Современные методы определения флавоноидов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственный «Университет «Дубна» Дубна

Современные методы определения флавоноидов

Калганова Н.В.

Флавоноиды - крупнейший класс полифенольных веществ растительного происхождения, насчитывающий в настоящее время до 10000 выделенных и идентифицированных соединений. Присутствующие во всех тканях растений и представленные огромным разнообразием структурных форм флавоноиды играют важную роль во многих ключевых процессах роста и развития растений, а также способствуют их защите от различных неблагоприятных факторов окружающей среды, проявляют антиоксидантную активность, защищая клеточные мембраны, и нейтрализуют гидроксильные радикалы [1]. Их свойства, функции, механизмы воздействия на те или иные процессы в живых организмах до конца не изучены, но уже сейчас учёные сходятся во мнениях о чрезвычайно широких возможностях флавоноидов в оздоровлении и омоложении организма человека.

Наиболее богаты флавоноидами растения семейства бобовых, астровых, розоцветных, гречишных, березовых, рутовых и др. Растительные объекты представляют собой сложную многокомпонентную матрицу, содержащую вещества различной природы и полярности [2]. Подобная разнородность состава значительно затрудняет проведение одновременного анализа флавоноидов. Поэтому наиболее распространённой проблемой является подбор физико-химических методов анализа и поиска основных методов выделения и концентрирования флавоноидных комплексов в различных растительных объектах.

Для идентификации флавоноидов используют методы, основанные на их свойствах. Для получения предварительной информации о структурных особенностях выделенных флавоноидных соединений используют химические реакции и хроматографию. Качественные групповые реакции на флавоноиды условно можно разделить на цветные реакции - образование окрашенных соединений, и реакции осаждения, где в результате взаимодействия соединений выпадает осадок [3].

Наличие фенольных гидроксильных групп, обуславливает слабокислотные свойства флавоноидов и их способность образовывать комплексы с ионами металлов. Эти свойства используют для анализа флавоноидных соединений гравиметрическими и титриметрическими методами. Однако указанными методами невозможно с достаточной точностью определять содержание данных соединений в растительном сырье. спектрофотометрический флавоноид химический хроматография

В настоящее время все большее распространение получают различные физикохимические и спектральные методы анализа, которые имеют ряд существенных преимуществ, а именно: быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и, что особенно важно, возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного сырья. К таким методам относятся высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), хроматоспектрофотометрия, спектрофотометрия, фотоэлектроколориметрия, денситометрия с использованием хроматографии на бумаге и в тонком (закреплённом и незакреплённом) слое сорбента [4].

Спектрофотометрический анализ (СФ) используется для установления качественного и количественного состава, подлинности лекарственных средств, определения степени их чистоты. СФ анализ характеризуется чувствительностью и высокой точностью. Спектрофотометрическое определение по максимумам собственного поглощения в разновидности прямой или дифференциальной спектрофотометрии является одним из наиболее распространённых методов анализа флавоноидных соединений. Метод СФ группового определения флавоноидов основан на образовании окрашенного в интенсивно жёлтый цвет комплекса флавоноида с AlCl3 [5].

За последнее время накоплен большой материал по УФ-спектроскопии флавоноидных соединений, с помощью которого возможна идентификация не только основной структуры флавоноидов, но и установление количества и положения OH-групп и остатков сахаров. Данный метод анализа базируется на избирательном поглощении монохроматического света раствором исследуемых веществ. Поглощение обусловлено электронными переходами с орбиты донорного заместителя на вакантную орбиту бензольного кольца или акцепторного заместителя. Достоинством УФ-спектроскопии является высокая чувствительность: для снятия спектров на современных приборах требуется менее 0,1 мг вещества [6].

Для установления и подтверждения строения флавоноидных соединений, а также определения конфигурации и конформации молекул широко используются спектральные исследования в ИК-области 1400-650 см-1 («область отпечатков пальцев»). Колебания атомов молекулы, характеризующие ИК-спектры, имеют различную энергию и могут быть направлены вдоль валентной связи между атомами, обуславливая полосы поглощения индивидуальные для соединений. Образование флавоноидных комплексов с ионами металлов сопровождается рядом изменений в ИК-спектрах по сравнению со спектрами свободных полифенолов. Характер этих изменений даёт информацию о процессах, происходящих в результате реакции комплексообразования. Однако полученная информация не всегда является достаточной для точного определения сайтов связывания ионов металлов с депротонированными флавоноидами. Метод ИКспектроскопии, как и УФ-спектроскопию, удобно использовать в качестве дополнительного подтверждения образования комплекса с одновременным применением других методов, например, спектроскопии ЯМР.

Метод ЯМР-спектроскопии основан на резонансном поглощении или излучении электромагнитной энергии веществом во внешнем магнитном поле. Исследования флавоноидов и полученных на их основе комплексов с ионами металлов проводят на ядрах 1Н и 13С, обладающих магнитным моментом и моментом количества движения. По числу сигналов в спектре ЯМР определяется количество типов протонов молекулы, а по положению сигналов устанавливается сам тип протонов. При этом анализируются либо сигналы протонов ОН-групп (иногда не всех), либо сигналы всех протонов, присутствующих в молекулах свободных флавоноидов. При ЯМР-титровании анализируются величины химических сдвигов протонов, находящихся только при атомах углерода. В получаемых спектрах оценивают изменения величин химических сдвигов протонов, связанных с атомами углерода, соседних с предполагаемыми сайтами связывания. В некоторых случаях анализ протонных спектров подкрепляется исследованием спектров ЯМР 13С [7].

Для идентификации, разделения и определения флавоноидов в природных объектах, биологических жидкостях и других сложных матрицах в последнее время используют ВЭЖХ, хромато-масс-спектрометрию и капиллярный электрофорез.

Согласно литературным данным для идентификации и количественного анализа флавоноидов в основном используют обращённо-фазовый вариант ВЭЖХ с диодноматричным детектированием, позволяющий разделить и идентифицировать компоненты сложной смеси. В качестве неподвижных фаз для анализа флавоноидов чаще всего используют силикагели с привитыми алкильными радикалами, как правило С18.

Масс-спектрометрия используется для установления подлинности, структур органических веществ и их количественного определения. Важной проблемой массспектрометрии сложных органических соединений является способ их ионизации, который должен быть высокоэффективным и не приводить к существенной фрагментации анализируемых соединений. Среди различных способов ионизации, применяемых в массспектрометрии, для установления структур сложных органических соединений используют преимущественно два: образование ионов при распылении раствора анализируемого соединения в электрическом поле (электроспрей) и ионизацию посредством десорбции ионов из органической матрицы импульсным лазерным излучением (MALDI), который сочетают с анализатором масс TOF. Несмотря на существенные технические различия, оба эти способа заключаются в захвате протона молекулой органического соединения с образованием протонированного иона. Получение информативных масс-спектров для комплексных соединений флавоноидов с металлами не всегда возможно, с одной стороны, из-за сложности подбора матрицы для MALDI-TOF анализа, с другой стороны, многие комплексы плохо растворимы в подходящих для анализа растворителях [5].

В последние годы исследование фенольных соединений все чаще проводят методом капиллярного электрофореза, основанным на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля за счёт подачи высокого напряжения к концам капилляра. Данный метод известен как один из наиболее перспективных и высокоэффективных методов разделения и анализа сложных смесей на составляющие компоненты. Преимущества его заключаются в высокой эффективности разделения, возможности определения малых количеств вещества в течение короткого промежутка времени, малом расходе реактивов (микролитры), простой пробоподготовке, надёжной работе капилляра с экономичными водными буферами. Кроме того, капиллярный электрофорез не требует насосов высокого давления, необходимых для ВЭЖХ, несравнимо меньше в этом случае и расход высокочистых растворителей. Отсутствие твёрдого сорбента в капилляре исключает возможность его «старения», химической и физической деструкции и любого неспецифического связывания с ним компонентов пробы [8].

Современные методы анализа обладают экспрессностью и точностью определения, поэтому стало возможным и обнаружение незначительных количеств веществ и, что особенно важно, выделение отдельных флавоноидов из растительного сырья. Для группового анализа флавоноидов в растительном сырье можно использовать спектрофотометрический, гравиметрический и титриметрический методы анализа. Для определения отдельных флавоноидов используют хроматографические методы и электрофорез, позволяющие их разделить и идентифицировать.

Литература

1. Тараховский Ю.С., Ким. Ю.А. и др. Флавоноиды: биохимия, биофизика, медицина// Пущино: Sуnchrobook, 2013 - 311 с.

2. Ладыгина Е.Я., Сафронич Н.И. и др. Химический анализ лекарственных растений: Учебное пособие для фармацевтических вузов//М.: Высшая Школа, 1983. - 176 с.

3. Карпук В.В. Фармакогнозия: Учебное пособие//Минск : БГУ, 2011. - 256-261 с.

4. Шинкаренко А.Б. Методы исследования природных флавоноидов//Пятигорск, 1977. - 177 с.

5. Тырков А.Г. Выделение и анализ биологически активных веществ: Учебное пособие// М.: КНОРУС, Астрахань, АГУ, ИД «Астраханский университет», 2016. - 69-83 с.

6. Тюкавкина Н.А., Чертков В.А., Баженов Б.Н., Белобородов В.Л., Селиванова И.А., Савватеев А.М. Физико-химическая характеристика дигидрокверцетина как стандартного образца//Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Х Международный съезд «Фитофарм 2006» -СПб. 2006. - 338-342 с.

7. Барбалат Ю.А., Власов Ю.Г. и др. Новый справочник химика и технолога. Аналитическая химия. Ч.1//С.-Пб.: АНО НПО «Мир и Семья», 2002 - 964 с.

8. Морзунова Т.Г. Капиллярный электрофорез в фармацевтическом анализе (Обзор)// ИГКЛС, Москва, 2006 - 39-52

Аннотация

Составлен литературный обзор физико-химических методов определения флавоноидов. Показано, что для группового анализа флавоноидов можно использовать спектрофотометрический метод, а для идентификации отдельных флавоноидов и их количественного анализа - капиллярный электрофорез, тонкослойную и высокоэффективную жидкостную хроматографию с диодно-матричным и массселективным детектированием.

Ключевые слова: флавоноиды, спектрофотометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография, капиллярный электрофорез.

Размещено на Allbest.ru