Исследование процесса инактивации иммобилизованного ферментного комплекса в различных средах

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Успехи в области энзимологии сделали многие ферменты доступными для применения в медицинской практике в виде водных растворов. Водорастворимые протеолитические ферменты применяют для удаления гнойных масс и некротических тканей с раневых поверхностей.

Однако протеолитические ферменты нестабильны в водных растворах, проявляя специфическую активность лишь в течение 1-2 часов, растворимые протеазы, попадая в кровь, вызывают аллергические реакции [1, 2]. Кроме того, эта форма ферментного препарата не всегда удобна при лечении ран либо ожогов, так как требует частой смены повязок.

Существует технологическое решение проблемы - это получение более стабильных модифицированных форм ферментов. Модификация является единственным реальным методом придания нативным ферментам и, соответственно, препаратам на их основе таких свойств, которые позволяют расширить их клиническое применение и способы введения в организм.

Современные полимерные раневые покрытия с биологически активными веществами (БАВ) отличаются от традиционных текстильных материалов и представлены гидроколлоидами, пленками, пленкообразующими композициями и другие.

Эффект пролонгирования достигается также путем использования мазевых форм иммобилизованных ферментов. Поскольку в настоящее время установлено, что процесс репарации раны является ферментативным с необходимым присутствием влажной среды, актуальна разработка нерастворимых в физиологических условиях полимерных гидрогелевых покрытий с иммобилизованными протеолитическими ферментами Последние способны размягчать и лизировать некротические образования, обладают антимикробной активностью и охлаждающим действием, хорошо моделируются и не травмируют рану, позволяют визуально контролировать ее состояние.

Выбор метода иммобилизации базируется на сведениях о химической структуре фермента или БАВ, физико-химических свойствах матрицы. При иммобилизации фермента в полимерные матрицы (гидрогели). возможно образование как ковалентной связи, так и не валентных взаимодействий между функциональными группами (амино-, карбоксильными, гидроксильными, сульфгидрильными, оксифенильными) боковых цепей аминокислот, стабилизирующих молекулы белка, и молекулами носителя. При этом дозировка активного компонента, десорбируемого из материала, должна быть такой, чтобы не последовала негативная ответная реакция организма и длительно поддерживалось необходимое лечебное воздействие [3]. полимерный термопрофиль ферментный

Одним из требований, предъявляемых к полимерным системам, используемым в качестве носителей БАВ, является сохранение их активности и после процесса иммобилизации под воздействием рН среды, температуры, ингибиторов, после процесса стерилизации. Наиболее часто изменение некоторых свойств фермента, наблюдаемое после иммобилизации, объясняют изменением конформации молекулы фермента по сравнению с нативной, изменением микроокружения белковой молекулы [4].

Сложность задачи иммобилизации ферментов заключается в том, что особенности, связанные с индивидуальностью строения белковых молекул (для них характерны уникальная аминокислотная последовательность, пространственная конформация, а для ферментов - и строение активного центра), не позволяют точно сказать, каким образом изменятся свойства фермента.

Поэтому при решении задачи стабилизации определенного фермента возникает необходимость оптимизации процесса: увеличение жесткости не должно быть чрезмерным, иначе произойдет инактивация; при включении фермента в носитель могут возрастать стерические препятствия для взаимодействия с субстратом, а также диффузионные затруднения обмена реагентами между средой и катализаторами в слишком плотных средах.

В случае полимерных систем для энзимотерапии гнойных ран, медико-биологические испытания показали [5], что для эффективности их действия in vivo необходимо наличие лабильной химической, например ионной, связи между матрицей и ферментом или механическое включение в полимерную матрицу.

В результате иммобилизации на носителе фермент оказывается прочно фиксированным в новой для него химической среде. Эта среда может существенно отличаться от природной среды, окружающей фермент в клетке. Это отражается на параметрах ферментативной реак-ции: под влиянием носителя изменяются локальные концентрации субстрата, ионов водорода, а также кофакторов.

Для всех ферментов скорости реакций в той или иной степени зависят от концентрации ионов водорода. Заряженные носители могут электростатически влиять на концентрацию протонов в области активного центра фермента и тем самым изменять скорость реакции.

Разноименные заряды на носителе и субстрате увеличивают скорость реакции, катализируемой иммобилизованными ферментами, одноименные заряды ее снижают и могут быть причиной полной потери активности препарата. Заряды носителя и субстрата влияют также на величину рН, при которой скорость ферментативной реакции максимальна [6].

Важную роль играет распределение субстрата между фазами иммобилизованного фермента и раствора. Ограниченная доступность субстрата к активному центру фермента может привести к изменению специфичности последнего. Особенно это характерно для высокомолекулярных субстратов, которые из-за малого коэффициента диффузии медленно переходят в фазу иммобилизованного фермента, что приводит к относительному увеличению скоростей других реакций с участием субстратов меньших размеров.

В связи с этим интересно было проанализировать процесс иммобилизации протеолитического фермента террилитина в полимерную матрицу под воздействием ионизирующего излучения и исследовать фармакокинетические и физико-химических свойства разработанного гидрогелевого покрытия, в частности установить сохранение активности фермента после иммобилизации под воздействием гамма-лучей, установить температурный и рН оптимум.

Гидрогель, содержал поливинилпирролидон, полиэлектролит (альгинат натрия), в качестве носителя - производные целлюлозы, с включенным протеолитическим ферментом - террилитином - ферментный препарат протеолитического действия, является продуктом жизнедеятельности плесневого гриба Aspergillus terricola.

Представляет собой комплекс гидролитических ферментов, содержащий три белковых компонента (протеазы I, II, III), обладающих протеолитической активностью, и один амилолитический компонент.

При этом требуемая доза облучения составляла 15±5кГр, при поглощении которой облучаемым материалом, его нагрев происходит всего на 5-6 градусов и достигается необходимая стерильность готовой полимерной матрицы.

Экспериментальная часть.

Для получения гидрогелей были приготовлены водные растворы полимеров (по методике последовательного ввода компонентов) содержащие фибринолитический энзим террилитин.

Облучение приготовленных образцов проводили на г-установке РХМ-г-20 при температуре 20 єС, доза 15 кГр.

Мощность поглощенной дозы излучения на установке К-120.000 по дозиметру Фрике составляла 0.18 Гр/с. Для пересчета поглощенной дозы излучения от ферро - сульфатного дозиметра на иссле-дуемую систему использовали соотношение:

Рсист. = К * Рдоз,

где:

Рсист - мощность дозы, поглощенная исследуемым образцом, кГр/ч;

Рдоз - мощность дозы, поглощенная дозиметром, кГр/час; к - коэффициент пересчета.

Мощность дозы, поглощенная исследуемыми образцами:

Рсист. = К * Рдоз = 0.98 * 0.648 = 0.635 кГр/ч

Активность террилитина определяли по модифицированному методу Кунитца. Модифицированный метод с применением субстрата казеина основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза субстрата под действием исследуемых протеолитических ферментов. В качестве субстрата использовали 2% раствор казеина в 0.2 М растворе фосфатного буфера при рН 8.0. Субстрат перемешивали на магнитной мешалке до полного растворения при комнатной температуре. Раствор казеина хранили при температуре 5-7 єС не более 10 дней в темноте.

Перед анализом рН раствора казеина доводили до значения 8.0 концентрированным раствором гидроксида натрия. Также был определен коэффициент микромолярной экстинкции тирозина Кт составлял 1.186. Активность определяли через трое суток после иммобилизации и облучения.

Для определение зависимости протеолитической активности террилитина от рН среды в качестве субстрата использовали 2% раствор казеина в 0.2 М растворе фосфатного буфера при различных рН (5.6-8.8). Аналогичные операции проводили при различных температурах (37-60 оС).

Результаты и их обсуждение

Зависимость каталитической активности фермента от температуры выражается типичной колоколообразной кривой. До значения температуры около 50 °С каталитическая активность растет, причем на каждые 10 °С примерно в 2 раза повышается скорость преобразования субстрата (этот закон справедлив только до температуры денатурации белка). В то же время постепенно возрастает количество инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части. При температуре выше 50 °С денатурация ферментного белка резко усиливается и, хотя скорость реакций преобразования субстрата продолжает расти, активность фермента, выражающаяся количеством превращенного субстрата, падает.

Рис. 1. Зависимость протеолитической активности иммобилизованного террилитина (С = 5 мг/мл) от температуры

Полученные данные о действии температуры на иммобилизованный террилитин приведены на рис. 1-2. Как видно из представленных графиков, иммобилизованный фермент является более стабильным препаратом по сравнению с нативным. Температурная зависимость активности фермента, иммобилизованного на полимерном носителе, сохраняет коло-колообразный вид, характерный для большинства ферментов, однако отмечается, что иммо-билизация приводит к деформации термопрофиля активности и расширению температурного оптимума препарата, что предполагает его меньшую склонность к инактивации в более широком диапазоне температур.

Рис. 2. Зависимость протеолитической активности иммобилизованного террилитина (С = 10 мг/мл) от температуры

Следует отметить, что наибольшая термостабилизация фермента происходит в композиции с альгинатом натрия, что может быть вызвано увеличением жесткости связывания фермента с полимерной матрицей. В присутствии полиэлектролита происходит изменение кинетической подвижности связанных макромолекул белка, возрастает роль диффузионного фактора, фермент стабилизируется, вследствие чего формируется наиболее термодинамически выгодная структура террилитина, образующая фермент-субстратный комплекс.

Согласно полученным данным (рис. 1-2), при увеличении содержания фермента в препарате не происходит существенных изменений в скорости инактивации террилитина при раз-личных температурах, что может свидетельствовать об отсутствии инактивации белковой молекулы, которая может происходить в результате автолиза.

Влияние изменений рН среды на активность фермента.

Влияние изменений рН среды на молекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина, NH2-группы лизина и другие).

Из полученных данных видно, что рН-оптимум террилитина лежит в пределах физиологических значений (рис. 3).

При резких сдвигах от оптимума рН среды террилитин подвергается конформационным изменениям, приводящим к потере активности вследствие денатурации или изменения заряда молекулы фермента. При разных значениях рН среды активный центр может находиться в частично ионизированной или неионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно на формировании активного фермент-субстратного комплекса.

Экспериментальные исследования показали расширение pH-профиля действия фермента после его иммобилизации. Полученные зависимости (рис. 4) демонстрируют повышение уровня активности по сравнению с нативным террилитином в интервале рН 6-7.5, характерном для гнойных ран, причем рН гнойно-некротической раны в начальной стадии заживления может уменьшаться до значения около 5.5, а по мере заживления раны это значение повышается до 7.2 (рН нормальной соединительной ткани). Для концентрации фермента 10 мг/л, наблю-далась аналогичная зависимость.

Рис. 3. Зависимость протеолитической активности свободного террилитина от рН

Рис. 4. Зависимость относительной активности иммобилизованного террилитина от рН

Таким образом, иммобилизация фермента приводит к таким конформационным и электростатическим изменениям в окружении активного центра, при которых скорость образования фермент-субстратного комплекса значительно повышается по сравнению с нативным ферментом при рН, меньшем рН-оптимума.

Выводы:

1. Проанализирован процесс иммобилизации протеолитического фермента террилитина в полимерную матрицу под воздействием ионизирующего излучения и исследованы некоторые физико-химических свойства.

2. Эксперимент показал расширение pH-профиля действия фермента после его иммобилизации. Полученные зависимости демонстрируют повышение уровня активности по сравнению с нативным террилитином в интервале рН 6-7.5, характерном для гнойных ран.

3. Доказано что иммобилизация ферментного комплекса приводит к деформации термопрофиля активности и расширению температурного оптимума энзимного препарата, что предполагает его меньшую склонность к инактивации в более широком диапазоне температур и стабильность лекарственной формы в целом.

Литература

1. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология. М.: Академия. 2005. 480с.

2. Зефиров Н.С. Химическая энциклопедия. М.: Большая Российская энциклопедия. 1995. 641с.

3. Pinto Reis Catarina, J. Neufeld Ronald, J. Ribeiro Antonio, Veiga Francisco. Biomedical applications and current status of peptide and protein nanoparticulate delivery systems. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 2002. No.2. Р.53-65.

4. Скобелева В.Б., Руденская Г.Н., Руденская Ю.А. Изучение энзиматической активности иммобилизованной морикразы. Вестн. Моск. ун-та. Сер.2. Химия. 2000. Т.41. №6. С.395-398.

5. Зайцева Е.А., Осипова Т.А. Изучение биокатализаторов и возможностей их практического использования в рамках федеральной целевой научно-технической программы России «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники». Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 2006. Т.47. №1. С.4-14.

6. S.A. Costa, S. Azevedo Helena, and Rui L. Reis Enzyme Immobilization in Biodegradable Polymers for Biomedical Applications. Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2004. No.5. Р.301-324.

Размещено на Allbest.ru