Анализ вкладов диастереомеров производных цитизина методом масс-спектрометрии электронного удара с использованием прямого ввода и сканирования выбранных ионов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Анализ вкладов диастереомеров производных цитизина методом масс-спектрометрии электронного удара с использованием прямого ввода и сканирования выбранных ионов

Ерастов Алексей Сергеевич, Галкин Евгений Григорьевич,

Цыпышева Инна Петровна, Абдуллин Марат Фаритович

Лаборатория физико-химических методов анализа. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии Уфимского научного центра РАН

Аннотация

Показана возможность использования метода прямого ввода в сочетании со сканированием выбранных ионов для определения вкладов диастереомеров в реакционных массах. Основное преимущество данного способа анализа заключается в том, что нет необходимости проводить разделение каждой анализируемой смеси. В то же время, необходимо располагать хотя бы малым количеством чистых диастереомеров.

Ключевые слова: хинолизидиновые алкалоиды, анализ диастереомеров, масс-спектрометрия электронного удара, сканирование выбранных ионов.

Введение

Хинолизидиновые алкалоиды, как природного происхождения, так и искусственно модифицированные, привлекают внимание химиков благодаря высокой биологической активности [1]. Для анализа данного класса соединений традиционно используется масс-спектрометрия электронного удара [2]. Этому способствует, в первую очередь, большой накопленный опыт и библиотеки масс-спектров, во-вторых, тот факт, что зачастую приходится работать со сложными многокомпонентными смесями [3].

диастереомер реакционный прямой ввод

Нередко возникает задача не только определить структуру основных компонентов, но и пространственное расположение заместителей. К сожалению, для данных соединений не разработаны прямые масс-спектрометрические методы, позволяющих надёжно выполнить отнесение конфигурации диастереомеров. Однако благодаря особенностям соединений, масс-спектры стереоизомеров различаются друг от друга. Это различие позволяет выполнить оценку вклада диастереомеров в смеси при условии, что известны масс-спектры чистых соединений.

В рамках работы были изучены масс-спектрометрические свойства аддуктов реакции Дильса-Альдера, образованных по реакции N-метилцитизина, (-)-леонтидина и (-)-термопсина с N-фенилмалеимидом. В каждом случае образуются пары диастереомеров 1-2, 3-4 и 5-6. Требовалось предложить метод анализа, позволяющий оценить вклад диастереомеров без разделения смеси. Для анализа были доступны как чистые диастереомеры, так и их реакционные смеси.

Экспериментальная часть

Соединения 1-2, 3-4, 5-6 были получены взаимодействием N-метилцитизина, (-)-леонтидина и (-)-термопсина с избытком N-фенилмалеимида при кипячении в толуоле с выходами 87, 72 и 81% соответственно. Выделение индивидуальных диастереомеров соединений 1-4 проводилось методом колоночной хроматографии. Для разделения смеси 5-6 использовалась препаративная тонкослойная хроматография. Подтверждение структуры выполнялось методом ЯМР ¹H и ¹³C.

Масс-спектрометрические исследования выполнялись на магнитно-секторном приборе высокого разрешения ThermoFinnigan MAT95XP. Масс-спектры чистых диастереомеров предварительно регистрировались в режиме магнитного сканирования с введением пробы через прямой ввод при стандартном значении энергии электронов 70 эВ. Температура источника ионов составляла 320 °C. Образец нагревался от 50 до 300 °C в течении 17 минут.

Сканирование в режиме мониторинга выбранных ионов (SIM) проводилось в варианте locked mode. Сканировались пара характеристических ионов, и пара реперных ионов перфторкеросина m/z 168.9882 и 430.9723, по которым в автоматическом режиме в каждом сканировании осуществлялась корректировка шкалы масс. Величина магнитного поля оставалась постоянной.

Результаты и их обсуждение

Масс-спектры данных соединений получены впервые. Они характеризуются довольно интенсивными пиками молекулярных ионов, а также двумя ионами, образованными по ретро-реакции Дильса-Альдера.

Диастереомеры заметно отличаются между собой: вклад молекулярных ионов в полный ионный ток для соединений 1, 3, 5 значительно больше, чем у соответствующих изомеров 2, 4, 6. В рамках данной работы мы не пытались объяснить закономерности в различиях масс-спектров диастереомеров, поскольку стереоспецифичность ретрореакции Дильса-Альдера хорошо известна [4-5]. Интенсивности наиболее характерных ионов приведены в табл. 1.

Табл. 1. Характеристические ионы в спектрах соединений 1-6

Вследствие высокой температуры кипения газохроматографическое разделение для данных соединений невозможно, поэтому анализ был проведён в режиме прямого ввода. Использования метода ВЭЖХ/МС нецелесообразно, поскольку он не даёт возможности впрямую различить диастереомеры.

В зависимости от количества введённого вещества время испарения менялось от двух-трёх до пяти-семи минут. Разделение по времени диастереомеров практически не наблююдается, что приводило к наложению масс-спектров. Единственным критерием содержания компонентов может стать отношение интенсивностей характеристических ионов в полученном суммарном масс-спектре. Чем точнее удастся его измерить, тем точнее можно провести количественный анализ. С этой целью регистрация масс-спектра выполнялось в режиме мониторинга выбранных ионов (SIM), прекрасно зарекомендовавшем себя в количественном анализе [6].

В данном режиме выполняется сканирование не полного масс-спектра, а только пары необходимых ионов и пары ионов репперного соединения. Таким образом, удаётся существенно повысить точность измерения интенсивностей масс-спектрометрических пиков. Проведение анализа в режиме высокого разрешения позволяет избавиться от влияния посторонних примесей, даже если они присутствуют в подавляющем количестве.

Заметим, что в качестве характеристических ионов можно выбрать любую пару. Главное, чтобы в спектрах диастереомеров различие по данным ионам было максимальным. Второе важное условие - необходимо, чтобы они находились вблизи друг друга, поскольку при использования метода SIM в широком диапазоне масс чувствительность к более тяжёлым фрагментам заметно снижается. Выбор пал на ионы m/z 173 для всех соединений и ионов m/z 204, 230 и 244 для 1-2, 3-4 и 5-6 соответственно.

Минимальное различие в выбранных ионах наблюдается для диастереомеров 1-2 - порядка 5% в относительной интенсивности. Поскольку именно величина 5% принимается за стандартную погрешность измерения интенсивности на приборах подобного класса, проведение количественного анализа, на первый взгляд, если и возможно, то с огромной ошибкой. Для оценки реальной погрешности был выполнен следующий эксперимент.

В режиме сканирования выбранных ионов зарегистрированы масс-спектры соединений 1 и 2. Причём количество второго на порядок превосходило количество первого (10^-7 и 10^-8 г). Из каждого опыта были выбраны по 30 сканирований.

В расчёт не брались величины ионного тока, полученные на пороге чувствительности или «зашкалившие» значения. Также отбрасывались сканирования, явно выбивающиеся из общей зависимости. Величины отношения интенсивности иона m/z 204 к иону m/z 173 (%) представлены на графике (рисунок).

Рисунок. Усреднённые результаты отношения I₂₀₄/I₂₀₃ в 30-ти сканированиях для диастереомеров 1 и 2

Видно, что точки хорошо ложатся на прямые, параллельные оси х. Доверительные интервалы, рассчитанные по методу Стьюдента, несмотря на разницу в концентрациях, в обоих случаях оказались схожими - 0.15 и 0.14% для соединений 1 и 2 соответственно.

Результаты измерений можно записать в виде: (15.23±0.15)% и (9.28±0.14)%. Относительные погрешности - 0.010 и 0.015.

Логично предположить, что для смеси двух диастереомеров величины погрешностей будут лежать в тех же пределах. Согласно правилам сложения погрешностей получаем: , что означает ошибку в измерении концентрации - всего 5%.

Конечно, это число не учитывает другие факторы, которые могут повлиять на измерение, такие как фракционирование смеси (неодновременное испарение изомеров) и матричные эффекты (влияние посторонних компонентов).

Поскольку при анализе с использованием прямого ввода время испарения образца составляет несколько минут, за это время регистрация масс-спектров проходит сотни раз. При усреднении результатов 30 сканирований удаётся измерить интенсивность пары характеристических ионов с точностью порядка 1-1.5%.

Пусть в масс-спектрах пары диастереомеров интенсивности иона m/z 173 равны условно единице, а интенсивности второго иона - m и n. Количество первого обозначим за x, а второго за y. Если интенсивности этих ионов в масс-спектре смеси - I₁ и I₂, то можно записать систему уравнений (1).

(1)

Решая систему, находим выражения для вкладов диастереомеров в смеси

(2)

где I₂/I₁ - отношение интенсивностей пары характеристических ионов в смеси,

а m и n - такие же величины для чистых изомеров. Согласно правилам сложения погрешностей, суммарная ошибка не будет превышать 5%.

С целью установления нижнего предела концентраций, при которых работает метод, был проанализирован ряд смесей различной концентрации с содержанием диастереомеров 1:1.

Концентрации и введённые объёмы были подобраны так, чтобы введённая масса диастереомеров составляла 2•10^-9, 2•10^-10, 2•10^-11 и 2•10^-12 г. Выяснилось, что заметные погрешности начинаются с введённой массы порядка 10^-10 г.

При более низких значениях ионы всё ещё регистрируются, но с очень большим разбросом от сканирования к сканированию, что не позволяет делать уверенных выводов о вкладе изомеров. При введённой массе 10^-12 г ионы практически не регистрируются.

К недостаткам метода следует отнести потенциальную возможность присутствия в смеси соединений родственного класса, в масс-спектрах которых присутствуют такие же точно ионы, как и в анализируемой паре. Снизить вероятность такой ошибки поможет анализ профилей ионных термограмм.

Если рассматриваемые ионы образованы другими соединениями, профиль одного иона, скорее всего, не будет в точности повторять профиль другого иона. В таком случае для анализа придётся выбрать другую пару характеристических ионов.

Выводы

Предложен метод, основанный на использовании сканирования выбранных ионов, позволяет проводить количественный анализ смеси диастереомеров даже при отсутствии возможности хроматографического разделения.

Проведение анализа в режиме высокого разрешения практически лишает необходимости предварительной очистки вещества. Более того, возможно анализировать даже такие сложные смеси, как растительные экстракты, содержащие целевой компонент в минорных количествах.

Принципиально метод не ограничивается анализом пары диастереомеров. На их место можно поставить любые структурные изомеры с похожими спектрами.

Литература

1. J.P. Michael. Indolizidine and quinolizidine alkaloids. Nat. Prod. Rep. 2004. Vol.21. P.625-649

2. Вульфсон Н.С., Заикин В.Г. Масс-спектрометрия хинолизидиновых алкалоидов. Успехи химии. 1976. Т.45. №10. С.1870-1894

3. G. Gresser, P. Bachmann, L. Witte, F.C. Czygan. Distribution and taxonomic significance of quinolizidine alkaloids in Leontice leontopetalum and L. ewersmannii (Berberidacea). Biochem. Syst. Ecol. 1993. Vol.21. No.6-7. P.679-685.

4. J. Deutsch, A. Mandelbaum. Studies in mass spectrometry--XV: Retro-diels-alder fragmentation and double hydrogen migration in some polycyclic diketones. Org. Mass Spectrom. 1971. Vol.5. P.53-59.

5. V.V. Ovcharenko, K. Pihlaja, G. Stбjer. Stereospecific fragmentations in the mass spectra of stereoisomeric isoindoloquinazolines. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003. Vol.14. No.9. P.1049-1056.

6. O.D. Sparkman, Z. Penton, G.F. Kitson. Gas Chromatography and Mass Spectrometry: A Practical Guide. Oxford: Academic Press. 2011. 632p.

Размещено на Allbest.ru