Кристаллизация фосфатов кальция из прототипов биологических жидкостей на костных образцах

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кристаллизация фосфатов кальция из прототипов биологических жидкостей на костных образцах

В связи с ростом числа костных заболеваний уделяется большое внимание созданию биокомпозитных материалов. Большие перспективы экспериментального и клинического применения имеют синтетические материалы на основе фосфатов кальция, которые обладают высокой биосовместимостью по отношению к костной ткани человека и способны в силу своей инертности выполнять функцию матрицы, вдоль которой происходит новообразование костных структур. Важным направлением является изучение процесса кристаллизации из прототипов биологических жидкостей. В работе определен состав костной ткани: основной кристаллической фазой является плохоокристаллизованный карбонатсодержащий гидроксилапатит. Показано, что кристаллизация фосфатов кальция на костных образцах из прототипов биожидкостей возможна, при этом в межклеточной жидкости образуется карбонатсодержащий гидроксилапатит, а в синовиальной - гидроксилапатит и октакальцийфосфат.

Одним из наиболее актуальных направлений в области функциональных материалов является создание имплантатов, предназначенных для регенерации костных тканей, поврежденных в результате травм или патологических заболеваний. Большие перспективы экспериментального и клинического применения имеют синтетические материалы на основе фосфатов кальция, которые обладают высокой биосовместимостью по отношению к костной ткани человека и способны в силу своей инертности выполнять функцию матрицы, вдоль которой происходит новообразование костных структур [1].

Также интерес к изучению данных соединений вызывает то, что фосфаты кальция входят в состав большинства патогенных биоминералов, причины и механизм образования, которых до сих пор не выявлены [2]. При этом следует отметить, что в последнее время наблюдается рост числа заболеваний, обусловленных формированием данных агрегатов в организме человека.

К ним относится коксартроз - это поражение структуры гиалинового хряща головки бедренной кости и последующее разрушение подлежащей костной ткани, а на более поздних стадиях заболевания происходит образование кист и краевых разрастаний-остеофитов. Такие изменения приводят к потере выполняемых суставом функций и замене его имплантатом. При этом следует отметить, что в 25% случаев происходит отторжение.

В настоящее время ведется много исследований по получению биокомпозитных материалов [3-10] но, в основном, их синтез ведется из водных растворов.

Наиболее актуальным направлением является исследование процесса кристаллизации из прототипов биологических жидкостей на костных образцах, что позволяет изучить по какому механизму происходит регенерация костной ткани и какие продукты образуются при развитии патологии. Именно такой подход реализуется в данной работе.

Экспериментальная часть

Материалом исследования служит коллекция из «нормальных» и пораженных коксартрозом головок бедренных костей жителей омского региона в возрасте 30-79 лет.

Первоначально были изучены образцы из удаленных суставов головок бедренных костей методами РФА, ИК-спектроскопии, оптической и электронной микроскопией, а также для выявления степени пораженности данным заболеванием были проведены исследования микротвёрдости по методу Виккерса и пористости массовым методом (методом вытеснения жидкости из пор, жидкостью являлся керосин) [11].

На следующем этапе для моделирования процесса кристаллизации на костных образцах была поставлена серия экспериментов. В качестве среды для проведения эксперимента были выбраны две биожидкости-межклеточная и синовиальная. Выбор обусловлен тем, что межклеточная жидкость является основной минералообразующей средой, питающей клеточные структуры в организме человека.

Синовиальная жидкость в свою очередь омывает обнаженный хрящ суставных поверхностей. Синовия совместно с кровью, приносимой кровеносными капиллярами со стороны кости обеспечивают питание и функционирование суставного хряща, а, следовательно, подвижность самого сустава [12].

В эксперименте использовались значения диапазона концентраций основных неорганических компонентов и рН межклеточной и синовиальной жидкостей здорового взрослого среднестатистического человека. Выбор исходных реагентов и их соотношение в растворе определялись таким образом, чтобы концентрации ионов и ионная сила раствора были максимально приближенны к данным параметрам моделируемой системы.

Рис. 1. Пример эксперимента с подвешенным костным образцом

синтетический кристаллический кальций фосфат

После приготовления раствора с заданными концентрациями основных компонентов проводили корректировку рН. Готовый раствор переливали в конические колбы с притертой пробкой, подвешивали костный образец, таким образом, чтобы он полностью был погружен в раствор (рис. 1), плотно закры-вали и оставляли для кристаллизации при комнатной температуре на время (от 5 дней до трех недель).

По окончании времени синтеза в надосадочных жидкостях потенциометрическим методом измеряли рН и концентрацию ионов Са2+. Фотометрически определяли остаточные концентрации в растворе фосфатионов в виде молибденовой сини [РД 52.24.382-2006] на приборе КФК-2.

Твердые фазы отфильтровывали, высушивали и анализировали методами ИК-Фурье-спектроскопии и рентгенофазового анализа (РФА) - качественный и количественный фазовый анализ, расчет размеров кристаллитов (областей когерентного рассеяния - ОКР). ИК-спектры регистрировали на спектрометре ФТ-801 (образцы готовили в виде таблеток с KBr). РФА был выполнен на порошковом рентгеновском дифрактометре D8Advance, Bruker Германия в монохроматизированном Сu-kбизлучении. Морфологию осадков изучали с помощью микроскопа МБР-1. Эксперимент проводили при разных пересыщениях: 30, 50, 70. Время варьировали от 5 дней, до 3 недель.

Для определения твердости в поверхность материала с определённой силой вдавливается тело (индентор), выполненное в виде стального шарика, алмазного конуса, пирамиды или иглы [11]. По размерам получаемого на поверхности отпечатка судят о твердости материала. Таким образом, под твердостью понимают сопротивление материала местной пластической деформации, возникающей при внедрении в него более твердого тела - индентора.

В зависимости от способа измерения твердости материала, количественно ее характеризуют числами твердости по Бринеллю (НВ), Роквеллу (HRC) или Виккерсу(HV). Способ определения пористости посредством насыщения материала различными жидкостями (метод Преображенского), например керосином.

Для этого производятся измерения массы сухого материала и материала, насыщенного жидкостью известной плотности, в течение времени, достаточного для заполнения порового пространства. После этого производится измерение массы насыщенного материала в воздухе и в жидкости, на основании чего вычисляется объем материала и объем жидкости, заполняющий поры и, соответственно, вычисляется пористость материала.

Рентгенофазовый анализ костных проб «нормальных» и пораженных коксартрозом (рис. 2) показал, что кристаллическую структуру костной ткани составляет гидроксилапатит. Малая интенсивность и полуширина дифракционных отражений указывает на его низкую кристалличность.

Рис. 2. Дифрактограммы костной ткани в «норме» и при коксартрозе

синтетический кристаллический кальций фосфат

Такая окристаллизованность минерала связана с присутствием аморфной компоненты в виде органических веществ и фосфатов кальция.

Аморфная компонента дает широтную полосу на дифрактограмме в области 10.8-16.8 брегговских углов отражения. Следует отметить, что соотношение рассматриваемых фаз (степень кристалличности) для разных образцов различно и зависит от многих факторов (стадии заболевания, сопутствующих патологий, возраста пациента, характера его питания и образа жизни).

Так, менее четкие рефлексы и повышение фоновых сигналов в области 10-20 2И можно отметить на всех дифрактограммах пораженной коксартрозом костных тканях, что свидетельствует о понижении её кристалличности её минеральной основы и увеличении количеств аморфной составляющей при патологии.

При интерпретации ИК-спектров анализируемых таких образцов (рис. 3) возникает ряд затруднений, связанных с наложением органических и минеральных составляющих.

Однако известно, что основной вклад в указанные полосы поглощения вносят неорганические группы [13].

Кроме того, на анализируемых спектрах отмечаются полосы поглощения минеральных и органических групп без суммарных наложений колебания связей соответственно: неорганические 968-954 см-1 - полносимметричное валентное колебание х1 Р-О в РО43- в апатите (А тип) [187]; 879 см-1 - деформационное колебание О-С-О в СО32- А-типа (н2 СО32-); 875-872 см-1 - деформационное колебание О-С-О в СО32- В-типа (н2 СО32-); 634-632 см-1 - либрационные полосы поглощения ОН-; 605-564 см-1 - деформационное колебание х4 О-Р-О в РО43-; 475-470 см-1 - деформационное колебание х2 О-Р-О в РО43-; органические: 2950-2800 см-1 - ассиметричные валентные колебания алкильных н(С-Нn) белковых групп и жирных кислот; 1790-1700 см-1 - н(С=О) от пептидных и не пептидных связей (сложных эфиров, кислот); 1340 см-1 - деформационные колебания малой интенсивности н(С-Нn) и С=О в н (СОО-); 1260-1242 см-1 - амид III в виде н (NH).

Анализ приведенных данных показал, что основной кристаллической фазой костной ткани является карбонатсодержащий гидроксилапатит А и В типа. Так, дублет 1460, 1420 см-1 указывает на замещение карбонатионами тетраэдров PO43- (B-тип), а интенсивность 1550 см-1 - OH- групп в каналах структуры апатита (А-тип). Малая диффузность пиков на исследуемых спектрах указывает на низкую кристалличность, упорядоченность кристаллов костного апатита. Далее определяли микротвердость и пористость костной ткани (табл. 1).

Рис. 3. ИК-спектры «нормальной» (1) и пораженной коксартрозом (2) костной ткани

синтетический кристаллический кальций фосфат

Таблица. 1. Результаты измерения пористости и микротвёрдости

Следует отметить, что измерения пористости проводились только на открытых порах. Закрытые поры не участвовали в измерениях. Видно, что пористость изменяется случайным образом, как у разных людей, так и в разных участках одной кости, что согласуется с литературными данными [14].

Значение микротвердости изменяется неоднозначно. Это связано с попаданием индентора как на костную составляющую, так и на пору.

На рис. 4-6 представлены фотографии различных участков костей, поражённых коксарторозом, полученные на электронном микроскопе. При пятидесятикратном увеличении получены чёткие изображения образующихся пор в процессе развития заболевания, как в центральных частях, так и в периферийных.

Рис. 4. Фотография костного среза («норма»)

Рис. 5. Фотография костного среза на раннем этапе коксартроза

Рис. 6. Крупные поры (средний костный срез, патология)

Видно, что в головке тазобедренной кости без патологии отсутствуют крупные поры, и морфология этой части кости представляется собой губчатое вещество.

На ранних стадиях заболевания происходит рассасывание костного вещества (так называемый процесс костной резорбции), и в толще кости образуются мелкие поры.

Проанализировав фотографии морфологии костей тазобедренных суставов «нормальных» и пораженных коксартрозом, можно сделать заключение о том, что в кости без патологии присутствует лишь естественная пористость, а на ранних стадиях заболевания в кости появляются мелкие поры.

В процессе развития патологии поры пронизывают губчатое вещество кости, начиная от периферийных областей и заканчивая центральными, таким образом, происходит рассасывание костного вещества.

На следующем этапе была поставлена серия экспериментов, для изучения процессов кристаллизации на костных образцах из прототипов синовиальной и межклеточной жидкостей.

Результаты оптической микроскопии (рис. 7) осадков на костных образцах показали, что пересыщение исходного раствора не влияет на образование продуктов синтеза, а влияет лишь на скорость образования осадка.

В случае межклеточной жидкости не зависимо от времени опыта образуется агрегаты апатита, которые можно охарактеризовать как рыхлые агрегаты, образованные из хаотично расположенных шарообразных фрагментов.

синтетический кристаллический кальций фосфат

Рис. 7. Результаты оптической микроскопии осадков, полученных при кристаллизации из межклеточной жидкости

Рис. 8. Результаты оптической микроскопии осадков, полученных при кристаллизации из синовиальной жидкости

В среде синовиальной жидкости на поверхности костных образцов образуется наряду с апатитом и кристаллы октакальцийфосфата (ОКФ). Структура кристаллов ОКФ имеет вид пластинчатых кристаллов (рис. 8). Последний является термодинамически метастабильной полиморфной модификацией ГА [15].

Нами было замечено, что после двух недель кристаллизации в биожидкостях происходит высаливание минеральной компоненты костной ткани.

Попытки уменьшить этот процесс при помощи предварительного обезжиривания кости не принесли удовлетворительных результатов.

Вероятно, при обезжиривании нарушается структура коллагена, которая является матрицей для процесса минерализации.

Различие в продуктах, образующихся на поверхности костных образцах в среде синовиальной и межклеточной жидкостях, можно объяснить различием в их составе [16, 17]: в межклеточной жидкости почти в 2 раза больше карбонатионов, поэтому, вероятно, происходит образование карбонат-гидроксилапатита.

А в синовиальной жидкости в 20 раз больше сульфат-ионов, при этом известно, что сульфатионы способствует образованию ОКФ и ингибирует образование гидроксилапатита [18].

РФА образующихся фаз на поверхности костных образцов подтверждает результаты оптической микроскопии. На рентгенограммах осадков, полученных из межклеточной жидкости присутствуют пики гидроксилапатита, а из синовиальной жидкости - гидроксилапатита и октакальцийфосфата (рис. 9, 10).

Далее был проведен анализ надосадочных жидкостей. Результаты определения ионов при различных пересыщениях растворов приведены в табл. 2.

Анализируя данные, можно отметить, что в случае межклеточной жидкости все процессы протекают более сглажено, так как ионная сила небольшая (порядка 0.15 моль).

В растворе с течением времени уменьшается содержание фосфат-ионов и среда подщелачивается.

Рис. 9. Рентгенограмма образцов, полученных из межклеточной жидкости

Рис. 10. Рентгенограмма образцов, полученных из синовиальной жидкости

Таблица. 2. Результаты химического анализа надосадочной жидкости

В синовиальной жидкости процессы неоднозначны. По-нашему мнению, это может быть обусловлено различными причинами:

ионная сила раствора в два раза больше, чем в межклеточной жидкости;

происходят процессы высаливания из костной ткани и поскольку костный матрикс содержит различные ионы, то вполне возможно их влияние на гидролиз ГА и ОКФ.

Известно, что гидролиз ОКФ сопровождается присоединением к молекуле ионов кальция из раствора и переходом части фосфат-ионов в раствор, что также влияет на изменении рН среды.

Таким образом, исходя из полученных результатов, можно утверждать, что данное направление является перспективным и требует дальнейшей разработки для получения функциональных материалов нового поколения, так как основой для этого служит костная ткань человека.

Выводы

1.Определен состав костной ткани: основной кристаллической фазой является плохоокрис-таллизованный карбонатсодержащий гидроксилапатит.

2.В процессе развития патологических заболеваний увеличивается пористость; происходит рассасывание костного вещества, приводящее к ухудшению механических свойств кости.

3.Кристаллизация фосфатов кальция на костных образцах из прототипов биожидкостей возможна, при этом в межклеточной жидкости независимо от степени пересыщения раствора образуется карбонатсодержащий гидроксилапатит.

4.В синовиальной жидкости осаждается - гидроксилапатит и октакальцийфосфат.

Литература

1.Баринов С.В. Успехи химии. 2010. Т.79. №1. С.15-32.

2.Голованова О.А. Патогенные минералы в организме человека. Омск. 2007.

3.Сурменева М.А., Сурменев Р.А., Чайкина М.В., Качаев А.А., Пичугин В.Ф., Эппле М. Исследование фазового и элементного состава покрытий на основе кремнийсодержащего гидроксиапатита для медицинских имплантатов, полученных методом ВЧ-магнетронного распыления. Физика и химия обработки материалов. 2012. №3. С.51-60.

4.Sandrine Gomes, Jean-Marie Nedelec, Edouard Jallot, Denis Sheptyakov, Guillaume Renaudin.Silicon location in silicate-substituted calcium phosphate ceramics determined by neutron diffraction. Crystal Growth & Design. 2011. Vol.11. P.4017-4026.

5.Дорожкин С.В., Симеон Агатопоулус. Биоматериалы: обзор рынка. Химия и жизнь. 2002. №2. C.8-10.

6.Yongsheng Wang, Sam Zhang, Xianting Zeng, Kui Cheng, Min Qian, Wenjian Weng. In vitro behavior of fluoridated hydroxyapatite coatings inorganic-containing simulated body fluid. Materials Science and Engineering. 2007. Vol.27. P.244-250.

7.Баринов С.М., Комлев С.В. Биокерамика на основе фосфатов кальция. М.: Наука. 2005.

Размещено на Allbest.ru