К вопросу о нативном содержании смоляных кислот в живицах хвойных

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Казанский государственный медицинский университет. Ул. Бутлерова, 49. г. Казань 420012. Татарстан. Россия. Тел.: (8432) 389-744.

Государственное предприятие - антидопинговый центр. Елизаветинский пер., 10. г. Москва 105005. Россия.

Калининградский государственный университет. Ул. Университетская, 2. г. Калининград 236040. Россия. Тел.: (0112) 433-707.

К вопросу о нативном содержании смоляных кислот в живицах хвойных

Племенков Виталий Владимирович,

Апполонова Светлана Александровна,

Кирлица Дарья Александровна

Е-mail: plem-mu@mi.ru

Резюме

Примечание: Биографические сведения авторов смотри в Бутлеровских сообщениях. 2003. Т.4. №2. 42. (код bch3)

УДК 547.914.2. Поступила в редакцию 25 февраля 2004 г.;

Изучен химический состав смоляных кислот живицы хвойных (Pinus sylvestris, Picea exelsa) методом газовой хромато-масс-спектрометрии с предварительной дериватизацией отобранных проб силилирующим реагентом. Установлено, что доминирующей компонентой смоляных кислот нативной живицы этих хвойных, произрастающих в Волго-Вятском и Прибалтийском регионах, является дегидроабиетиновая кислота (40-60%), что определяется, предположительно, стадией депротонирования промежуточного абиет-8,14-енил-13 катиона в процессе биосинтеза.

Ключевые слова: живицы хвойных, смоляные кислоты, химический состав, дегидроабиетиновая кислота.

смола кислота живица хвойный

Введение

Живицы хвойных растений - сосны (Pinus), ели (Picea), лиственницы (Larix), пихты (Abies) - являются богатыми источниками различных терпеноидов, главным образом, монотерпенов, сесквитерпенов и дитерпенов, последние в которых представлены набором смоляных кислот и содержание их в источниках значительно. Смоляные кислоты, всего их известно около десятка (рис. 1), относятся в основном к двум структурным типам, пимарановым и абиетановым, соотношение которых весьма различно в различных природных источниках, что очень ярко и полно отражено в обзоре 1. Только в нескольких случаях отмечено предпочтительное содержание одного-двух соединений этого типа - в соснах подрода Haploxylon доминируют абиетиновая и изопимаровая, сосны подрода Diploxylon отличаются более или менее равномерным содержанием нескольких (пять-шесть) смоляных кислот, в елях рода Picea иногда доминирует дегидроабиетиновая кислота (P.abovata - 71.0%, P.ajannensis - 48%, P.exelsa - 42% ).

Рис. 1 Смоляные кислоты: I - пимаровая, II - сандаракопимаровая, III - изопимаровая, IV - Д8,9-изопимаровая, V - абиетиновая, VI - левопимаровая, VII - неоабиетиновая, VIII - палюстровая, IX - дегидроабиетиновая, X - стробовая, XI - ламбертиновая

Используемые до настоящего времени медодики определения состава природных смоляных кислот в стандартном варианте предполагают четыре этапа - 1) сбор живицы подсочкой, 2) химическое разделение живицы на нейтральные и кислые терпеноиды, 3) получение метиловых эфиров кислот реакцией с диазометаном для улучшения их летучести, 4) ГЖХ-анализ смеси метилатов смоляных кислот 2 - которые, вместе взятые, определяют существенную удалённость результата анализа от исходного состава пробы. Другими словами, учитывая известную лабильность смоляных кислот, лёгкость их взаимопревращения, при таком методе их исследования нет уверенности в соответствии полученных данных о составе смоляных кислот, тому составу, который растением продуцируется непосредственно, т.е. их нативному составу.

Совремённое состояние техники исследования природных соединений и биохимических метаболитов открывает возможность существенного сокращения пути, от отбора пробы до её идентификации, за счёт уменьшения количества химических этапов, сокращения времени исполнения этапов и использования нейтральных реагентов. Применение хромато-масс-спектрометрии, довольствующейся пробами образца ~10 мг, позволяет практически исключить длительный процесс подсочки в её классическом варианте; а обработка цельного образца силилирующими агентами исключает этапы, связанные с выделением смоляных кислот из нативной живицы (схема 1).

1. Результаты и дискуссия

В настоящей работе мы исследовали состав смоляных кислот живицы деревьев Pinus sylvestris и Picea exelsa, отбирая пробы в три этапа: а) отбиралась стружка древесины вместе с закладкой кары, из которой всю органику экстрагировали ацетоном; б) отбирались первые капли живицы, выделившейся после закладки кары; в) отбиралась твёрдая часть живицы (галипот) через несколько дней после подсочки. Пробы были взяты в июне месяце 2003 г в лесах Волго-Вятского региона (Марийская республика) и Прибалтики (Калининградская обл.) - районов расположенных на одной широте, но существенно различающихся по климатическим параметрам.

Схема 1

Таблица 1 Распределение смоляных кислот в живицах хвойных

* пробы отобраны в Волго-Вятском регионе

Полученные нами результаты оказались более чем неожиданными (см. табл.): - во-первых, во всех случаях доминирующим соединением в пробах смоляных кислот оказалась дегидроабиетиновая кислота, содержание которой приближалось к 50% (ранее это было отмечено только для некоторых видов ели, тогда как содержание абиетиновой кислоты везде в несколько раз меньше (хотя для сосен она всегда считалась главной компонентой) 1; - во-вторых, соотношение абиетиновой и дегидроабиетиновой кислот, этих главных компонент галипота, принципиально не меняется от региона сбора проб и, что важно, принципиально близко для живиц сосны и ели; - в-третьих, переход от стружки к свежей живице и далее к галипоту не существенно отражается на распределении кислот - по-прежнему дегидроабиетиновая кислота главная, и наблюдается даже тенденция к увеличению её сдержания, заметно уменьшение количества пимаровой кислоты, изопимаровая кислота не реагирует на этот переход.

С целью проверки объективности результатов, полученных по нашей методике, мы исследовали пробы абиетиновой кислоты, полученные классической перекристаллизацией галипота сосны, еловой серки и технической канифоли 3, методом хромато-масс-спектрометрии с предварительным силилированием. Состав оказался практически идентичным (~75% абиетиновой кислоты, ~15% дегидроабиетиновой кислоты, ~8% пимаровых кислот), что соответствует данным справочников Аldrich и Acros по содержанию абиетиновой кислоты.

Таким образом, мы обнаружили, что нативный химический состав смоляных кислот сосны и ели практически идентичен и главным их признаком можно считать доминирующее содержание дегидроабиетиновой кислоты.

Неожиданно большое содержание дегидроабиетиновой кислоты в нативных образцах живиц сосны обыкновенной и ели европейской, на первый взгляд, оказываются весьма ожидаемыми после анализа схемы биосинтеза дитерпенов пимаран-абиетановой структуры 4, согласно которой циклизация геранилгеранилпирофосфата (GGPP) по типу В (карбокатион генерируется присоединением протона по концевой олефиновой связи) приводит к копалилпирофосфату с последующей циклизацией уже по типу А (карбокатионный центр высвобождается при элиминировании пирофосфат аниона), до пимарадиена. На следующем этапе биосинтеза в условиях кислого катализа пимарадиен перегруппировывается в соединения абиетановой структуры, где ключевым интермедиатом является абиет-8,14-ен-13-ил катион. Депротонирование последнего равновероятно из положений 7-, 9-, 11-, 15- и приводит к соответствующим абиетадиенам с равной вероятностью (схема 2), что было подтверждено исследованием циклизации GGPP катализируемой абиетадиен синтазой, выделенной из пихты Abies grandis 5.

Интересный, сам по себе, факт стабильного содержания изопимаровой кислоты в процессе формирования комплекта смоляных кислот, сравнительно с содержанием пимаровой кислоты (см. табл.), логично укладывается в выше описанную схему - поскольку перегруппировка пимарадиенов в абиетадиены протекает через стабилизированный аллильный интермедиат, тогда как аналогичная перегруппировка, исходя из изопимарадиенов, требует несопряжённого, менее благоприятного, карбокатионного переходного состояния.

Схема 2

Если на первом, выше описанном этапе формирования пимаран-абиетанового скелета этих дитерпенов, процесс биосинтеза контролируется ферментами циклазами 4, то на следующем этапе - этапе их функционализации, включаются в работу ферменты окислительного характера - оксидазы, преобразующие одну из гемдиметильных групп в карбоксильную функцию. Такие функции скорее всего могут выполнять цитохромы Р-450, или подобные им нон-гем Fe-содержащие энзимы, известные своей способностью гидроксилировать и дегидрировать углеводородные радикалы разного типа 6. На этом этапе биосинтеза смоляных кислот, наряду с гидроксилированием указанной метильной группы до карбоксильной, с большой вероятностью должен совершаться процесс дегидрирования тех абиетадиенов, которые ведут к формированию ароматического цикла дегидроабиетиновой кислоты. Из схемы 2 видно, что таковой способностью будут обладать, в первую очередь, абиетадиены XIII и XIV, в некоторой степени абиетадиен XV, и с наименьшей вероятностью абиетадиен XII, что в итоге и определит доминирующее содержание дегидроабиетиновой кислоты и её трёхкратное превосходство относительно абиетиновой кислоты в нативной живице изученных нами хвойных, а возможно и хвойных вообще (схема 3).

Схема 3

Присутствие в живицах указанных окислительных ферментов, скорее всего, является причиной потери дегидроабиетиновой кислоты по ходу разработки сырья, всегда связанной с достаточно длительным контактом с кислородом воздуха, а для Fe-содержащих оксидаз способность окислять ароматические циклы до фенольных и последующих метаболитов хорошо известна 6. По этой причине, становится понятным экспериментальный факт выделения абиетиновой кислоты как основной компоненты при препаративной классической разработке живицы и продуктов её технической переработки. Следует заметить, что выход абиетиновой кислоты обычно не превышает 30%, что также находится в согласии с нативным составом смоляных кислот, определённом нами в настоящем исследовании. При этом, следует учесть, что в процессе переработки живицы и галипота используются минеральные кислоты, которые способствуют взаимным переходам смоляных кислот и могут несколько повышать содержание абиетиновой кислоты, например, за счёт изомеризации неоабиетиновой и левопимаровой кислот.

Заключение

В связи с выше изложенным, примечательно отметить хорошо доказанный факт участия дегидроабиетана 7 в качестве последнего безкислородного углеводорода на одной из ключевых позиций в биосинтезе гинкголидов, этой замечательной группы дитерпеновых трилактонов. Здесь также отмечена ведущая роль цитохромов Р-450 на окислительных стадиях метаболизма дегидроабиетана 8, что, в свою очередь, может служить основанием для предположения и о месте этого углеводорода в биосинтезе смоляных кислот. Скорее всего, ароматическая структура дегидроабиетиновой кислоты формируется ранее процесса окисления метильной группы до карбоксильной.

Экспериментальная часть

Методика микроподсочки. Верхнюю часть коры снимали (румянка) непосредственно перед закладкой карры на небольшом участке ствола дерева, приблизительно 5х10 см, после чего выборкой делали нисходящий надрез (1х3 см), в нижней части которого крепили металлическую пробирку. Всю карру и вход в пробирку-приёмник закрывали скотчем, так чтобы не было препятствий стоку живицы.

Методика пробоподготовки. Отобранные образцы были растворены в 3 мл ацетона, после чего 1 мкл раствора поместили в пробирку и упарили досуха. К сухому остатку добавили 50 мкл дериватизирующей смеси, MSTFA/NH4J/DTTT (MSTFA - N-триметилсилил-N-метилтрифторацетамид, DTTT - 1,4-дитиотреитол), после чего смесь нагревали при 70о C в течение 40 мин. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь исследовали методом хромато-масс-спектрометрии.

Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на газовом хроматографе фирмы “Agilent Technologies“ (CША) модели 6890N с масс-селективным детектором модели 5973N в следующих условиях: колонка - кварцевая капиллярная HP-5MS (12.5м х 0.2 мм); температура инжектора - 280о С, температура интерфейса детектора - 300о С; начальная и конечная температуры термостата колонки - 190 и 300о C, соответственно; температура колонки изменялась со скоростью 10 град/мин; газ-носитель - гелий. Пробу вводили с делением потока (10:1). Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Детектирование проводили в режиме регистрации по полному ионному току. Вещества в представленных образцах регистрировали в виде триметилсилильных производных. Полученные масс-спектры сравнивали с библиотечными масс-спектрами (библиотека WILEY 7N.L и NISTO 2.L).

Литература

1. Пентегова В.А., Дубовенко Ж.В., Ралдугин В.А., Шмидт Э.Н. “Терпеноиды хвойных растений“. Новосибирск: Наука. 1987. 96с.

2. Шмидт Э.Н., Дубовенко Ж.В., Колосенкова А.В., Пентегова В.А. Изв. СО АН СССР. 1977. Nо.9: Сер.хим.наук. Вып.4. С.140-143.

3. Ломбар Р. “Канифоль и её производные“ из “Химия лаков, красок и пигментов“ под ред. Шампатье Г. и Рабатэ Г. М. 1960. С.518-576.

4. J. McMillan, M.H.Beale. “Diterpene Biosynthesis“ in Comprehensive Natural Products Chemistry. Ed. D. Barton, K. Nakanishi. 1999. V.2. “Isoprenoids Including Carotenoids and Steroids” Ed. D.E. Cane. Р.217-243.

5. R.J. Peters, J.E. Flory, R. Jetter, M.M. Ravn, H-J. Lee, R.M. Coates, R.B. Croteau. Biochemistry. 2000. V.39. No.50. P.15592-15602.

6. M. Akhtar, J.N. Wright. Natural Product Reports. 1991. V.8. No.6. P.527-551.

7. W. Eisenreich, M. Schwarz, A.Cartayrade, D. Arigoni, M.H. Zenk, A. Bacher. Chemistry and Biology. 1998. V.5. No.9. P.R221-R233.

8. M. Schwarz, D. Arigoni, “Ginkgolide Biosynthesis“ in Comprehensive Natural Products Chemistry. Ed. D. Barton, K. Nakanishi. 1999. V.2. “Isoprenoids Including Carotenoids and Steroids“ Ed. D.E. Cane. P.367-400.

Размещено на Allbest.ru