Молекулярный механизм и комплексообразование апигенина с клеточным фосфатидилхолином

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 543.42.:577.115.7. Поступила в редакцию 25 сентября 2012 г.

Молекулярный механизм и комплексообразование апигенина с клеточным фосфатидилхолином

© Насибуллин Руслан Сагитович*+, Галеева Роза Ибрагимовна,

Юсупова ЗульфияДамировна

Башкирский государственный медицинский университет. Ул. Ленина, 3. г. Уфа, 450000. Россия.

E-mail: med-fis@yandex.ru

*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку

Аннотация

Квантово-химическими методами и ЯМР 13C и 1H спектроскопией исследовано комплексообразование молекулы тригидрооксифлавона (апигенина) с клеточным фосфотидилхолином (лецитином). Показано изменение электронного строения и конформационных состояний лецитина. Определена энергия комплексообразования.

Ключевые слова: комплексообразование, флавоноиды, ЯМР-спектроскопия.

комплексообразование апигенин лецитин электронный

Флавоноиды являются биоактивными соединениями растительного происхождения, обладающими широким спектром активности. В настоящее время выделено и идентифицировано свыше 6000 молекул этого класса, причём количество их непрерывно увеличивается [1-3].

Исследователи отметили свыше 40 видов биологической активности флавоноидов [4-6]. Тем не менее в литературе содержится мало сведений о молекулярном механизме действия этой группы соединений на клеточные мембраны. Флавоноиды имеют сложное строение, обусловливающее многочисленные внутримолекулярные взаимодействия и конформационную подвижность [7].

Эта особенность строения этой группы молекул обусловливают сложный характер молекулярного механизма биологической активности этой группы соединений. Настоящее сообщение посвящено взаимодействию ,5,7 тригидрофлавона с клеточным фосфатидилхолином.

Ранее было показано, что сопряжённые системы, в частности флавоноиды, образуют комплексы с клеточными фосфолипидами посредством системы р-электронов [8, 9].

Экспериментальная часть

Взаимодействие тригидрооксифлавонола с фосфатидилхолином (лецитином) проводили методами полуэмпирической квантовой химии и ЯМР - спектроскопии на ядрах 13C и 1H. С целью установления структуры комплексов при начальных конфигурациях расположения центров молекул, составляющих комплекс квантово-химические расчёты проводились многократно, по сетке с после-дующей оптимизацией геометрии методом молекулярной механики [12]. Далее структуру и электронное строение молекул уточняли методом AM1 и DFT. Данные о структуре и электронном строении апигенина получены методом DFT.

В экспериментах использовали с фосфатидилхолин (ФХ), выделенный из куриных яиц [10], и стандартные образцы тригидрооксифлавонола фирмы «Aldrich». Очистку лецитина проводили методом колоночной хроматографии. Чистота контролировалась по спектру ЯМР и методами тонкослойной хроматографии.

При исследовании применялись растворы с концентрацией лецитина 0.005 М, а концентрацию ,5,7-тригидрооксифлавонола при этом меняли. В качестве растворителя использовали диметилформамид (ДМФА). Спектры снимали при относительно низких концентрациях лецитина и флавоноидов.

Это обусловлено тем, что, не смотря на то, что малые концентрации приводят к возрастанию времени накопления сигналов, увеличение концентрации вызывает уширение линии поглощения из-за образования мицелл, что в свою очередь приводит к уменьшению интенсивности спектральных линий.

При этом флавоноиды образуют цепочечные структуры через водородные связи - это усложняет анализ спектров ЯМР. При принятых концентрациях плато кривой титрования не достигалось.

Рисунок. Комплекс лецитина с апигенином

Значение РD среды поддерживали равным 7.1, контролировал его прибором ОР - 156/3. С точностью 0.01. При указанном значении PD зависимость ХС спектра ЯМР 13C от PD является наиболее слабой [11].

При взаимодействии ,5,7-тригидрооксифлавонола с ФХ образуются несколько разновидностей комплексов, некоторые из них формируются при связывании лецитина с различными кольцами апигенина.

Флавоноиды, в свою очередь, локализуются на нескольких точках лецитина, образуя комплексы посредством водородных связей. Именно поэтому спектры снимались в условиях, когда концентрация флавоноидов превышала концентрацию ФХ и достигала 0.02 М. Повышение концентрации лецитина относительно флавоноидов в указанных пределах не оказывало заметного влияния на значение ХС.

Спектры ЯМР 13C флавоноидов, ФХ и их смесей записывали при температуре 35^оС на спектрометре АМ-300 (Bruker, ФРГ) с рабочей частотой на ядрах 13C 75 МГц стандартными методиками. Температура исследуемых образцов поддерживалась с точностью 0.2^оС. В качестве внутреннего стандарта используем тетраметилсилан.

Длительность импульса составляла 45о, задержка между ними - 1.5 с. Число накоплений доводилось до 20000. Обеспечивая соотношение сигнал/шум не меньше 60. Накопление проводили на 64-128 к точек с шириной развертки 100-150 м.д.

В этих условиях при ширине развертки 100 м.д. на 128 к точек и времени выборки 8.65 с получается цифровое разрешение 0.06 Гц, при котором значение ХС определяется с точностью до 0.001 м.д.

На основании усреднения, полученного по нескольким измерениям ХС, можно сделать вывод о том, что достигнутая точность не менее 0.005 м.д.

Результаты и их обсуждение

Расчетные значения энергий Комплексообразования за счет формирования -связи полярной головки ФХ с кольцами А, В и С - ,5,7-тригидрооксифлавонола представлены в табл. 1.

Поэтому основное влияние в этой работе уделяется взаимодействию лецитина с этим ароматичным кольцом. Синтезу подобных пораженных соединений были посвящены некоторые работы Н.Н. Зинина [15].

Таблица 1 - Энергия комплексообразования тригидрооксифлавонола с фосфатидилхолином методом АМ1 (кДж/моль)

Как видно из таблицы, при связи лецитина с кольцом С ,5,7-тригидрооксифлавонола энергия комплексообразования максимальна.

Необходимо заметить, что энергия комплексообразования получается в расчетах, как малая разность больших величин и поэтому, определяется со значительной погрешностью.

Представленные данные носят качественный характер, однако такое соотношение величин энергий сохраняется при расчетах и другими полуэмпирическими методами, в частности методом РМ3.

Формирование комплексов лецитина с кольцом С флавоноидов сопровождается изменением ХС ядер 13C кольца С. При образовании комплекса с участием -системы электронов ХС углеродов ароматического цикла сближаются [13, 14] (табл. 2).

Таблица 2 - Конформационные изменеия при комплексообразовании

В данном случае при введении ФХ в 0.008 М растворы тригидрооксифлавонола ХС у С[16] уменьшается на и 0.006 м.д., а у С[15] увеличивается на и 0.010 м.д., соответственно. Одно-временно двойная связь С[11] - C[12] кольца С возрастает на 0.002 Е, а одиночная связь C[16] - C[11] уменьшается на 0.004 Е.

При образовании комплексов возникает изменение ХС и от углеродов холиновой группы ФХ. ХС от C[1], C[2], C[3] равный 53.473 м.д. у свободного лецитина смещается в слабое поле при формировании комплекса с тригидрооксифлавонола на 0.084 м.д.

Образование комплекса сопровождается изменением линейных углов фосфатидилхолина.

Угол О[56] - P[53] - O[52] уменьшается на 10 о, C{34] - C[33] - N[35] увеличивается на 12.

Полученные величины изменений ХС качественно согласуются с рассчитанными значениями изменения электронной плотности, если учитывается одновременно взаимодействие р - системы электронов флавоноидов с холиновой и фосфатной группами лецитина.

Во взаимодействующей системе 4',5,7-тригидрооксифлавонол - лецитин возникает значительное число комплексов, между которыми происходит быстрый обмен в шкале времени ЯМР. Поэтому метод ЯМР при указанной температуре регистрирует усредненные величины ХС.

Расчеты показали, что рассмотренные комплексы формируются за счет кулоновского взаимодействия, которое характеризуется перераспределением заряда между компонентами комплекса.

Величина переносимого заряда меняется и максимальное его значение отмечается у комплекса ФХ с циклом С 7,3',4'-тригидрооксифлавонола и составляет 0.09 а.е. Расстояния между центром ароматического кольца и атомом азота лецитина, а также между атомами H[30] - O[54] составляет 6.31 Е и 5.35 Е соответственно.

Отметим, что при использовании метода АМ1 для расчетов подобных комплексов происходит систематическое завышение длины связей [13].

Результаты квантово-химических расчетов изменения заряда, полученные для комплексов тригидрооксифлавонола с ФХ, а также спектры ЯМР на ядрах 13C позволяют предположить, что для исследованной группы молекул наиболее вероятными являются взаимодействия с -системой электронов цикла с одновременным формированием водородной связи -ОН группы кольца А с фосфатной группой ФХ. Такой комплекс является достаточно прочным и блокирует активные центры ФХ.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №40/18 I I 2009г.

Литература

1. R. Kahl. Protective a Kahl R. Protective and Adverse Biological Actions of Phenolic Antioxidants (H.Sies). London. 1991. P.245-273.

2. S.A. van Acker, D.J. van den Berg, M.N. Tromp, D.H. Griffioen, W.P. van Bennekom, W.J. van der Vijgh and A.Bast, Free Radic. Biol. Med. 1996. Vol.20. P.331.

3. C.A.Rice-Evans, N.J. Miller and G Paganga. Free Radic. Biol. Med. 1996. Vol.20. P.933.

4. R.T. Dawies, I. Moodley. Pharmacol. 1982. Vol.17. P.279.

5. E. Jr. Middelton and C. Kandaswami. The impact of plant flavonoids on mammalian biology: implications for immunity, inflammation and cancer. London. 1993. P.619-652.

6. F.V. So, N. Guthrie, A.F. Chambers, M. Moussa, and K.K. Carroll. Inhibition of human breast cancer cell proliferation and delay of mammary tumorigenesis by flavonoids and citrus juices. Nutrition and Cancer. 1996. Vol.26. No.2. P.167-181.

7. A.L. Potyahaylo, L.B. Pylychuk, D.M. Hovorun. Cooperative intramolecular H-bonds in quercetine: MNDO/H quantum chemical investigation. Biopolymers and cell. 2001. Vol.17. No.3. P.256-258.

8. R.S. Nasidullin, L.V. Spirihin, V.A. Ponomareva. Formation of complexes of a molecule pyrazole with phospholipids. Biophysics. 1991. Vol.36. No.4. P.594-598.

9. R.S. Nasibullin, T.I. Nikitin, G. Afanaseva, T.R. Nasibullin, L.V. Spirihin. Compltx 3,5,7,3',4'- pentaoxyflavonol with phosphatidycholine. Chem-pharm. journal. 2002. Vol.36. No.9. P.33 -36.

10. R.S. Nasibullin, M.A. Serebrinir. Study on the structure of phosphatidylcholinepyrazolt and hosphatidycloline - pyridine compexes. Biopolymers and cell. 2002. Vol.18. No.1. P.76-80.

11. E. Breitmaier, K. Spohn. N the pH- dependence of carbon - 13 chemical shifts of six- membered nitrogen heteroaromatics. Tetrahedron. 1973. Vol.29. No.8. P.1145-1152.

12. M.P. Allen, D.J. Tidesley. Computer simulation of liquids. Oxford: Clarendon Press. 1987. 230p.

13. R.S. Nasibullin, D.I. Kosarreva, L.V. Spirichin. Pyridine - phoshatidylcholine complex. Biophysics. 2002. Vol.47. No.5. P.820-824.

14. A.V. Ionser. Hydrogen communication. Moscow: Science. 1981. 220p.

15. Зинин Н.Н. О соединениях бензоила и об открытых новых телах, относящихся к бензоиловому роду. Спб. 1840.

16. Зинин Н.Н. О некоторых производных лепидена. Журнал русского физ-хим. общества. 1871.

Размещено на Allbest.ru