О молекулярном механизме биологической активности апигенина

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

О молекулярном механизме биологической активности апигенина

Спирихин Леонид

Аннотация

Методами спектроскопии ЯМР и квантовой химии проведены исследования взаимодействия молекулы тригидрооксифлавона (апигенина) с молекулой фосфатидилхолина. Показано изменение конформационных состояний молекулы лецитина при формировании комплекса с апигенином, вызывающих образование кинков.

Ключевые cлова: биологическая активность, флавоноиды, апигенин, ЯМР спектроскопия, квантово-химические расчеты.

Введение

Молекула апигенина является представителем обширным группы флавоноидов - соеди-нений растительного происхождения. В последние годы интерес к этой группе соединений резко возрос в связи с установленным все расширяющимся рядом видов проявляемой ими биологической активности [1-3]. К настоящему времени выделено из природных источников и произведено идентификация свыше шести тысяч молекул из группы флавоноидов, у которых установлено больше сорока видов биологической активности [4].

Особый интерес исследователей к апигенину обусловлен обнаруженной его способ-ностью подавлять развитие клеток новообразований в тканях организма, его противоаллер-гические свойства нашли в ряде случаев практическое применение [4, 5]. Быстро растущий интерес к этому соединению обусловлен его способностью оказывать влияние на прони-цаемость стенок капилляров.

Рис. 1. Молекула апигенина

Апигенин - сложное полифенольное соединение, включающее три шестичленных цикла, допускающее раз-личные внутримолекулярные взаимодействия и изменения его конформационных состояний и электронного строения при межмолекулярных взаимодействиях [6, 7] (рис. 1). молекула лецитин апигенин углеводородный

Ранее было показано, что апигенин при взаимодейст-вии с клеточным фосфатидилхолином образует комплексы посредством связи р-системы электронов кольца C и холи-новой группы лецитина, сопровождающиеся изменением электронного строения и конформаций лецитина [8-10]. Биологические функции молекул принято считать закодированными в структуре молекулы [11, 12]. Широкий набор видов био-логической активности дает возможность предположить, что взаимодействие апигенина с другими биологическими молекулами сопровождается изменениями и в апигенине. В нас-тоящем сообщении представлены результаты исследований изменений электронного строения и структуры апигенина и клеточного лецитина при их взаимодействии.

Экспериментальная часть

В экспериментах использовался лецитин, полученный по способу, описанному в работе [11]. Очистка препарата производилась методом колоночной хроматографии. Чистота препарата прове-рялась по спектрам ЯМР. В работе использовались стандартные образцы апигенина фирмы Aldrich.

Рис. 2. Фрагмент спектра комплекса лецитин-апигенин область двойной связи углеводородной цепи лецитина

Рис. 3. Двумерный спектр лецитина-апигенина

Растворы лецитина имели концентрацию 0.005 М, концентрация тригидрооксифлавона менялись по условиям эксперимента. Спектры регистрировались при относительно низких значениях концентрации лецитина из-за возникновения мицелл, приводящих к уширению спектральных линий и снижению точности измерений. Спектры ЯМР ¹H и ¹³С записаны на импульсном спектрометре Bruker Avance III с рабочей частотой 500.13 мГц (¹Н) и 125.47 мГц (¹³С) с использованием 5 мм датчика с Z-градиентом РАВВО при постоянной температуре образца 298 К. Химические сдвиги в спектрах ЯМР ¹³С, ¹H приведены в м.д. относительно сигнала внутреннего стандарта тетраметилсилана (ТМС). Задержка между импульсными последовательностями устанавливалась для достижения полной релаксации. С целью увеличения цифрового разрешения применялось дополнение нулями и умножение Фурье-образа спектра на экспоненциальную функцию (1b = 0.1 Гц для ¹Н и 1 Гц для ¹³С). Спектры ЯМР ¹³С с подавлением протонам (WALTZ-16) были зарегистрированы при следующих условиях: спектральное окно 29.8 кГц, количество точек - 64 К, длительность возбуждающего им-пульса (30°) - 3.2 мкс, релаксационная задержка - 2с. количество прохождений - 256. Редактирование спектров ЯМР ¹³С проводилось на основании экспериментов DEPT-90 и DEPT-135. Длительность импульса, регенерирующего поперечную намагниченность, выбиралась 6 мкс (DEPT-90) и 9 мкс (DEPT-135), рефокусирующая задержка 1/2J = 3.5 мс, 64 К точки накоплены в течение 64 прохож-дений, спектральное окно- 29.8 кГц, экспоненциальное уширение линий - 1 Гц.

Двумерные спектры зарегистрированы в стандартных режимах многоимпульсных последова-тельностей программного обеспечения прибора. Спектры gsCOSY зарегистрированы со следующими параметрами: размер матрицы 4 К на 512 экспериментов при спектральном окне 5.0 кГц, при обработке использовалась синусоидальная-колоколообразная взвешивающая функция для F1 и F2 проекцй (ssb = 2), gsHSQC спектр (hsqcetgp[4], размер матрицы 2К на 256 экспериментов, 5.0 кГц для F2-проекции и 27.7 кГц - для F1) зарегистрирован с задержкой d 4 оптимизированной под наблюдение JCH = 145 [15].

Результаты и их обсуждение

В работе [12] было показано, что в растворах клеточного фосфатидидхолина с апиге-нином возникают комплексы за счет взаимодействия -системы электронов кольца С три-гидрооксифлавона с холиновой группой лецитина и определены изменения электронного строения и конформационных состояний лецитина. Очень широкий круг видов биоактивности разной природы и достаточно сложное строение молекулы апигенина обусловили предполо-жение о возможности дополнительных типов комплексов, сопровождающихся изменениями и в апигенине. Внимательный анализ спектров от ядер ¹³С в области слабого поля показал изменения спектральных линий, соответствующих ядрам атомов углерода, образующих двой-ную связь в углеводородной цепи молекулы лецитина. Сигнал от ядра С(10) с химическим сдвигом 130.0472 м.д. смещается в сторону сильного поля на 0.045 м.д.

Одновременно под влиянием апигенина происходит полное разрешение практически слившихся линий от ядер С(9) и С(10), образующих двойную связь (рис. 2).

Зарегистрированные двумерные С, Н спектры дали возможность установить и произ-вести идентификацию связи атомов водорода апигенина с атомами углерода, образующими двойную связь в углеводородной цепи лецитина. В частности, как видно из рис. 3 слабо заметный кросс пик обусловленный ядром С⁽¹⁰⁾ с химическим сдвигом 130.002 дублетом линий от Н⁽³⁾ и H⁽⁵⁾ с сдвигом 7.034 и 7.005 показывает возникновение комплекса.

Значение энергии комплексообразования, полученное из расчетов методом PDF состав-ляет 4.3 ккал/моль и в несколько раз меньше энергии комплекса кольцо С апигенина и с холиновой группой лецитина. Образование этого типа комплекса сопровождается изме-нением конформационного состояния углеводородной цепи лецитина. Участок углеводород-ного хвоста, находящийся в транс состоянии, переходит в гош-конформацию. Переход в гош-конформацию повышает общую энергию комплекса на 3.12 ккал/моль, но потенциаль-ный барьер, разделяющий эти два состояния, имеет значение 20.1 ккал/моль и является достаточно высоким, что видно из наблюдаемой полуширины спектральных линий от ядер атомов, входящих в двойную связь. Такой переход приводит к возникновению кинков в клеточной мембране, следовательно, дополнительных каналов обмена веществ Квантово-химические расчеты, полученные методом PDF B3LYP/6-31 (2d,P) хорошо согласуются с результатами эксперимента. Возникновение комплекса приводит к небольшому изменению населенности s орбиталей Н₍₂₎ и Н₍₆₎ на 0.002 и 0.0018 соотвественно, как видно из рис. 3, они остаются сливающимися и смещаются в сторону сильного поля как вытекает из рас-четных данных. Полученные значения структурных данных показывают, что атом кисло-рода в кольце В апигенина выходит из плоскости на 0.18 Е и молекула приобретает новую пространственную структуру. Таким образом, можно считать, одной из причин, влияющих на проницаемость клеточных мембран, является образование кинков в углеводородной цепи лецитина.

Литература

[1] M.S. Setchenkov, S.I. Usmanova, R.S. Nasibullin. Complexing of some biologically active molecules with phosphatidylcholine. Russian physics journal. 2009. Vol.52. No.4. P.417-420.

[2] G.R.A. Hunt, K.A. Jawaharlal. H-NMR investigation of the mechanism for the ionophore activity of the bile salts in phospholipid vesicular membranes and the effect of cholesterol. Biochim. Biophys. Acta 501. 1980. P.678-684

[3] Нусратуллин В.М., Сетченков М.С., Усманова С.И., Насибуллин Р.С. Исследование изменений комплекса 3,2,3,5,7,-пентагидроксифлавон-фосфатидилхолин в водной среде. Бутлеровские сообщения. 2009. Т.18. №7. С.60-62.

[4] Усманова С.И., Фахретдинова Е.Р., Насибуллин Р.С. Некоторые структурные параметры и электронное строение комплекса 5,7,3',4',-тетраоксифлавонола-3-рутинозида с фосфатидилхолином. Химическая физика и мезоскопия. 2011. Т.13. №2. С.281-284.

[5] R.S. Nasibullin., T.I. Nikitina, Yu.G. Afanaseva. Complex of 3,5,7,3',4'- pentahedroxyflavanol with phosphatidylcholine et al. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2002. vol.36. No.9. P.492-495.

[6] Насибуллин Р.С., Сетченков М.С., Усманова С.И. Комплекс рутина с фосфатидилхолином. Бутлеровские сообщения. 2005. Т.7. №3. С.1-2.

[7] Сетченков М.С., Усмвнова С.И., Нусратуллин В.М., Насибуллин Р.С. ⁽³¹⁾Р спектроскопические исследования комплексообразования рутина с фосфатидилхолином. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.25. №6. С.63-65.

[8] Yu.G. Afanas'eva, E.R. Fakhretdinova, L.V. Spirikhin, R.S. Nasibullin. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2007. Vol.41. No.7. C.354-356. Mechanism of interaction of certain flavonoids with phosphatidylcholine of cellular membranes.

[9] B.H. Havsteen. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacol. Ther. 96. 2002. P.67-202.

[10] Bozena Pawlikovska-Pawlega, Lucjan E. Misiak, Barbara Zaezyka, Roman Paduch, Antoni Gawron, Wieslaw I. Gruszecki dipalmitoylphosphatidylcholine liposomes. Biochimika et Biophysika Acta. 1828 2013. P.518-527.

[11] J. Gabrielska, M. Gagos, J. Gubernator, W.I. Gruszecki. Binding of antibiotic amphotericin B to lipid membranes: a ¹H NMR study, FEBS Lett. 580. 2006. P.2677-2685.

[12] J. Gabrielska, W.I. Gruszecki. Zeaxanthin (dihydroxy-в-carotene) but not в-carotene rigidifies lipid membranes: a ¹H NMR study of carotenoid-egg phosphatidylcholine liposomes. Biochim. Biophys. Acta 1285. 1996. P.167-174.

[13] I.C. Jones, G.R.A Hunt. ^A31P- and ¹H-NMR investigation into the mechanism of bilayer permeability induced by the action of phospholipase A₂ on phosphatidylcholine vesicles. Biochim. Biophys. Acta 820. 1985. P.48-57.

[14] M. Terasaki, L. Jaffe. Organization of the sea urchin egg endoplasmatic reticulum and its reorganization at fertilization. J. Cell Biol. 114. 1991. P.929-940.

[15] A.L. Davis, J. Keeler, E.D. Laue, D. Moskau. J. Magn. Reson.1992. Vol.98. No.1. P.207.

Размещено на Allbest.ru