Определение флавоноидных комплексов в составе рябины обыкновенной

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Флавоноиды - это пигменты, которые имеют растительное происхождение и обеспечивают растениям правильный обмен веществ. Наиболее богаты флавоноидами растения семейства бобовых, астровых, сельдерейных, яснотковых, гречишных, рутовых, берёзовых и розоцветных [1]. В качестве объекта исследований нами был выбран представитель семейства розоцветных, Рябина обыкновенная.

Флавоноидами называется многочисленная группа природных биологически активных соединений, в основе структуры которых лежит скелет, состоящий из двух бензольных колец (А и В), соединенных между собой трехуглеродной цепочкой (пропановый мостик) - С6-С3-С6 [3]. Общепринятая классификация флавоноидов предусматривает их деление на 10 основных классов, исходя из степени окисленности трехуглеродного фрагмента [2]. Флавоноиды для человека полезны и даже необходимы. Они широко используются как в официальной, так и народной медициной в качестве лекарственных средств, оказывают такие очень важные воздействия, как: противоотечное, венотонизирующее, сосудорасширяющее, антиатеросклеротическое, противоаллергическое и др. [9].

Флавоноиды в природе встречаются в двух видах: свободном виде (агликоны) и в виде гликозинов, в чистом виде являются кристаллическими веществами с фиксированной температурой плавления, в интервале 100 - 180°С - гликозиды, до 300°С - агликоны, горького вкуса, бесцветные или окрашенные в желтый, красный или синий цвет.

Таблица 1. Цвета кристаллических соединений флавоноидов

Флавоноидные гликозиды растворимы в воде, но агликоны в воде обычно растворяются плохо. Большинство агликонов флавоноидов растворяются в ацетоне, этилацетате, хлороформе и других гидрофобных растворителях.

По своим химическим свойствам флавоноиды представляют слабые органические кислоты, так как входящие в их состав гидроксильные группы способны к диссоциации. Степень диссоциации гидроксильных групп возрастает в последовательности 5-ОН < 4-ОН < 7-ОН [5]. К тому же OH-группы флавоноидов различаются способностью к окислению при воздействии различных оксидантов (как правило, легче окисляется катехольная группа кольца В).

Рябина обыкновенная - Sorbus aucuparia L., широко используется в качестве лечебного средства в официальной и народной медицине. Плоды рябины содержат богатый комплекс витаминов, в том числе жирорастворимых: С, Е, В1, В2, Р, РР, К, каротиноиды и фолиевую кислоту. Содержание флавонидов и общее количество свободных аминокислот в рябине, выше, чем во многих других плодово-ягодных культурах. В плодах растения обнаружено 18 свободных аминокислот, из них 8 незаменимых. Рябина содержит флавоноиды: гиперозид, кэмпферол, кверцетин, рутин и лютеолин [6].

Таблица 1. Cуммарное содержание флавоноидов в различных сортах рябины обыкновенной

Универсального метода выделения флавоноидов из растительного сырья не существует. В каждом конкретном случае учитываются физические свойства флавоноидов, сопутствующие вещества и особенности растительного сырья.

Для выделения флавоноидов проводят экстракцию растительного сырья одним из подходящих растворителей: этанолом, метанолом, горячей водой или спирто-водной смесью [7].

Для очистки и разделения используют:

1. избирательную экстракцию;

2. осаждение солями тяжелых металлов;

3. хроматографические методы.

Выделение флавоноидов из растительного сырья с использованием избирательной экстракции:

1. Экстракция суммы флавоноидов из РС (70%,80% этанолом или метанолом).

2. Отгонка спирта под вакуумом до водного остатка.

3. Очистка полученной суммы флавоноидов СCl4 от липофильных веществ.

4. Разделение флавоноидов на фракции растворителями с возрастающей полярностью:

• экстракция агликонов этиловым эфиром;

• экстракция моногликозидов этилацетатом;

• экстракция биозидов, триозидов и др. полярных флавоноидов н-бутанолом.

5. Разделяют полученные фракции с помощью колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте, силикагеле или целлюлозе. Элюирование веществ проводят смесью хлороформа с этанолом или спиртово-водными смесями с возрастающей концентрацией спирта.

Контроль над ходом разделения флавоноидов проводят методом хроматографии. Для этого используют тонкослойную хромотографию (ТСХ), бумажную хромотографию (БХ) или высокоэффективную газожидкостную хроматографию [8].

6. Установление структуры выделенных соединений проводят с помощью физико-химических методов:

• определение температуры плавления;

• определение удельного вращения (гликозидов);

• сравнение УФ-, ИК-, масс-, ПМР-спектров со спектрами известных образцов.

В настоящее время широко используется метод выделения и очистки веществ известный как твердофазная экстракция (ТФЭ). Данный метод основан на распределении целевого компонента между подвижной и неподвижной фазами. Фазы происходят в результате сорбционных или ионнобменных процессов, протекающих в специальной колонке (картридже) для ТФЭ [10].

Процесс проведения ТФЭ состоит из нескольких основных этапов. В зависимости от метода их число бывает различным. К ним относятся:

• кондиционирование ТФЭ колонки;

• уравновешивание ТФЭ колонки;

• нанесение пробы;

• сушка сорбента ТФЭ колонки;

• промывка ТФЭ колонки для удаления примесей;

• элюирование целевого компонента (компонентов).

Ультразвуковое экстрагирование (экстракция) - позволяет получать химически чистые экстракты биологически активных веществ из природного сырья растительного или животного происхождения. Ультразвук ускоряет процесс экстрагирования и обеспечивает более полное извлечение нужных веществ.

Ультразвуковым облучением с частотой 19-44 кГц из растений с сокращением времени процесса экстракции на 1-2 порядка можно извлекать флавоноиды, дубильные вещества, фенолгликозиды, связанные кумарины, антоцианы, фенолкарбоновые кислоты.

Жидко-жидкостная экстракция - метод разделения и концентрирования веществ, основанный на их различном распределении между двумя несмешивающимися жидкими фазами, обычно между водой и несмешивающимся с ней органическим растворителем.

Жидкая фаза (органический растворитель или их смесь), в которую переходит вещество, например, из водной фазы называется экстрагентом. Если экстракция обусловлена образованием новых химических соединений, то экстрагентом обычно называют реагент, при взаимодействии с которым образуется экстрагируемое соединение. Отделённая органическая фаза, содержащая вещество, экстрагированное из водной фазы, называется экстрактом.

Процесс обратного извлечения вещества из экстракта в водную фазу называется реэкстракцией. Раствор, используемый для извлечения вещества из экстракта, называется реэкстрагентом. Отделённая водная фаза, которая содержит вещества, извлечённые из экстракта в результате реэкстракции, называется реэкстрактом.

Для обнаружения флавоноидов в растительном сырье используют химические реакции и хроматографию. Химические реакции подразделяются на цветные и реакции осаждения [11].

Качественные реакции в настоящее время применяют в сочетании с хроматографическими методами. Рядом исследователей показано, что существует определённая зависимость между химическим строением флавоноидов и их хроматографическим поведением [12]. Основные закономерности сводятся к следующему:

1. Величина Rf (отношение расстояния, пройденного пятном, к расстоянию, пройденному растворителем)снижается с увеличением гидроксильных групп в молекуле.

2. Метилирование гидроксильных групп вызывает повышение величины Rf агликонов.

3. Гликозидирование обусловливает понижение величины Rf. Образование биозида приводит к меньшему снижению величины Rf, чем образование дигликозида.

4. Ацетилирование может способствовать как повышению, так и понижению Rf.

5. Орто- и вициальные положения заместителей приводят к исключению из данных правил в сторону увеличения Rf.

I. Хроматография

Для обнаружения флавоноидов в растительном материале широко используется бумажная и тонкослойная хроматография. Обнаружение флавоноидов на хроматограммах проводят:

• по окраске пятен в видимом свете (антоцианы);

• по характеру свечения в УФ-свете: флавоны, флавонол-3-О-гликозиды, флаваноны и халконы обнаруживаются в виде темно-коричневых пятен, флавонолы и их 7-Огликозиды - в виде желтых или желто-зеленых;

• по характеру свечения в УФ-свете после проявления 5%-ным спиртовым раствором хлорида алюминия и последующего прогревания хроматограммы при 105°С в течение 2-3 мин: наблюдают пятна флавоноидов с интенсивной желтой и желто-зеленой флуоресценцией.

II. Количественное определение

Для количественного определения флавоноидов в растительном сырье наибольшее распространение получили физико- химические методы, прежде всего фотоколориметрия и спектрофотометрия.

1. Фотоколориметрический метод основан:

• на цветных реакциях комплексообразования с солями различных металлов (алюминия, циркония, хрома, сурьмы);

• на реакции с лимонно-борным реактивом;

• на реакции восстановления атомарным водородом в кислой среде в присутствии металлического магния или цинка.

2. Спектрофотометрический метод, основанный на способности флавоноидов поглощать свет в УФ-области спектра.

3. Хромато-спектрофотометрический метод - более совершенный метод количественного определения флавоноидов, используется в сочетании с хроматографией, что позволяет произвести очистку и разделение суммы веществ на отдельные компоненты.

Реже используют:

4. Флюориметрический метод.

5. Полярографический метод.

Наличие фенольных гидроксилов, обуславливающих слабокислые свойства флавоноидов, позволяет использовать метод кислотно-основного титрования в неводных растворителях: диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ацетоне.

Современные методы анализа обладают экспрессностью и точностью определения, поэтому стало возможным и обнаружение незначительных количеств веществ и, что особенно важно, выделение отдельных флавоноидов из растительного сырья.

Литература

флавоноид растительный экстракция жидкостный

1. Ладыгина Е.Я., Сафронич Н.И. и др. Химический анализ лекарственных растений: Учеб. пособ. для фармацевтических вузов / М.: Высшая Школа, 1983. - 176 с.

2. Тараховский Ю.С., Ким. Ю.А. и др. Флавоноиды: биохимия, биофизика, медицина / Пущино: Sуnchrobook, 2013 - 311 с.

3. Тюкавкина Н.А., Чертков В.А., Баженов Б.Н., Белобородов В.Л., Селиванова И.А., Савватеев А.М. Физико-химическая характеристика дигидрокверцетина как стандартного образца / Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Х Международный съезд "Фитофарм 2006" -СПб. 2006. - 338-342 с.

4. Калганова Н.А. Определение флавоноидных соединений в рябине обыкновенной / Дубна: 2016-2017. - 3-12 с.

5. Кирина И.Б, Иванова И.А. и др. Лечебное садоводство: Учеб. пособ. / Мичуринск: Изд-во Мичуринского госагроуниверситета, 2014. 55-59 с.

6. Писарев Д.И., Новиков О.О. и др. Химическое изучение биологически активных полифенолов некоторых сортов рябины обыкновенной - Sorbusaucuparia / Науч. ведости. Медицина. Фармация № 22 (93), выпуск 12/2, 2010 - 123-128 c.

7. Федосеева Г.М. Фотохимический анализ растительного сырья / Иркутск: Изд-во ГОУ ВПО Иркутский Государственный медицинский университет, 2009. 38-56с.

8. Лекарь А.В., Борисенко С.Н. и др. Извлечение биофлавоноида - кверцетина из растительного сырья в среде субкритической воды / «Сверхкритические флюиды: теория и практика», том 3, № 2, 2008 - 33-36 с.

9. Rusrnyak S.P., Srent - Gyorgyi A. Vitamin P: flavonols as vitamins // Nature: 1936 - Т.138 - 27 с.

10. Синютина С.Ю., Романцова С.В., Савельева В.Ю. Экстракция флавоноидов из растительного сырья и изучение их антиоксидантных свойств / Вестник ТГУ: 2011 - Т.16, вып. 1 - 40-68 с.

11. Карпук В.В. Фармакогнозия: Учеб. пособ. / Минск: БГУ, 2011. - 256-261 с.

12. Мищенко Е.В., Мищенко В.Я. Исследование кинетики процесса экстрагирования растворимых веществ из плодов рябины / Известия ТулГУ. Технические науки. Вып. 11. Ч. 2, 2014 - 352-357 с.

13. Долгоносов А.М. Методы аналитического хроматографии / Дубна: 2011 - 91-137 с.

Размещено на Allbest.ru