Определение содержания основного вещества методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при анализе антибиотика-полипептида и антибиотика полициклической структуры

Полная исследовательская публикация ____________________ Баклыкова О.В. и Авраменко Г.В.

Размещено на http://www.allbest.ru/

142 _____________ http://butlerov.com/ _____________ ©--Butlerov Communications. 2016. Vol.46. No.6. P.136-143.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Определение содержания основного вещества методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при анализе антибиотика-полипептида и антибиотика полициклической структуры

На протяжении длительного времени жидкостная хроматография, которая возникла гораздо раньше газовой, ставшей одним из важнейших методов анализа сложных смесей, находила сравнительно ограниченное применение. Отставание жидкостной хроматографии было связано в основном с отсутствием высокочувствительных детекторов, соответствующей аппаратуры и сорбентов, которые позволили бы обеспечивать высокоэффективное и быстрое разделение сложных смесей. В последние годы интерес к жидкостной хроматографии необычайно возрос в связи с разработкой новых детектирующих устройств и сорбентов, и в настоящее время существует высокоэффективная жидкостная хроматография, которая при анализе многих веществ, особенно малолетучих и нетермостабильных, конкурирует с газовой хроматографией как с точки зрения эффективности разделения, так и скорости, и удобства проведения анализов.

Термин хроматография в настоящее время охватывает множество методов разделения, основанных на распределении вещества между подвижной фазой, которой может быть газ или жидкость, и неподвижной фазой - жидкостью или твердым веществом [1].

Исторически хроматография впервые была предложена русским химиком Михаилом Цветом, который в 1903 г. прочел лекцию о разделении пигментов, выделенных из зеленых листьев растений, на колонке с мелом. Его первые статьи были опубликованы в 1906 г. Другой ученый, Девид Телбот Дей, в это же время использовал хроматографию для разделения углеводородов из нефти. Однако честь первооткрывателя принадлежит Цвету, так как он, в отличие от Дея, понял и объяснил хроматографический процесс. Он предложил термин хроматография, что означает цвето-запись, в связи с тем, что он наблюдал окрашенные зоны на белой колонке, заполненной мелом.

Однако хроматография не развивалась на протяжении многих лет. Если этот метод и находил применение, то в основном в виде адсорбционной либо жидкостной хроматографии. Затем в конце тридцатых и в начале сороковых годов интерес к хроматографическим методам стал возрастать:

Работа Мартина и Синджа по разделению жидкостей, удостоенная в 1941 г. Нобелевской премии, не только произвела коренные изменения в жидкостной хроматографии, но и послу-жила ступенью для развития газо-жидкостной и бумажной хроматографии [2].

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) принадлежит к числу наиболее распространённых современных методов аналитической химии. Благодаря разнообразию ис-пользуемых сорбентов и подвижных фаз метод нашел применение в разнообразных областях анализа, включая лекарственные препараты [3].

Высокоэффективная жидкостная хроматография (жидкостная хроматография высокого давления) - это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит жид-кость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии характеризуются высоким гидравлическим сопротивлением на входе.

В обращенно-фазовой хроматографии неподвижная фаза - неполярная (гидрофобные силикагели с привитыми группами С4, С8, С18 и другие); подвижная фаза - полярная (смеси воды и полярных растворителей: ацетонитрила, метанола, тетрагидрофурана и др.). Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Чем больше содержание органического растворителя, тем выше элюирующая способность подвижной фазы.

Высокоэффективная жидкостная хроматография успешно применяется как для качественного, так и для количественного анализа лекарственных средств в испытаниях «Подлинность», «Посторонние примеси», «Растворение», «Однородность дозирования», «Количественное определение». Следует отметить, что хроматография позволяет совмещать в одной пробе несколько испытаний, в том числе «Подлинность» и «Количественное определение» [4].

При разработке методик подобраны хроматографические условия и сорбент, которые обеспечивают хорошее разрешение между пиками и соблюдение пригодности хроматографической системы.

В качестве объектов исследования были выбраны два инновационных лекарственных препарата, используемые при лечении тяжелых инфекций: пневмонии, сепсиса, инфекции кожи и мягких тканей. Каждый из этих препаратов является уникальным по своим свойствам и не имеет аналогов на территории РФ.

Первым объектом исследования являлся Полимиксин В (лекарственный препарат Вилимиксин^®). По химической структуре полимиксин В представляет собой циклический полипептид, молекула которого состоит из поликатионного пептидного кольца, включающего от 8 до 10 аминокислотных остатков, и присоединенной к нему жирной кислоты в виде боковой цепи (рис. 1) 5.

Рис. 1. Структурная формула Полимиксина В

Рис. 2. Структурная формула фузидовой кислоты

По сути, антибиотик действует как поверхностно-активное вещество - дестабилизирует и повышает проницаемость клеточной мембраны и нейтрализует активность эндотоксина грамотрицательных бактерий, который представляет собой липидную часть молекулы липополисахаридов 6, 7.

Вторым объектом исследования являлась Фузидовая кислота (лекарственный препарат Фузида-нат^®). Фузидовая кислота - С₃₁Н₄₈О₆?ЅН₂О (молекулярная масса - 525.7) по химической структуре является тетрациклическим тритерпеноидом (рис. 2). Она продуцируется грибами Fusidiumcoccineum [8] и является единственным, используемым в клинической практике, представителем класса фузиданов.

Основным производным фузидовой кислоты, используемым в клинической практике, является ее натриевая соль - С₃₁Н₄₇NаО₆ (молекулярная масса - 538.7), которая отличается от фузидовой кис-лоты хорошей растворимостью в воде, что позволяет использовать ее для внутривенного введения [8].

В первом случае при разработке методики количественного определения полимиксина В экспе-риментально были подобраны условия, которые представлены в табл. 1.

хроматография антибиотик полипептид полициклический

Табл. 1. Хроматографические условия жидкостной хроматограф с УФ-детектором

При проведении эксперимента тщательно выбирался сорбент колонки, состав подвижной фазы и концентрация основного вещества. Приготовление подвижных фаз А, Б и растворов производилось следующим образом:

Подвижная фаза А. 4.46 г. натрия сульфата безводного помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в 900 мл воды и перемешивают, при необходимости, показатель рН доводят до значения (2.3+0.05) раствором ортофосфорной кислоты разведенной. Объем раствора доводят водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр «Millipore» 0.45 мкм и дегазируют.

Подвижна фаза Б. Ацетонитрил, отфильтрованный через мембранный фильтр «Millipore» с диаметром пор 0.45 мкм и дегазированный.

Растворитель. Готовят смесь ацетонитрила с водой в объемном соотношении 20:80. Получен-ную смесь фильтруют через мембранный фильтр «Millipore» 0.45 мкм и дегазируют.

Испытуемый раствор. Около 50 мг (точная навеска) препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в растворителе, объем раствора доводят этим же растворителем до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Стандартный раствор. Около 50 мг (точная навеска) стандартного образца полимиксина В сульфата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в растворителе, объем раствора доводят этим же растворителем до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Во втором случае при разработке методики количественного определения фузидовой кислоты также экспериментально были подобраны условия, которые представлены в табл. 2.

Табл. 2. Хроматографические условия жидкостной хроматограф с УФ-детектором

При проведении эксперимента необходимо было выбрать максимально правильное соотношение компонентов в подвижной фазе. Приготовление подвижной фазы и растворов проводили следующим образом:

Подвижная фаза. Готовят смесь ацетонитрила, метанола и 0.05 М раствора ортофосфорной кислоты в объемном соотношении 6:1:3, перемешивают. Полученную смесь фильтруют через мембранный фильтр «Millipore» с диаметром пор 0.45 мкм и дегазируют. Раствор используют свежеприготовленным.

Растворитель. Готовят смесь ацетонитрила, метанола и 0.05 М раствора ортофосфорной кис-лоты в объемном соотношении 5:1:4, перемешивают. Полученную смесь фильтруют через мембранный фильтр «Millipore» с диаметром пор 0.45 мкм и дегазируют. Раствор используют свежеприготовленным.

Испытуемый раствор. Около 25 мг (точная навеска) препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и растворяют в растворителе, объем раствора доводят этим же растворителем до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Стандартный раствор. Около 30 мг (точная навеска) стандартного образца диэтаноламина-фузидата (BP СRS) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и растворяют в растворителе, объем раствора доводят этим же растворителем до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Раствор для проверки пригодности хроматографической системы (ППХС). Около 5 мг (точная навеска) стандартного образца 3-кетофузидовой кислоты (EP СRS) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в растворителе, прибавляют 10 мл стандартного раствора, объем раствора доводят этим же растворителем до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

В обоих случаях определение основных веществ проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Эксперименты проводились на жидкостном хроматографе Waters с УФ-детектором.

Табл. 3. Идентификация полимиксинов

В первом случае при количественном определении полимиксина В идентификацию полимик-синов проводили по временам удерживания относительно времени удерживания пика полимиксина В1, которые представлены в табл. 3.

Пригодность хроматографической системы проверяли, вводя в хроматограф стан-дартный раствор и производят запись хроматограмм. Согласно разработанной методики хроматографическая система считалась пригодной, если:

Ш асимметрия пика полимиксина В1 не более 2;

Ш разрешение между пиками полимиксина В2 и полимиксина В3 не менее 3.0;

Ш относительное стандартное отклонение пика полимиксина В1 не более 2%;

Ш эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику полимиксина В1, не менее 5000 теоретических тарелок;

Методика. В хроматограф последовательно вводят испытуемый раствор и стандартный раствор, производят запись хроматограмм и определяют площади пиков, соответствующих полимиксинов.

Рис. 3. Хроматограмма пригодности хроматографической системы

Табл. 4. Результаты хроматографирования при оценке пригодности хроматографической системы

Из полученной хроматограммы видно, что разрешение между пиками полимиксина В2 и полимиксина В3 составляет 4.05. Данный результат свидетельствует о выполнении условия хроматографической системы.

Рис. 4. Хроматограмма стандартного раствора

Табл. 5. Результаты хроматографирования стандартного раствора

Рис. 5. Хроматограмма испытуемого раствора

Табл. 6. Результаты хроматографирования испытуемого раствора

Данные полученные на хроматограммах стандартного раствора (рис. 4) и испытуемого раствора (рис. 5) используют для расчёта содержания каждого из полимиксинов.

Содержание полимиксинов В1, В2, В3 и В1-I в пересчете на сухое вещество в препарате (Х), в процентах, вычисляют по формуле:

S₁ Ч а ₀ Ч Р Ч100

Х = -----------------------

S₀ Ч а ₁ Ч (100-W)

где: S₁ - площадь пика соответствующего полимиксина на хроматограмме раствора препарата; S₀ - площадь пика соответствующего полимиксина на хроматограмме стандартного раствора; а₁ - навеска препарата, мг; а₀ - навеска стандартного образца полимиксина В сульфата, мг; Р - содержание соответствующего полимиксина в стандарт-ном образце полимиксина В сульфата, %; W - содержание влаги в препарате, %.

Содержание полимиксина В3 не должно превышать 6.0% в пересчете на сухое вещество, полимиксина В1-I - не более 15.0% в пересчете на сухое вещество, сумма полимиксинов В1, В2, В3 и В1-I - не менее 80.0% в пересчете на сухое вещество. В результате расчетов по приведенной выше формуле было получено содержания каждого из полимексинов, а именно B3 = 4.39%, B1-I = 8.46% и сумма, которая составила 86.94%. Все полученные данные соответствовали требованиям нормативного документа и общепринятым нормам EP 7.0 [5].

Во втором случае при количественном определение фузидовой кислоты проверка при-годности хроматографической системы оценивалась следующим образом: в хроматограф вводили раствор для проверки пригодности хроматографической системы, стандартный раствор и испытуемый раствор, производя запись хроматограмм. Хроматографическая система считалась пригодной, если:

Ш разрешения между пиком 3-кетофузидовой кислоты и пиком диэтаноламинафузидата на хроматограмме раствора ППХС - не менее 2.5.

Ш эффективность колонки, рассчитанная по пику диэтаноламинафузидата, на хроматограмме стандартного раствора - не менее 1500 теоретических тарелок;

Ш фактор асимметрии для пика диэтаноламинафузидата - не более 2.0;

Ш относительное стандартное отклонение площади пика диэтаноламинафузидата - не более 2%.

Методика. В хроматограф последовательно вводят стандартный раствор и испытуемый раствор, записывают хроматограммы.

Рис. 6. Хроматограмма пригодности хроматографической системы

Из выше представленной хроматограммы видно, что разрешения между пиком 3-кето-фузидовой кислоты и пиком диэтаноламинафузидата на хроматограмме раствора ППХС составляет 6.42. Данное значение свидетельствует о выполнении требований методики, которые планировались в начале эксперимента.

Рис. 7. Хроматограмма стандартного раствора

Рис. 8. Хроматограмма испытуемого раствора

Данные полученные на хроматограммах стандартного раствора (рис. 7) и испытуемого раствора (рис. 8) используют для расчёта содержания фузидовой кислоты.

Содержание фузидовой кислоты (Х) вофлаконе, в мг, вычисляют по формуле

S₁ Ч а₀ Ч Р Ч M

Х = -----------------------

S₀ Ч A₁ Ч 100

где: S₁ - площадь основного пика на хроматограмме испытуемого раствора;

S₀ - площадь основного пика на хроматограмме стандартного раствора; а₁ - навеска испытуемого препарата, мг; а₀ - навеска стандартного образца диэтаноламинафузидата, мг; P - содержание фузидовой кислоты в стандартном образце, %; M - средняя масса содержимого флакона, мг.

Содержание фузидовой кислоты (С₃₁Н₄₈О₆) во флаконе должно быть не менее 450 мг и не более 550 мг. В результате расчетов по приведенной выше формуле было получено содержания фузидовой кислоты (С₃₁Н₄₈О₆) во флаконе 503.1 мг. Полученные данные соответствовали требованиям нормативного документа, что свидетельствует о точности и правильности эксперимента.

Выводы

1. Найдены оптимальные хроматографические условия количественного определения основных веществ в лекарственных формах на основе антибиотика-полипептида и антибиотика полициклической структуры методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Использование данного метода позволило получить воспроизводимые результаты, высокую эффективность хроматографической колонки и отличное разделение пиков на хроматограммах в каждом из исследуемых объектов, что свидетельствует о правильности в выборе метода исследования.

2. Разработанные методики определения основных веществ в лекарственных формах на основе антибиотика-полипептида и антибиотика полициклической структуры будут применятся для оценки качества выпускаемых лекарственных препаратов в фармацевтической промышленности.

Литература

[1] Ревельский И.А. Основы жидкостной хроматографии. М.: Мир. 1973. 260 с.

[2] N. Hadden. Basic Liquid Chromatography. USA: Varian Aerograph. 1971. 250 с.

[3] Садек П. Растворители для ВЭЖХ. М.: Бином. Лаборатория знаний. 2006. 704 с.

[4] Государственная фармакопея российской федерации. XIII издание. Том 1. ОФС.1.2.1.2.0005.15. Высокоэффективная жидкостная хроматография. С. 496-512.

[5] European Pharmacopoeia, 7.0. 2011.

[6] Баклыкова О.В., Авраменко Г.В. Спектр активности, фармакодинамика, фармакокинетика и острая токсичность антибиотика-полипептида. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.38. №4. С. 67-72.

[7] Bedford Laboratories. PolymyxinВ for injection: Product Monograph. (2004) Bedford, OH 44146: Bedford Laboratories.

[8] Reynolds J.I.F., editor. Martindall The Extra Pharmacopoeia. 31st ed. London: Royal Pharmaceutical Society. 1996. P.233-235.

Размещено на Allbest.ru