Идентификация метаболитов каннабимиметика AB-CHMINACA в моче методом ГХ-МС

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

^{1 Судебно-химическое отделение. ГКУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы». Ул. Старцева, 61. г. Пермь, 614077. Пермский край. Россия. Тел.: (342) 210-67-83. E-mail: forenschemist@narod.ru}

² Кафедра токсикологической химии. ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения Российской Федерации. Ул. Полевая, 2. г. Пермь, 614990. Пермский край. Россия. Тел.: (342) 282-58-64. E-mail: kaftox@mail.ru

Идентификация метаболитов каннабимиметика AB-CHMINACA в моче методом ГХ-МС

Катаев¹⁺ Сергей Сергеевич

Дворская²* Оксана Николаевна

*Ведущий направление; ⁺Поддерживающий переписку

Аннотация

метаболит экстракция хроматография моча

Описаны метаболиты, позволяющие установить факт употребления каннабимиметика AB-CHMINACA в процедуре скрининга мочи на наркотические и лекарственные вещества с применением методов твердофазной экстракции и газовой хроматографии с масс-спектрометрией. Выполнена идентификация основных метаболитов AB-CHMINACA в моче потребителей курительных смесей. Установлено, что метаболизм AB-CHMINACA проходит, в основном, через гидролиз амидных связей, основные метаболиты выводятся с мочой в конъюгированном виде. Получены газохроматографические и масс-спектрометрические характеристики производных основных метаболитов, которые могут быть полезны в практике судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Ключевые слова: AB-CHMINACA, каннабимиметики, метаболизм, ферментативный гидролиз, твердофазная экстракция, газовая хроматография - масс-спектрометрия.

Во второй половине 2013 года среди компонентов курительных смесей в ряде регионов России встречался синтетический каннабимиметик N-(1-карбамоил-2-метилпропил)-1-(цикло-гексилметил)-1H-индазол-3-карбоновой кислоты амид (AB-CHMINACA).

AB-CHMINACA является синтетическим каннабимиметиком на основе алкилиндазола и представляет собой модификацию структуры AB-PINACA, полученную путем варьирования заместителя у атома азота 1 в индазольном фрагменте.

Синтетический каннабимиметик AB-PINACA постановлением Правительства РФ № 788 от 09 сентября 2013 года включен в перечень I списка наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров [1]. Исходя из химической структуры, AB-CHMINACA может рассматриваться как производное N-(1-карбамоил-2-метилпропил)-1-(пентил)-1Н-индазол-3-карбоксамида (AB-PINACA).

Фармакология каннабимиметика AB-CHMINACA является неисследованной. В связи с этим изучение метаболизма нового каннабимиметика представляется весьма актуальной задачей для практики химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий.

Цель работы - идентификация метаболитов синтетического каннабимиметика AB-CHMINACA в моче потребителей курительных смесей с применением твердофазной экстрак-ции (ТФЭ) и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС).

Экспериментальная часть

Оборудование. Газовые хроматографы Agilent 7820 с моноквадрупольным масс-спектральным детектором Agilent 5975 (Agilent, США), колонка капиллярная НР-5MS, внутренний диаметр 0.25 мм, длина 30 м, толщина пленки 0.25 мкм. Для твердофазной экстракции применяли систему с вакуумной камерой на 12 позиций (Supelco), насос низкого вакуума (AIR CADET, США). Термоблок ПЭ-4030, одноканальный испаритель ПЭ-2300, микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия). Полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4-40, 40-200 мкл и 0.2-1, 1-5 мл.

Материалы. В исследовании применялись патроны для ТФЭ SampliQ EVIDEX - 200 мг-3 мл (Agilent, США). Бис-триметилсилилтрифторацетамид (BSTFA), содержащий 1% триметилхлорсилана; иодметан фирмы Sigma-Aldrich, в-глюкуронидаза, Type HP-2, From Helix Pomatia, 101400 ЕД/мл (Sigma-ALDRICH CHEMI, Германия). Все используемые растворители и реактивы градации «х.ч.». Пробы мочи до исследования хранились при + 4 ^оС.

Подготовка проб. К пробам мочи объемом по 0.5 мл прибавляли по 50 мкл спиртовых раст-воров внутренних стандартов: этилморфина гидрохлорида (0.02 мг/мл), N-этилбензиламина (0.01 мг/мл) и гексенала (0.2 мг/мл). Далее проводили предварительную подготовку c применением ферментативного гидролиза. К пробе мочи прибавляли 250 мкл 1/15М фосфатного буфера pH 6 и 25 мкл в-глюкуронидазы, флакон укупоривали и выдерживали при 45 ^оС в течение 2 часов.

К образцам мочи без гидролиза и после гидролиза прибавляли 2 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 4.8). Содержимое флаконов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, центрифугат отделяли от осадка.

Экстракцию проводили на патронах для ТФЭ SampliQ EVIDEX (200 мг/3 мл) со смешанной фазой. Кондиционирование сорбента проводили путем последовательного пропускания через карт-ридж 2 мл 95% этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 4.8). Далее загружали образец со скоростью 1 мл/мин. Промывку осуществляли последовательно: 1 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 4.8) и 1 мл 10% этанола. Сушка патрона осуществлялась под вакуумом в течение 10-15 минут. Элюат I получали двукратным пропусканием через патрон смеси н-гексан-этилацетат (3:1) по 2 мл. Элюат II получали двукратным пропусканием через патрон смеси дихлорметан-изо-пропанол - 25% аммиак (4:1:0.1) по 2 мл. Элюаты I и II испаряли в токе азота при 40 ^оС.

Получение производных проводили по одному из вариантов, указанных ниже.

Ш Метилирование. К сухому остатку элюата I прибавляли 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодистого метила и 20-25 мг безводного карбоната калия, герметично закрывали и нагревали при 60 ^оС в течение 60 мин в термоблоке. Флакон охлаждали, отбирали жидкую фракцию реакционной смеси, переносили в чистую виалу и испаряли в токе азота при 40 ^оС. Сухой остаток растворяли в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель хроматографа.

Ш Ацетилирование. К сухому остатку элюата II прибавляли 40 мкл безводного пиридина и 60 мкл уксусного ангидрида (замывая стенки виалы), виалу плотно укупоривали и обрабатывали микро-волновым излучением в СВЧ - печи с мощностью 560 Вт в течение 5 минут. После охлаждения флакон вскрывали и выпаривали избыток реагентов в токе азота (не выше 40 ^оС). Сухой остаток растворяли в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель ХМС.

Ш Получение триметилсилиловых эфиров. К сухому остатку элюата I или II прибавляли 100 мкл BSTFA, содержащего 1% триметилхлорсилана, герметично закрывали, перемешивали на микровстряхивателе и нагревали при 80 ^оС в течение 60 мин в термоблоке. Виалу охлаждали и 2 мкл вводили в инжектор хромато-масс-спектрометра.

Режим работы газового хроматографа с моноквадрупольным масс-спектральным детектором. Скорость потока газа-носителя (гелий) через колонку 1.5 мл/мин, режим работы split/splitless (деление потока 15:1, с задержкой включения 1 мин после ввода пробы). Температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора задавалась 250 и 280 ^оС.

Температура колонки начальная 70 ^оС в течение 2 мин и прогрев до 280 ^оС со скоростью программирования 20 град/мин, выдержка при конечной температуре 8 мин. Напряжение на умножителе масс-селективного детектора устанавливали равной величине автоматической настройки детектора. Регистрация масс-спектров для метильных производных в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 42-450 а.е. Регистрация масс-спектров триметилсилильных производных в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 42-700 а.е.

Обработку хроматограмм с целью идентификации компонентов проб проводили с использованием программ ChemStation G1701DA и AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST). Степень конъюгирования метаболитов AB-CHMINACA определяли для их метиловых эфиров по отношению площади пиков иона с величиной: для М1 - m/z 241, M2 - m/z 189, М3 - m/z 257 и площади пика иона m/z 235 для N-метилгексенала (внутренний стандарт) в элюате I мочи без гидролиза и с гидролизом.

Результаты расчетов логарифма распределения октанол-вода (LogP) и коэффициента адсорбции (Koc) получены с использованием пакета программ ACD/Labs v6.0 (Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Canada).

Результаты и их обсуждение

Каннабимиметик AB-CHMINACA - N-(1-карбамоил-2-метилпропил)-1- (циклогексил-метил)-1H-индазол-3-карбоновой кислоты амид по структуре близок к каннабимиметику AB-PINACA, метаболиты которого описаны нами ранее [2]. Отличительным в структуре двух этих каннабимиметиков является заместитель у атома азота 1 в индазольном фрагменте (рис. 1).

Рис. 1. Химические структуры каннабимиметиков AB-PINACA, AB-CHMINACA и основных метаболитов AB-CHMINACA (М1-М3)

Структуры основных метаболитов AB-CHMINACA, представленных на рис. 1, определяли на основании масс-фрагментации пиков их метилированных, триметилсилильных и смешанных производных, идентифицированных в пробах мочи потребителей курительных смесей с учетом масс-фрагментации нативного AB-CHMINACA.

Подготовку проб мочи к ГХ-МС анализу проводили с использованием ферментативного гидролиза и твердофазной экстракции по методике скрининга мочи на наркотические и лекарственные вещества, описанной ранее для идентификации метаболитов AB-PINACA и AB-FUBINACA [2, 3].

При анализе учитывали известные сведения о пути метаболизма синтетических каннаби-миметиков алкилиндольного ряда [4]. Для установления свойств функциональных групп применяли различные виды дериватизации, а также последовательное их сочетание.

На рис. 2-9 приведены структуры и масс-спектры каннабимиметика AB-CHMINACA и производных метаболитов AB-CHMINACA M1-M3.

Основным путем биотрансформации у AB-CHMINACA, по аналогии с AB-PINACA и AB-FUBINACA, является гидролиз концевой амидной связи до образования метаболита, содержащего карбоксильную группу [2, 3].

Наблюдается также гидролиз амидной связи карбамоильной группы в положении 3 индазольного фрагмента (метаболит М2).

Для всех идентифицированных соединений в масс-спектрах наблюдается молекулярный ион-радикал, а также характерные для эфиров метаболитов, образованных карбоксильной связью, фрагменты: [M-59]⁺ - для метиловых эфиров и [M-117]⁺ - для триметилсилильных дериватов.

Результаты расчета некоторых физико-химических констант AB-CHMINACA и его метаболитов, влияющих на поведение их в организме и на выбор условий их извлечения из мочи, приведены в таблице.

Рис. 2. Масс-спектр, индекс удерживания и структура каннабимиметика AB-CHMINACA

Рис. 3. Масс-спектр, индекс удерживания и структура метилового эфира метаболита М1 каннабимиметика AB-CHMINACA

Рис. 4. Масс-спектр, индекс удерживания и структура метилового эфира метаболита М2 каннабимиметика AB-CHMINACA

Расчеты физико-химических констант логарифма коэффициента распределения октанол-вода (LogP) и коэффициента адсорбции (K_OC) показывают, что липофильность нативного соединения и метаболитов М1, М2 достаточно высока, что объясняет выведение AB-CHMINACA с мочой, в основном, в виде метаболитов и высокий уровень конъюгации метаболитов. Поэтому применение гидролиза является важной стадией в подготовке образцов мочи с целью выявления метаболитов AB-CHMINACA.

Рис. 5. Масс-спектр, индекс удерживания и структура метилового эфира метаболита М3 каннабимиметика AB-CHMINACA

Рис. 6. Масс-спектр, индекс удерживания и структура метилового эфира метаболита М3 каннабимиметика AB-CHMINACA после ацетилирования

Рис. 7. Масс-спектр, индекс удерживания и структура смешанного метилового и триметилсилилового эфира метаболита М3 каннабимиметика AB-CHMINACA

Рис. 8. Масс-спектр, индекс удерживания и структура триметилсилилового эфира метаболита М1 каннабимиметика AB-CHMINACA

Рис. 9. Масс-спектр, индекс удерживания и структура смешанного бис-триметилсилилового эфира метаболита М3 каннабимиметика AB-CHMINACA

Таблица. Характеристика каннабимиметика AB-CHMINACA и его основных метаболитов

* Содержание М1 принято за 100%, значение прочих метаболитов рассчитывали по соотношению площади характеристических ионов, имеющих интенсивность 100% в масс-спектре метаболитов.

Исследование трех образцов мочи потребителей каннабимиметиков AB-CHMINACA показало, что основные метаболиты выводятся частично в конъюгированном виде: М1 на 78-91% (среднее 88%), М2 на 91-100% (среднее 91%), М3 на 22-57% (среднее 49%).

В исследованных образцах мочи нативный каннабимиметик AB-CHMINACA обнаружен не был. Все описанные метаболиты AB-CHMINACA были определены в элюате I.

Из относительного содержания метаболитов в моче следует, что основной путь био-трансформации AB-CHMINACA в организме человека - гидролиз концевой амидной связи с образованием метаболита M1 и дальнейшей конъюгации с глюкуроновой кислотой. Поэтому метаболит M1 может использоваться в качестве маркера употребления каннабимиметика AB-CHMINACA.

Выводы

Описаны метаболиты, позволяющие при анализе мочи установить факт употребления каннабимиметика AB-CHMINACA в моче лиц, употреблявших курительные смеси. Уста-новлено, что основным метаболитом AB-CHMINACA является N-[{1- (циклогексилметил)-1H-индазол-3-ил}карбонил]валин и он может использоваться в качестве маркера употре-ления AB-CHMINACA.

Приведены газохроматографические и масс-спектрометрические характеристики ряда производных метаболитов каннабимиметика AB-CHMINACA, которые могут быть использованы для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Метаболиты каннабимиметика AB-CHMINACA, имеющие аналитическое значение, выводятся с мочой в конъюгированном виде.

Показана возможность выявления основных метаболитов синтетического каннабимиметика AB-CHMINACA процедуре скрининга мочи на наркотические и лекарственные вещества с применением методов твердофазной экстракции и газовой хроматографии с масс-спектро-метрическим детектированием.

Литература

[1] О внесении изменений в некоторые акты Правительства Российской Федерации в связи с совершенствованием контроля за оборотом наркотических средств [Электронный ресурс]: Постановление Правительства РФ №788 от 09.09.2013. Консультант Плюс: Правовые акты по здравоохранению. 2013. (Технология проф).

[2] Катаев С.С., Зеленина Н.Б., Дворская О.Н. Идентификация метаболитов каннабимиметика AB-PINACA в моче методом ГХ-МС. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.35. №9. С.131-138.

[3] Мелентьев А.Б., Катаев С.С., Дворская О.Н., Лабутин А.В. Идентификация маркеров каннабимиметика AB-FUBINACA в моче методом ГХ-МС. Бутлеровские сообщения. 2013. Т.36. №11. С.111-118.

[4] Савчук С.А., Григорьев А.М. Хромато-масс-спектрометрический анализ в наркологической и токсикологической практике. М.: ЛЕНАНД. 2013. 224с.

Размещено на Allbest.ru