Кислотно-основные свойства эмульсионного экстракта древесной зелени пихты – дифференцированное определение констант кислотности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кислотно-основные свойства эмульсионного экстракта древесной зелени пихты - дифференцированное определение констант кислотности

Исследованы кислотно-основные свойства эмульсионного экстракта древесной зелени пихты (ЭЭП) с использованием метода рК-спектроскопии. Рассчитаны константы ионизации и концентрации кислых групп ЭЭП и органического экстракта древесной зелени пихты. Показана возможность дифференцированного определения констант кислотности фенольных гидроксильных и карбоксильных групп с использованием спектрофотометрического титрования.

Каждая из лесообразующих хвойных пород Российской Федерации (лиственница, пихта, ель и сосна) имеет свой неповторимый химический состав, познание которого открывает новые возможности для эффективного практического использования этого возобновляемого биоресурса. Химическому составу хвои и содержанию в ней отдельных соединений, в том числе фенольных, посвящено большое количество работ физиологов и биохимиков. Фенольные соединения - одна из самых многочисленных и широко распространенных групп природных соединений, привлекающих внимание, особенно в последние годы, благодаря необычайно широкому спектру их биологической активности.

Реакционная способность веществ фенольной природы во многом определяется их кислотно-основными свойствами, а именно способностью к кислотной диссоциации с образованием фенолятионов. В частности, ионизация фенольной гидроксильной группы приводит к значительному росту активности соединений фенольной природы в окислительно-восстановительных взаимодействиях. Количественная характеристика кислотно-основных свойств диссоциирующих веществ определяется величиной константы ионизации рКа.

Значения констант ионизации фенолов и органических кислот в водных растворах могут быть определены путем потенциометрического титрования.

Для анализа кривых потенциометрического титрования смесей соединений, проявляющих кислотно-основные свойства с близкими значениями рКа, в работе [2] предложено применять метод построения рК-спектра (функция распределения кислотных групп по величинам рКа), использующий линейный регрессионный анализ с ограничениями на неотрицательность решения.

Отнесение значений рКа к конкретным функциональным группам при исследовании сложных смесей природного происхождения по сей день имеет весьма условный характер. Это связано как с отсутствием исходной информации о компонентах смеси, так и близкими значениями рКа фенольных и карбоксильных групп. Доступным методом изучения кислотно-основных равновесий природных экстрактов является спектрофотометрическое титрование, основанное на значительном различии поглощения недиссоциированных и анионных форм молекул компонентов.

Целью настоящей работы является исследование функционального состава экстрактов древесной зелени пихты с использованием метода рК-спектроскопии для определения констант ионизации и концентраций кислых функциональных групп.

Экспериментальная часть

В качестве объекта исследования был выбран ЭЭП, а также образцы экстрактивных веществ. ЭЭП приготавливали обработкой измельченной древесной зелени 5%-ным водным раствором гидроксида натрия в течение 4 часов при температуре 50 °С и постоянном перемешивании с последующим удалением нерастворимого остатка фильтрацией [1].

Образец 1 представляет собой кислые компоненты эмульсионного экстракта древесной зелени пихты, его выделяли диэтиловым эфиром из ЭЭП, подкисленного до рН = 2-3 12%-ной серной кислотой.

Образец 2 представляет собой подкисленный ЭЭП после выделения из него образца 1.

Образец 3 представляет собой кислые компоненты древесной зелени пихты, выделенные спосо-бом экстракции органическими растворителями. При этом измельченную древесную зелень пихты обрабатывали в смеси растворителей бензин: этилацетат в соотношении 1:10 в течение 42 часов. Далее экстракт обрабатывали в делительной воронке 2% раствором гидроксида натрия для выделения кислых компонентов.

После расслоения нижний водно-щелочной раствор отделяли, подкисляли 12% раствором серной кислоты до рН = 2 и экстрагировали этилацетатом. Полученный экстракт промывали водой до нейтральной реакции, сушили над безводным сульфатом натрия, и упаривали на роторном испарителе досуха.

Потенциометрическое титрование ЭЭП проводили следующим образом. Избыток щелочи в ЭЭП предварительно нейтрализовали добавлением 15 мл 1 н раствора серной кислоты к 50 мл ЭЭП. Аликвоту 5 мл нейтрализованного ЭЭП приливали в ячейку для титрования объемом 100 мл, снабженную магнитной мешалкой, аликвоту разбавляли 25 мл дистиллированной дегазированной воды. Титрование осуществляли сначала 0.1 н раствором серной кислоты до рН = 3.5, затем 0.1 н раствором гидроксида калия до рН = 12.2. Для измерения рН во всех экспериментах применяли иономер «Эксперт-рН» (Эконикс, Россия) с комбинированным электродом ЭСК-10601/7. Иономер калибровали свежеприготовленными из фиксаналов водными стандартными буферными растворами. Погрешность измерения рН составила ± 0.01.

Для титрования образцов 1 и 3, их навески растворяли в 0.1 н растворе гидроксида калия. Затем 30 мл раствора вносили в ячейку для титрования объемом 100 мл. Концентрация образцов 1 и 3 в соответствующих титруемых растворах перед началом титрования составляла 1.5 мг/мл.

Для титрования образца 2 30 мл его раствора приливали в ячейку для титрования объемом 100 мл. В качестве титранта использовали 0.1 н раствор гидроксида калия.

Спектрофотометрическое титрование осуществляли следующим образом. Исходный раствор ЭЭП подкисляли 0.1 н раствором серной кислоты до рН = 3, затем отбирали 1 мл в мерную колбу и разбавляли дистиллированной водой до общего объема 100 мл.

Полученный раствор (50 мл) переносили в ячейку для титрования на 100 мл. Титрование проводили 1 н раствором гидроксида калия. После введения каждой порции титранта равновесие рН устанавливалось в течение 2-3 мин. После этого дозатором вводили 3 мл раствора в кварцевую кювету (1 см) и записывали спектр поглощения раствора относительно воды в диапазоне длин волн от 240 до 400 нм на спектрофотометре UV-1700 (Shimadzu, Япония). По результатам титрования строили зависимости D-рН при аналитических длинах волн, которые соответствуют максимумам на дифференциальном УФ-спектре (разность спектров в щелочной и нейтральной среде).

Расчет рК-спектра. рК-спектром является функция распределения концентраций ионогенных групп по всем возможным величинам констант ионизации. Находили эта функция распределения путем решения системы уравнений типа:

где б - количество анионов одноосновных кислот в растворе (ммоль), определяется как:

природный эмульсионный экстракт

Каждое уравнение в этой системе соответствует паре значений бj - рНj, (j = 1, ... n) для каждой из n экспериментальных точек кривой титрования. Суммирование в этих уравнениях проводили по всем возможным значениям констант ионизации рКai (i = 1, … m), задаваемым заранее с определенным шагом.

где ci - молярная концентрация i-го кислого компонента в смеси, моль,

Kw - ионное произведение воды при 25 єС, V - объем добавляемого раствора основания, мл,

V0 - начальный объем титруемого раствора, мл, ct - концентрация титранта, ммоль [2].

Для анализа кривых спектрофотометрического титрования систему уравнений (1) приводили к виду:

где Dj - оптическая плотность титруемого раствора при рНj,

Da - оптическая плотность раствора до начала титрования,

?Di = Dbi _ Dai - разница оптических плотностей ионизированной (Dbi) и нейтральной формы i-го компонента (Dai).

Для расчета рК-спектра из кривых титрования использовали компьютерную программу (pks), разработанную Рязановым и успешно используемую для анализа сложных протолитических систем [3].

Результаты и их обсуждение

Способ эмульсионной экстракции растительного сырья позволяет выделять ценные биологически активные соединения и использовать их в получении препаратов для сельского хозяйства, ветеринарии и медицины [1]. ЭЭП представляет собой смесь родственных по химическому строению тритерпеноидов, а также фенольных соединений.

В целом состав растительных экстрактов сложен и не постоянен и характеризуется широким разнообразием функциональных групп различной кислотности - от сильнокислых (рКа < 4) до слабокислых, которые ионизируются при рН ~10 и выше.

С точки зрения химической природы основную долю активных функциональных групп экстрактов составляют карбоксильные и фенольные гидроксильные группы. На кислотность фенольных гидроксильных групп сильное влияние оказывают заместители в бензольном кольце, наличие цепочек сопряженных р-связей, а также межмолекулярные взаимодействия через водородные связи. Например, наличие сильного электроноакцепторного заместителя в параположении к фенольной гидроксильной группе значительно повышает ее кислотность, рКа таких соединений составляет порядка 6. Напротив, наличие в бензольном кольце или в сопряженной системе р-связей более «кислой» гидроксильной группы приводит к снижению способности к диссоциации у остальных групп.

Проблема определения констант кислотности и концентраций протонодонорных групп в водной среде связана с возможной недооценкой их количества - рН среды в диапазоне от 8 до 10 может приводить к выпадению в осадок некоторых фенольных компонентов смеси. Для решения этой проблемы в ходе данной работы проведено сравнительное исследование кислотно-основных свойств ЭЭП методами прямого и обратного потенциометрического титрования.

На рис. 1 представлены кривые титрования водного раствора ЭЭП 0.1 н раствором серной кислоты (обратное титрование) и 0.1 н раствором гидроксида калия (прямое титрование). Вид кривой прямого титрования свидетельствует о значительном гистерезисе зависимостей изменения рН от объема добавляемого титранта. Наиболее ярко гистерезис кривых титрования проявляется в диапазонах рН от 6-8 и от 9.5-11.5. В этих диапазонах происходит ионизация фенольных гидроксильных групп [4].

Рис. 1. Кривые прямого и обратного титрования ЭЭП

На основе данных прямого и обратного потенциометрического титрования ЭЭП были рассчитаны рК-спектры. На рис. 2 представлен рК-спектр ЭЭП, полученный обратным титрованием.

Значения рКа ЭЭП, а также его фракций, приведены в табл. 1. В этой таблице с1, с2 ... cn - соответствуют молярной концентрации групп определенного типа в титруемом растворе, q1, q2 ... qn - доля групп определенного типа от общего содержания кислых групп (нижний индекс соответствует порядковому номеру пика на рК-спектре слева направо). Кислотные группы на основе близости значений рКа, разделяются на пять групп.

Значения рКа в диапазоне от 6.0-11.2, в соответствии с литературными данными [4], принадлежат фенольным гидроксильным группам с различной кислотностью, а значение рКа = 4.6 характерно для карбоксильных групп. По полученным рКа спектрам также определено, что содержание фенольных гидроксильных групп в ЭЭП больше, чем карбоксильных.

Рис. 2. рК-спектр ЭЭП, обратное титрование

Рис. 3. рК-спектр образца

Таблица. 1. Кислотный состав ЭЭП и образцов 1-3

Сравнение концентраций кислых групп и значений рКа, определенных путем прямого и обратного титрования, показало, что значения рКа фенольных компонентов смеси несколько снизились в диапазоне от 8-10, а регистрируемое содержание фенольных функциональных групп при прямом титровании оказалось гораздо ниже.

Скорее всего, это обусловлено частичным выпадением в осадок фенольных компонентов смеси при рН раствора в диапазоне от 8-10. Учитывая вышесказанное, следует признать, что метод прямого титрования эмульсионных экстрактов может давать некорректные результаты относительно содержания функциональных групп в исследуемых растворах.

Образцы 1 и 3 содержат заметно меньшую долю карбоксильных групп, рКа которых составляет 3.9 (табл. 1). В образце 3, рК-спектр которого представлен на рис. 3, отмечено присутствие фенольных гидроксильных групп с рКа = 11.2. Их доля относительно кислых групп фракции 3 оказалась выше, чем компонентов с рКа = 10.8 в ЭЭП.

Также, к качественным отличиям фракции 3 можно отнести наличие функциональных групп с рКа = 8.9.

Образец 2, представляющий собой остаток после экстракции исходного ЭЭП диэтиловым эфиром, содержит большую долю карбоксильных групп. Качественный состав этого образца представлен фенольными компонентами трех типов - с рКа = 5.1, 6.6 и 8.8.

В основе раздельного определения констант ионизации тех или иных функциональных групп методом спектрофотометрического титрования лежит выбор длины волны, соответствующей максимуму экстинкции ионизированного состояния определяемой группы. Выбор аналитических длин волн по дифференциальному УФ-спектру, соответствующему конечной точке титрования смеси слабых кислот, не позволяет иметь полное представление обо всех типах кислых групп, присутствующих в ЭЭП. На наш взгляд, решением этой проблемы являяется анализ динамики изменений дифференциального УФ-спектра ЭЭП при изменении рН.

Дифференциальные УФ-спектры ЭЭП, представленные на рис. 4, представляют собой разницу между поглощением раствора с порцией титранта (в данном случае щелочи) и исходного раствора. В качестве конечной точки титрования был выбран рН = 12.2, поскольку прирост оптической плотности становится незначительным при дальнейшем титровании. Следовательно, можно предположить, что подавляющая часть фенольных гидроксильных групп находится в ионизированном состоянии при этом значении рН.

На дифференциальном УФ-спектре ЭЭП (рис. 4) при рН = 12.2 присутствуют три максимума: 245, 300, 335 нм.

Интенсивность полос поглощения при 245 и 300 нм увеличивается при росте рН во всем его диапазоне. Что же касается полосы поглощения 335 нм, то наиболее интенсивный рост оптической плотности наблюдается в диапазоне рН от 8-10.

УФ-спектр такой сложной смеси как растительный экстракт представляет собой суперпозицию значительного числа полос поглощения индивидуальных компонентов. Дифференциальная УФ-спектроскопия позволяет выделить полосы поглощения компонентов, в которых ионизация функциональной группы приводит к перераспределению электронной плотности в молекуле.

Рис. 4. Дифференциальные УФ-спектры ЭЭП при различных рН в ходе титрования

Характерной особенностью веществ фенольной природы является рост оптической плотности при ионизации гидроксильной группы в области 240-250 нм [5].

Титрование с регистрацией оптической плотности при 245 нм позволило рассчитать рК-спектр соединений с фенольной гидроксильной группой, поглощающих при этой длине волны. Вклад каждой группы соединений в прирост оптической плотности определяется не только мольными концентрациями, но и их коэффициентами экстинкции при той или иной длине волны. Неопределенность коэффициентов экстинкции каждой из групп соединений затрудняет количественную интерпретацию полученных данных, поэтому в отношении рК-спектров, полученных спектроскопическим титрованием, мы ограничились качественной оценкой.

Следующий максимум на дифференциальном спектре (рис. 4) при 300 нм также характерен для фенольных соединений [5]. Он является более предпочтительным в качестве анналитической длины волны, поскольку близость изобестической точки гипсохромного сдвига карбоксилов при 303 нм исключает их влияние на прирост оптической плотности в этой области, как это будет показано ниже. Максимум при длине волны 335 нм образован иониизацией компонентов с рКа = 8.4 и 9.5.

Возможно, здесь проявляются фенольные структуры с более высокой степенью сопряжения р-связей. Максимум на дифференциальном спектре в области 335 нм при титровании до рН = 12 характерен для ряда флавоноидов, например константы ионизации кверцетина, определенные в работе [6] спектрофотометрическим методом составляют 8.5, 9.3 и 11.1. Следует отметить, однако, что четкое разделение фенольных компонентов на группы в зависимости от диапазона поглощения на УФ-спектре не представляется возможным, поскольку полосы поглощения в значительной степени перекрываются. Тем не менее, спектро-фотометрическое титрование подтверждает фенольную природу кислых групп в ЭЭП с рКа от 6 до 11.

В табл. 2 представлены значения констант ионизации фенольных гидроксильных групп ЭЭП, а также ?D - вклад соответствующих групп в прирост оптической плотности. Константы рассчитаны методом рК-спектроскопии по кривым спектрофотометрического титрования (нижние индексы величин pKa и ?D относятся только к этой таблице).

Следует отметить удовлетворительную сходимость величин рКа фенольных компонентов ЭЭП, определенных потенциометрическим и спектрофотометрическим титрованием.

Таблица. 2. Кислотность ЭЭП в водной среде по данным спектрофотометрического титрования

Рис. 5. Дифференциальные УФ спектры водного раствора ЭЭП в диапозоне рН от 3.8 до 6.0

Рис. 6. Кривые спектрофотометрического титрования ЭЭП при л = 275 и 322 нм

природный эмульсионный экстракт

Изучение динамики дифференциальных УФ спектров (рис. 4), снятых после каждого добавления титранта, позволило выявить, что ионизация кислых групп с рКа = 4.6 сопровождается гипсохромным сдвигом из области 322 нм в область 275 нм (рис. 5). Характерным признаком гипсохромного сдвига является наличие изосбестической точки при 303 нм. Полоса 275 нм в УФ спектре является результатом локального возбуждения фенильного ядра в результате более сильного отрицательного мезомерного эффекта СОО--группы по сравнению с группой -СООН. Моделью соединений такого типа может служить бензойная кислота, рКа которой составляет 4.1. Метильные, феноксильные и некоторые другие заместители в параположении приводят к смещению рКа к 4.4-4.6.

Рис. 7. рК-спектр компонентов ЭЭП, поглощающих при 275 нм

Рис. 6 демонстрирует зависимость оптической плотности раствора от рН при длинах волн 275 и 322 нм. Как можно видеть, падение оптической плотности в области 322 нм при росте рН от 3.8 до 5.5, вызвано гипсохромным сдвигом полос поглощения карбоксильных групп.

При дальнейшем повышении рН наблюдается рост оптической плотности, обусловленный ионизацией гидроксильных групп фенольных компонентов с рКа = 6.2.

На рис. 7 представлен рК-спектр, рассчитанный на основании данных спектрофотометрического титрования при длине волны 275 нм. Спектрофотометрическое титрование при этой длине волны дает возможность определить рКа карбоксильных групп, при наличии характерного гипсохромного сдвига. Необходимо также учесть, что фенольные структуры, поглощающие в этой области, при ионизации гипсохромного сдвига не имеют.

Заключение

Использован простой в исполнении и не требующий сложного аппаратурного обеспечения метод анализа многокомпонентной смеси экстрактивных веществ пихты, основанный на потенциометрическом титровании.

В ходе исследования было определено, что в ЭЭП фенольные компоненты смеси по кислотности можно разделить на четыре типа, их константы ионизации равны 6.4, 8.3, 9.8 и 10.9. Константа ионизации карбоксильных групп ЭЭП составляет 4.6. В образце 3 отмечено присутствие еще одного типа фенольных гидроксильных групп с рКа = 8.9.

По полученным рКа спектрам определено, что содержание фенольных гидроксильных групп в эмульсионном экстракте древесной зелени пихты больше, чем карбоксильных.

Выборочный анализ дифференциальных УФ спектров с выявлением диапазонов длин волн и рН, регистрирующих ионизацию тех или иных функциональных групп, в сочетании с методом рК-спектроскопии в обработке данных титрования позволяет повысить селективность исследования кислотно-основных свойств сложных смесей слабых электролитов. Путем спектрофотометрического титрования при аналитических длинах волн, соответствующих максимумам на дифференциальном УФ спектре, возможно дифференцированное определение констант ионизации карбоксильных и фенольных групп.

Литература

1.Карманова Л.П., Кучин А.В., Королева А.А., Хуршкайнен Т.В., Сычев Р.Л. Эмульсионный способ выделения липидов. Патент РФ № 2117487. БИ 1998. №23.

2.Гармаш А. В., Устимова И. В., Кудрявцев А. В., Воробьева О. Н., Поленова Т.В. Потенциометрический анализ сложных протолитических систем методом рК-спектроскопии с использованием линейной регрессии. Журнал аналитической химии. 1998. Т.53. №3. C.241-248.

3.Рязанов М.А., Лодыгин Е.Д., Безносиков В.А. Использование метода рК-спектроскопии для оценки кислотно-основных свойств фульвокислот. Почвоведение. 2001. №11. C.1309-1315.

4.Ragnar M., Lindgren C. T., Nilvebrant N.-O. pKa-values of Guaiacyl and Syringyl Phenols Related to Lignin. Journal of Wood Chemistry and Technology. 2000. Vol.20. No.3. P.277-305.

Размещено на Allbest.ru