, обнаружены дополнительные сигналы небольшой интенсивности в виде синглетов в области 1.93, 2.10, 2.25, 5.60 и 8.65 м.д.

Характер и положение этих сигналов в спектре дают возможность предположить присутствие небольшого количества неотщепившихся ацетильных фрагментов и фрагментов частично гидролизованных пептидных цепочек, что также свидетельствует в пользу нашего предположения о связующей роли пептидных цепочек между хитиновой и глюкановой компонентами ХГК.

Выводы

Таким образом, жесткие условия обработки ХГК, примененные нами ранее при его дезацетилировании, приводят не только к дезацетилированию хитиновой компоненты ХГК, но и, вероятно, к обрыву большей части глюкановых и образующихся хитозановых цепей в виде олигосахаридов и растворению их в реакционной смеси. В результате протекания этих процессов выделяли не хитозан-глюкановый комплекс, а щелоченерастворимые фрагменты этого комплекса, представляющие собой, большей частью, пептидогликаны, которые дают такую же картину ИК спектров, что и ХГК. В то время, как реакция ХГК с оксидом пропилена, осуществленная нами в условиях мягкого и длительного взаимодействия в щелочной среде, привела не только к присоединению оксида пропилена по гидроксильным группам ХГК, но и к гидролитическому отщеплению ацетильных, пептидных групп и, соответственно, глюканов и образованию первичных аминных групп хитозана.

Экспериментальная часть

В работе использовали производственные штаммы Р1 и Р2 гриба A.niger. Культивирование осуществляли поверхностным способом на растворах мелассы в кюветах в течение 7 суток. Выделение ХГК из биомассы этого гриба осуществляли по методике, данной в части I.

Соединение I получено обработкой ХГК 50% раствором гидроокиси натрия (гидромодуль 1:10) в присутствии боргидрида натрия при температуре 90 С. Соединения II и Ш получены обработкой 40% и 50% растворами гидроокиси натрия (гидромодуль 1:10), соответственно, в инертной атмосфере при температуре 95*5 С. Содержание азота первичных аминогрупп определяли по методу [5], основанному на измерении объема азота, выделившегося при реакции дезаминирования.

ИК спектры образцов снимали в области 400-4000 см-1 в виде таблеток в бромистом калии на спектрометре Specord M-80. Спектр ЯМР 13С сняли на спектрометре Bruker MSL 400 с рабочей частотой 100 Мгц (растворитель - D2O). Спектры ПМР сняли на спектрометре ЯМР Tesla 567A высокого разрешения с Фурье-преобразователем и с рабочей частотой 100 Мгц (растворитель - D2O).

Качественная реакция на a-оксикислоты проведена по методу [6].

Литература

1] Нудьга Л.А., Ганичева С.И., Петрова В.А., Быстрова Е.С., Львова Е.Б., Галкин А.В., Петропавловский Г.А. Журнал прикл. химии. 1997. Т.70. №2. С.242-245.

2] Феофилова Е.П., Марьин А.П., Терешина В.М. Приклад. биохимия и микробиология. 1994. Т.30. Вып. 1. С.149-155.

3] Терешина В.М., Марьин А.П., Косяков В.Н., Козлов В.Н., Феофилова Е.П. Приклад. биохимия и микробиология. 1999. Т.35. № 4. С.432-436.

4] Ганичева С.И., Нудьга Л.А., Быстрова Е.С., Львова Е.Б., Николаев А.Ф. Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы Пятой конференции. Москва-Щелково. 1999. С.222-225.

5] Климова В.А. Основные микрометоды анализа органических соединений. М.: Химия. 1975. С.164-166.

6] Губен-Вейль. Методы органической химии. Т.2. Методы анализа. М.: Химия. 1967. С.520.

7] J.E. Shively, H.E. Conrad. Biochemistry. 1970. V.9. No.1. P.33-43.

8] F.G. Pearson, R.H. Marchessault, G.Y. Liang J.Polim.Sci. 1960. V.43. No.141. P.101-116.

9] Губен-Вейль. Методы органической химии. Т.2. Методы анализа. М.: Химия. 1967. С.708-712.

Размещено на Allbest.ru