Исследование изменений на поверхности клеток E. coli lum+ под влиянием сверхвысокочастотного излучения миллиметрового диапазона

Полная исследовательская публикация ______ Кузнецов Д.Б., Лунегов И.В., Вольхин И.Л., Гейн В.Л.,

Несчисляев В.А. и Широких А.А.

Размещено на http://www.allbest.ru/

54 _______________ http://butlerov.com/ _____________ ©--Butlerov Communications. 2013. Vol.36. No.12. P.53-58.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Исследование изменений на поверхности клеток E. coli lum⁺ под влиянием сверхвысокочастотного излучения миллиметрового диапазона

Исследования влияния миллиметрового СВЧ-излучения низкой интенсивности на живых объектах начались почти сразу после появления генераторов электромагнитных волн указанного диапазона [1]. В работе [4] показано, что использование данного диапазона в промышленности для стимуляции биотехнологических процессов является перспективным, но мало изученным.

Наши предыдущие исследования показали, что индикаторный штамм Escherichia coli lum⁺ чувствителен к воздействию на него миллиметровым СВЧ-излучением низкой интенсивности [2]. В ходе эксперимента было установлено, что уровень биолюминесценции зависит от времени экспозиции. Полученные экспериментальные данные были интерпретированы с использованием современной фазовой теории [9], являющейся частным случаем химии поверхностей.

В работах [3-5] показан механизм поглощения электромагнитного излучения первичным акцептором - околоповерхностными слоями молекул воды на гидрофильных поверхностях.

Целью настоящей работы является исследование изменений адгезионных свойств поверхностей клеток штамма E. Coli lum⁺ для подтверждения правомерности заключения о влиянии СВЧ-излучения на толщину адсорбированного слоя молекул воды на их поверхности.

Согласно современной фазовой теории поглощенная порция энергии увеличивает дипольный момент молекул, что в свою очередь приводит к запуску цепных реакций между адсорбированными и неадсорбированными молекулами воды. В результате увеличения дипольного момента адсорбированных молекул, происходит увеличение толщины адсорбированного слоя и частичная диссоциация молекул воды с вытеснением освободившихся протонов за пределы слоя [8].

Основным компонентом любого живого организма являются молекулы воды, эти молекулы имеют различные дипольные моменты, изменяющиеся во времени и пространстве.

Это приводит к появлению неоднородностей электронных плотностей, сопровождающиеся усилением или снижением сил диполь-дипольного взаимодействия.

Молекулы воды, адсорбировавшись на гидрофильной поверхности имеют больший дипольный момент, чем молекулы воды, находящейся в неадсорбированной фазе. Поэтому молекулы адсорбированного слоя притягивают к себе не адсорбированные молекулы воды, образуя все новые и новые динамичные слои. Как было показано в работе [10] адсорбированные слои на гидрофильной поверхности в модельных экспериментах могут достигать толщины до сотен мкм.

Для подтверждения правомерности использования современной фазовой теории при интерпретации экспериментальных данных в предыдущих работах была исследована поверхность бактериальных клеток E. coli lum⁺ до и после облучения СВЧ-излучением.

С помощью атомно-силовой микроскопии проведены измерения силы адгезии на поверхности клеток до и после воздействия на них СВЧ-излучением миллиметрового диапазона низкой интенсивности при различном времени экспозиции.

В воздушной атмосфере поверхность клетки покрыта адсорбционным слоем воды толщиной в несколько нм, этот водный слой смачивает кончик зонда и формирует «мостик» между зондом и образцом. Для разрыва этого мостика требуется существенная сила, обусловленная преодолением поверхностного натяжения. Сила адгезии показывает, насколько сильно прилипает зонд к поверхности. Чем сильнее зонд вязнет в приповерхностных слоях, тем боль-ше межмолекулярное взаимодействие между исследуемой поверхностью и поверхностью зон-да. Это означает, что сила адгезии прямо пропорциональна количеству молекул и их дипольному моменту, взаимодействующих с зондом, и соответственно, прямо пропорциональна толщине жидкой фазы околоповерхностного пространства.

Подготовка проб. Подготовка к проведению измерений включала регидратацию и приготовление рабочего разведения лиофилизированного индикаторного штамма люминесцентных бактерий (проба) E. coli lum⁺ с помощью воды очищенной имеющей рН 7.0±0.2 и охлажденной до температуры (6±2)°С.

Затем разведенную индикаторную культуру выдерживали не менее 30 мин при температуре (22±2)°С и разливали в пробирки для центрифугирования.

Очистку бактериальной суспензии от защитной среды проводили путем центрифугирования на центрифуге лабораторной медицинской ОПН-8-10 четыре раза по 10 мин на скорости вращения 2000 об/мин. Очищенную суспензию разливали в полимерные пробирки прозрачные для СВЧ-излучения и облучали. После обучения суспензию микроорганизмов объемом 10 мкл изымали из пробирок и помещали на предметное стекло. С помощью центрифуги SPIN12000 (Midas) суспензию микроорга-низмов распределяли по поверхности стекла, после чего помещали в камеру атомно-силового микро-скопа.

Экспериментальная установка для облучения проб. Схема экспериментальной установки для облучения проб на длине волны л = 8.14 мм показана на рис. 1.

электромагнитный адгезия бактериальный

Рис. 1. Схема установки для облучения проб на л = 8.14 мм

Источником СВЧ-излучения служил генератор Г4-156 на диоде Ганна 1, обеспечивающий генерацию плоскополяризованного излучения с л = 8.14 мм мощностью порядка 20 мВт в режиме непрерывной генерации. СВЧ-сигнал с генератора через развязывающий ферритовый вентиль 2, аттенюатор 3, согласующий Е-Н трансформатор 4 поступал на рупорную СВЧ-антенну 5 с раскрывом прямоугольной формы 72Ч34 мм. Линза 6 формировала пучок СВЧ-излучения и направляла его на полимерную (полиэтиленовую) пробирку круглого сечения с пробой, установленную на пенопластовой подставке 7, прозрачной для СВЧ-излучения.

Диэлектрическая линза 6 формировала плоскопараллельный пучок СВЧ-излучения (волна Н₁₀). Вектор напряженности электрического поля был ориентирован вертикально. Сечение СВЧ-пучка на уровне половинной мощности и пробирка с пробой представлены в левой части рис. 1. Суммарные потери энергии: потери в антенно-волноводном тракте, рассеяние за пределами сечения на уровне половинной мощности и отражение от поверхности полимерной пробирки составляли порядка 30% генерируемой мощности, таким образом поток мощности СВЧ-излучения, воздействовавший на исследуемую пробу составлял порядка 0.4 мВт/см². Расстояние от раскрыва антенны до центра пробирки составляло 38 см.

Атомно-силовая микроскопия. Атомно-силовую микроскопию проводили на Интегра Прима - НаноЛаборатория (NT-MDT). Сканирование осуществляли контактным методом постоянной силы, с использованием CSGiO кантилевера с жесткостью 0.03 N/m; радиус кантилевера L = 10 нм.

При атомно-силовой микроскопии измеряли силу адгезии F_а.

F_a = k·ДZ,

где k - жесткость кантилевера, ДZ - разность высоты кантилевера в момент соприкосновения с исследуемым образцом и в момент отрыва от исследуемого образца.

При очистке бактериальной суспензии от защитной среды 4-кратным центрифугированием сформировано 3 группы исследуемых образцов: 1 - контроль, 2 - время экспозиция 20 минут, 3 - время экспозиции 60 минут.

Проведенная атомно-силовая микроскопия показала, что излучение по-разному влияет на отрыв зонда при обратном движении сканера (рис. 1) и адгезию поверхности клеток E. coli lum⁺ (рис. 2) в зависимости от времени экспозиции.

Показано, что при времени экспозиции 60 мин. (рис. 1, ряд 3) величина начального уровня сигнала (ось Y рис. 1) и высота отрыва кантилевера (ось X рис. 1) меньше, чем при 20 минутной экспозиции (рис. 1, ряд 2) и в контрольных образцах (рис. 1, ряд 3). Это говорит о том, что сила, которая удерживает кантилевер в пробах зависит от того, сколько времени находилась проба под воздействием СВЧ-излучения.

Обнаружено, что при 20-ти минутной экспозиции СВЧ-излучением миллиметрового диапазона низкой интенсивности сила адгезии F_a снижается с 7.17^-9 до 2.78^-9H (рис. 2, точка 2), а при 60 минутной экспозиции F_a снижается до 1.63 Н (рис. 2, точка 3).

Рис. 1. Отскок кантилевера на поверхности клетки E. coli lum⁺. 1 - контрольная проба, 2 - проба, подвергшаяся облучению в течение 20 мин., 3 - проба, подвергшаяся облучению в течение 60 мин.

Результаты опытов показывают, что миллиметровое СВЧ-излучение, воздействуя на околоповерхностные слои молекул воды пептидов и фосфолипидных головок мембран, поглощается молекулами-акцепторами, при этом электроны молекул переходят на более высокий возбужденный уровень энергии. Это приводит к увеличению поляризации химических связей, за счет смещения электронных плотностей и изменяет (увеличивает) дипольный момент молекул.

Рис. 2. Сила адгезии на поверхности клетки E. coli lum⁺. 1 - контрольная проба, 2 - проба, подвергшаяся облучению в течение 20 мин., 3 - проба, подвергшаяся облучению в течение 60 мин.

В свою очередь изменение дипольного момента молекул и увеличение энергии в надмолекулярной системе (адсорбированных слоях на поверхности) приводят к увеличению концентрации подвижных (квазисвободных) электронов.

Эти электроны могут связываться с молекулами воды, которые еще не входят в состав адсорбированной фазы. Связывание новых молекул приводит к еще большему увеличению энергии системы. Избыточная энергия надмолекулярной системы приводит к увеличению асимметрии распределения положительных и отрицательных зарядов, что является пусковым механизмом увеличения диссоциации молекул воды H₂O - H⁺ + OH^- и увеличением концентрации H⁺ за пределами надмолекулярных ассоциатов в жидкой фазе.

Однако благодаря способности протона «перескакивать» с одной молекулы на другую, правильнее записать уравнение диссоциации в следующем виде H₂O + H₂O - H₃O⁺ + OH.

Данное утверждение подтверждено экспериментально группой ученых из факультета биоинженерии Вашингтонского университета [8]. Все вышеописанные процессы, происходящие в жидкой и адсорбированной (квази-кристаллической) фазах под воздействием электро-магнитного поля вызывают миграцию электрического заряда, который при наложении на него поля генерирует электрический ток [7]. Вероятно, генерируемое напряжение достаточно для запуска новой диссоциации молекул воды, таким образом, процесс становится самоподдерживающимся.

Когда клетки находятся в оптимальной жидкой питательной среде, часть энергии электромагнитного излучения сохраняется в виде увеличивающихся адсорбированных слоев молекул воды на гидрофильной поверхности и увеличенного градиента концентрации протонов за пределами адсорбированных слоев.

Однако это состояние неустойчиво и при внешнем воздействии или смене среды происходит десорбция молекул воды с поверхности и энергия системы в целом снижается.

Квазисвободные электроны молекул воды с возбужденного метастабильного состояния начинают переходить в стабильное, что сопровождается индуцированными квантовыми пере-ходами. Таким образом, система компенсирует избытки энергии в связях и молекулы воды десорбируются с поверхности, что сопровождается выделением энергии в виде теплового движения молекул.

Рис. 3. Клетка E. coli lum⁺, подвергшаяся СВЧ-излучению в течение 60 мин

Рис. 4. Поверхность бактериальной клетки E. coli lum⁺ подвергшейся облучению 60 мин

При этом, чем больше система поглотила энергии, тем больше она её потом потеряет, что и было обнаружено в ходе эксперимента. В данном случае потеря энергии произошла в процессе пробоподготовки образцов. Десорбция молекул воды с поверхности уменьшает толщину слоя адсорбированной фазы на поверхности клеток и уменьшает силу адгезии.

Из рис. 2 видно, что как 20-ти, так и 60-ти минутная экспозиция приводят к снижению силы адгезии по сравнению с контрольной пробой.

На рис. 3, 4 изображены 2D изображения, на рис. 5, 6 - 3D-сканы поверхностей клеток. На рис. 3, 5 (клетки подвергшиеся СВЧ облучению в течение 60 минут) и 4 (скан поверхности в увеличенном масштабе) визуализируется складчатая структура поверхности клетки, тогда как клетки, которые не подвергались облучению гладкие и ровные (рис. 6).

Рис. 5. 3D-изображение бактериальной клетки E. coli lum⁺, подвергшейся облучению 60 мин

Рис. 6. 3D-изображение бактериальной клетки E. coli lum⁺ без облучения

Согласно проведенному исследованию поверхности клеток E. coli lum⁺ установлено, что под воздействием СВЧ-излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности изменяется сила адгезии, при этом, чем больше время экспозиции, тем меньше сила адгезии на поверхности клеток. Это означает, что СВЧ-излучение оказывает значительное влияние на толщину слоя адсорбированной воды, следовательно, и на дипольный момент адсорбированных молекул воды, что и было предсказано теорией. Таким образом, экспериментально подтверждена правомерность использования современной фазовой теории при интерпретации экспериментальных данных, полученных в исследованиях изменения свойств микроорганизмов [2, 6], подвергшихся облучению миллиметровым СВЧ-излучением.

Выводы

1. СВЧ-излучение миллиметрового диапазона низкой интенсивности существенно оказывает влияние на отскок зонда и силу адгезии поверхности клеток E. coli lum⁺.

2. При воздействии СВЧ-излучения миллиметрового диапазона изменение силы адгезии поверхности клеток E. coli lum⁺ связано с изменением толщины адсорбированных слоев моле-кул воды. Установлено, что при увеличении времени экспозиции снижается сила адгезии.

Литература

электромагнитный адгезия бактериальный

[1] Девятков Н.Д., Голант М.Б., Бецкий О.В. Миллиметровые волны и их роль в процессах жизнедеятельности. М.: Радио и связь. 1991. 168 с.

[2] Кузнецов Д.Б., Одегова Т.Ф., Несчисляев В.А., Гейн В.Л., Лунегов И.В., Вольхин И.Л. Исследование реакции бактериальной люминесценции под воздействием электромагнитного излучения миллиметрового и инфракрасного диапазонов. Казань. 2013. Т.36. №12. С. 8-14.

[3] Кузнецов Д.Б. Молекулярные механизмы воздействия инфракрасного излучения на микроорганизмы. Фундаментальные исследования. 2013. №4. Ч. 2. С. 414-418.

[4] Кузнецов Д.Б. Перспективы применения электромагнитных излучений крайне высокой частоты малой мощности в фармации. Фундаментальные исследования. 2012. №10. Ч. 2. С. 400-404.

[5] Кузнецов Д.Б. Физико-химические механизмы воздействия крайне-высокочастотного излучения на микроорганизмы. Современные проблемы науки и образования. 2013. №1. URL: http://www.science-education.ru/107-8226 (дата обращения: 28.01.2013).

[6] Кузнецов Д.Б., Вольхин И.Л., Лунегов И.В. Влияние СВЧ-излучения низкой интенсивности на рост штамма bifidobacterium bifidum при глубинном культивировании. Материалы краевой научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Физика для Пермского края». 2013. Вып.6. С. 137-142.

[7] Яшкичев В.И. Вода, движение молекул, структура, межфазные процессы и отклик на внешнее воздействие. М.: Агар. 1998.

[8] B. Chai, H. Yoo, G.H. Pollack. Effect of radiant energy on near-surface water. J. Phys. Chem. 2009. B.113 (42). P.13953-13958.

[9] H. Gerald. V.A. Pollack Water and the Cell etc. Shepherd Coherent Domains in the Streaming Cytoplasm of a Giant Algal Cell.

[10] J.M. Zheng, G.H. Pollack. Water and the Cell: Solute exclusion and potential distribution near hydrophilic surfaces. Springer: Netherlands. 2006. P.165-174.

Размещено на Allbest.ru