Газохроматографическое определение Tween-80 в готовых лекарственных формах препаратов, полученных на основе плазмы крови человека

Полная исследовательская публикация __________ Коваленко А.Е., Кардонский Д.А., Еганов А.А.,

Степанова О.Г., Шестакова С.В. и Плешакова И.И.

Размещено на http://www.allbest.ru//

84 ______ http://butlerov.com/ _______ ©--Butlerov Communications. 2014. Vol.38. No.4. P.83-86. (English Preprint)

Размещено на http://www.allbest.ru//

Газохроматографическое определение твин-80 в готовых лекарственных формах препаратов, полученных на основе плазмы крови человека

Коваленко Алексей Евгеньевич

Аннотация

Рассмотрен простой и надежный метод количественного определения Tween 80 в готовых лекарственных формах препаратов, полученных на основе плазмы крови человека. Tween 80 выделяется из ГЛФ с помощью жидкость-жидкостной экстракции и анализируется методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором. Количественное определение содержания Tween 80 осуществляется по методу внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта выбрана стеариновая кислота.

хроматография плазма кровь

Введение

В настоящее время используются хроматографические методы фракционирования плазмы донорской крови с целью получения антигемофильных концентратов - факторов VIII, IX свертывания крови, свободных от белковых примесей и обладающих высокой специфической активностью [1-2].

Технологическая схема получения концентратов факторов свертывания включает две стадии вирусной инактивации: сольвент-детергентную, предшествующую хроматографическому выделению белка, и термическую на завершающей стадии приготовления готовой лекарственной формы [3, 4]. Комбинация данных методов вирусной инактивации является обязательной по международным требованиям к производству препаратов плазмы донорской крови [3].

Сольвент-детергентная стадия вирусной инактивации применяется для подавления оболочечных вирусов с использованием 0.3% раствора три-н-бутилфосфата и 1% раствора Tween-80 [4]. В соответствии с требованиями FDA, концентрация Tween 80 не должна превышать 100 мкг/мл.

В качестве метода измерения остаточного содержания Tween 80 в настоящее время широко применяется калориметрический метод с использованием раствора йода, рекомендованный Европейской Фармакопеей.

Но данный метод имеет ряд недостатков и ограничений при работе. Также в литературе можно найти упоминания методов с использованием ВЭЖХ [5-11]. Но среди описанных методов нами не обнаружены методы газовой хроматографии, поэтому для определения остаточного содержания Tween 80 в готовой лекарственной форме был разработан газохрома-тографический метод анализа Tween 80.

Экспериментальная часть

Газохроматографическое определение проводили на газовом хроматографе Agilent Technolo-gies 6890N с пламенно-ионизационным детектором (ГХ/ПИД) при следующих условиях:

Колонка НР-5, 0.32 мм, 0.25 мкм, 30 м

Газ-носитель азот (особо чистый)

Температура инжектора 250 С

Температура детектора 280 С, Термостат начальная температура 185 С,

9 С/мин до 215 С, 2 мин далее 40 С/мин до 280 С, 2 мин

Режим деления потока Splitless

Скорость потока 1.4 мл/мин

Приготовление раствора внутреннего стандарта. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 125 мг стеариновой кислоты, растворяют в ацетоне и доводят до метки тем же растворителем. Полученная концентрация стандарта 2.5 мг/мл.

Приготовление раствора Tween 80. В мерную колбу вместимостью 250 мл помещают 25.0 мг Tween 80, растворяют в дистиллированной воде и доводят до метки тем же растворителем. Полученная концентрация составляет 100 мкг/мл.

Приготовление калибровочных растворов: В хроматографических виалах с навинчивающейся крышкой объемом 4 мл готовят растворы Tween 80 объемом 2 мл с концентрациями 100, 50, 25, 12.5 мкг/мл из раствора Tween 80 с концентрацией 100 мкг/мл. В каждый раствор добавляют 1 мл 40% раствора гидроксида натрия и с помощью шприца для газовой хроматографии добавляют 20 мкл раствора внутреннего стандарта. Виалы помещают в термостат и нагревают в течении 4 часов при температуре 90 °С.

После этого содержимое каждой виалы переносят в центрифужные пробирки объемом 10 мл и нейтрализуют концентрированной соляной кислотой (37%). После нейтрализации добавляют еще примерно по 0.1 мл концентрированной соляной кислоты (37%) до рН~1-2. Далее в пробирки добавляют по 2 мл дихлорметана и интенсивно перемешивают на вортексе не менее 1 мин. Затем пробирки центрифугируют 1 мин. при скорости 3000 об/мин.

После этого из пробирок отбирают, по возможности более полно, нижний органический слой, который переносят в хроматографические виалы с навинчивающейся крышкой объемом 2 мл.

Полученные экстракты упаривают досуха в токе сухого воздуха при 50 С. После упаривания к сухому остатку каждой виалы добавляют по 50 мкл этилацетата, перемешивают на вортексе, добавляют по 40 мкл пентафторпропионового ангидрида, перемешивают на вортексе, добавляют по 20 мкл пентафторпропанола, перемешивают на вортексе, герметически закрывают навинчивающимися крышками и помещают в термостат, нагретый до 80 єС на 15 минут. После этого смесь в каждой виале упаривают досуха в токе сухого воздуха при 50 єС. Далее сухие остатки реконструируют 100 мкл этилацетата и переносят во вставки в виалу, позволяющую, в случае необходимости использовать автоматический инжектор в газовый хроматограф.

Хроматографируют калибровочные растворы при вышеуказанных условиях.

Обсчет полученных данных. На основании полученных данных строится калибровочный график, используя программное обеспечение газового хроматографа.

Систему считают пригодной, если:

Линейность: в диапазоне концентраций от 12.5 до 100 мкг/мл коэффициент корреляции не ниже 0.995.

Предел обнаружения Tween 80 составляет не менее 5 мкг/мл.

Предел количественного расчета Tween 80 составляет не менее 12.5 мкг/мл.

Концентрацию Tween 80 в испытуемом растворе определяют путем сравнения с концентрацией внутреннего стандарта.

S Tween 80 *К* С

Tween 80 (мкг/мл) = --------------

Sстандарт

где: S - площадь пика, К - фактор отклика (рассчитывается по калибровочным данным),

С - концентрация внутреннего стандарта (мкг/мл).

Sстандарт (калиб) С Tween 80 (калиб)

К = ---------- * ----------

S Tween 80 (калиб) Сстандарт (калиб)

Подготовка образца к анализу. В хроматографическую виалу с навинчивающейся крышкой объемом 4 мл помещают 2 мл анализируемой субстанции, 1 мл 40% раствора гидроксида натрия и добавляют с помощью шприца для газовой хроматографии 20 мкл раствора внутреннего стандарта. Виалу помещают в термостат и нагревают в течении 4 часов при температуре 90 °С. После этого содержимое виалы переносят в центрифужную пробирку объемом 10 мл и нейтрализуют концентрированной соляной кислотой (37%). После нейтрализации добавляют еще примерно 0.1 мл концентрированной соляной кислоты (37%) до рН~1-2. Далее в пробирку добавляют 2 мл дихлорметана и интенсивно перемешивают на вортексе не менее 1 мин.

Затем пробирку центрифугируют 1 мин. при скорости 3000 об/мин. После этого из пробирки отбирают, по возможности более полно, нижний органический слой, который переносят в хромато-графическую виалу с навинчивающейся крышкой объемом 2 мл. Полученный экстракт упаривают досуха в токе сухого воздуха при 50 С. После упаривания к сухому остатку добавляют 50 мкл этилацетата, перемешивают на вортексе, добавляют 40 мкл пентафторпропионового ангидрида, перемешивают на вортексе, добавляют 20 мкл пентафторпропанола, перемешивают на вортексе, герметически закрывают навинчивающейся крышкой и помещают в термостат, нагретый до 80 єС на 15 минут. После этого смесь упаривают досуха в токе сухого воздуха при 50 єС. Далее сухой остаток реконструируют 100 мкл этилацетата и переносят во вставку в виалу, позволяющую, в случае необходимости использовать автоматический инжектор в газовый хроматограф. Далее хроматографируют при вышеуказанных условиях.

Результаты и их обсуждение

Метод основан на количественном определении олеиновой кислоты, получающейся в процессе щелочного гидролиза Tween 80 при пробоподготовке. В качестве внутреннего стандарта выбрана стеариновая кислота, как наиболее близкая по физико-химическим свойствам к олеиновой кислоте. В процессе пробоподготовки олеиновая кислота, а также внутренний стандарт, подвергается дериватизации (получению производных) с целью улучшения хроматографических характеристик.

Поскольку калибровка газохроматографического метода ведется по Tween 80, то в результате анализа получается напрямую концентрация Tween 80, а не концентрация олеиновой кислоты.

Гидролиз Tween 80 был оптимизирован по времени, температурному режиму и концент-рации щелочи путем постановки модельных экспериментов. Далее получаемая в процессе гидролиза олеиновая кислота выделялась из нейтрализованного гидролизата с помощью жидкость-жидкостной экстракции. В качестве растворителя из линейки органических экстра-гентов был выбран дихлорметан, как наиболее подходящий по технологической процедуре. После удаления органического растворителя образцы дериватизировались смесью пентафтор-пропионового ангидрида и пентафторпропанола. Данная методика получения производных жирных кислот имеет существенные преимуществ по сравнению с традиционными способами дериватизации по времени и простоте исполнения.

Полученные результаты позволяют предложить быстрый и надежный контроль Tween 80 в готовых лекарственных формах препаратов, полученных на основе плазмы крови человека.

Литература

Вязова Е.П., Фетисова Л.В. «Свежезамороженная плазма донорской крови как сырье для получения антигемофильных факторов». Новое в трансфузиологии. М. 2000. Вып.25. С.47-50.

Ажигирова М.А., Берковский А.Л., Дереза Т.Л., Фетисова Л.В.. Сергеева Е.В. Особенности технологий получения препаратов плазмы. Новое в трансфузиологии. М. 2004. Вып.37. С.12-18.

Дереза Т.Л. «Новые тенденции в мировом производстве препаратов плазмы» (по материалам конференции «Plasma Product Biotechnology Meeting-20003»). Новое в трансфузиологии. М. 2003. Вып.36. С.62-70.

C. Michalski, F. Bal, T. Burnout, M. Goudemand. “Large-Skale Production and Properties of Solvent-Detergent-treated Factor IX Concentrate from Human Plasma». Original Papers, Vox Sang. 1988. Vol.55. P.202-210.

E.G. Brown, T.J. Hayes. Analist 80. 1955. P.755-767.

N.T. Crabb, H.E. Persinger. J.Am. Oil Chem. Soc. 1964. Vol.41. P.752-755.

R.A. Greff, E.A. Setzkorn, W.D. Leslie. J.Am. Oil Chem. Soc. 1965. Vol.42. P.180-185.

A. Nozawa, T. Ohnuma, S. Tatsuya. Analist 101. 1976. P.543-548.

N.H. Anderson, J. Girling. Analist 107. 1982. P.836-838.

T.H. Tani, J.M. Moore, T.W. Pataroff. J. of Chromat. 1997. Vol.786. P.99-106.

M. Hu, M. Niculescu, X.M. Zhang, A. Hui. J. of Chromat. 2003. Vol.984. P.233-236.

Размещено на Allbest.ru