Синтез производных п-трет-бутилтиакаликс[4]арена, функционализированных по нижнему ободу фрагментами N-(2-гидроксиэтил)этилендиамина, в конфигурациях конус и 1,3-альтернат и их взаимодействие с ДНК

Размещено на http://www.allbest.ru/

Синтез производных п-трет-бутилтиакаликс[4]арена, функционализированных по нижнему ободу фрагментами N-(2-гидроксиэтил)этилендиамина, в конфигурациях конус и 1,3-альтернат и их взаимодействие с ДНК

Введение

Впервые синтезированы производные п-трет-бутилтиакаликс[4]арена, функционализированные по нижнему ободу фрагментами N-(2-гидроксиэтил)этилендиамина в конфигурациях конус и 1,3-альтернат. Структура и состав новых производных охарактеризованы набором физико-химических методов исследования. Продемонстрирована способность синтезированных макроциклов к взаимодействию с ДНК из тимуса теленка и образованию агрегатов «макроцикл/ДНК». Показано, что только при определенных стехиометрических соотношениях «макроцикл/ДНК» образуются монодисперсные системы агрегатов.

Адресная доставка полинуклеиновых кислот в клетку с терапевтической целью сильно ограничена рядом препятствий, начиная с клеточной мембраны до экспрессии гена. Для преодоления клеточных барьеров требуется использование носителей генов - вирусных и невирусных векторов. Невирусные векторы, в основном, не вызывают иммунный ответ организма. Они легко синтезируются, обладают способностью переносить генетический материал неограниченного размера, а также относительно безопасны [1, 2]. Одним из актуальных подходов, используемых при разработке синтетических невирусных векторов является функционализация легко доступных молекулярных платформ группами-рецепторами (амино, аммонийные и гуанидиниевые группы), способными взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Известно, что макроциклические соединения, содержащие аналогичные группы, эффективно взаимодействуют с биологическими субстратами. Поэтому не удивительно, что множество биомиметических рецепторов были разработаны с применением синтетических рецепторных платформ, таких как краун-эфиры, криптанды, порфирины, каликсарены, тиакаликсарены, и циклодекстрины [3-12].

Среди большого числа макроциклических объектов супрамолекулярной химии каликс-арены занимают особое место, благодаря их способности к селективному комплексообразованию, переносу, катализу и возможности быть потенциальными биомиметиками и строительными блоками для синтеза супрамолекулярных архитектур [13-21]. Чашеобразная структура каликс[4]аренов представляется удобной молекулярной платформой для конструирования на их основе трехмерных структур с широким спектром размеров полости, различающихся числом и типом центров связывания, пространственным расположением связывающих групп, а также возможностью образования асимметрических полостей и изменения баланса между жесткостью и гибкостью рецептора.

Целью данной работы является синтез производных п-трет-бутилтиакаликс[4]арена, функционализированных по нижнему ободу фрагментами N-(2-гидроксиэтил)этилендиамина в конфигурациях конус и 1,3-альтернат, и изучение их взаимодействия с модельной ДНК.

синтетический вектор фрагмент

1.Экспериментальная часть

синтетический вектор фрагмент

Спектры ЯМР 1Н записывали на спектрометре Bruker Avance-400 на рабочей частоте 400 МГц. Химические сдвиги протонов определялись относительно сигналов остаточных протонов дейтерированного растворителя: ДМСО-d6. Концентрация анализируемых растворов составляла 3-5%.

Элементный анализ кристаллических образцов был выполнен на приборе Perkin Elmer 2400 Series II.

ИК-спектры регистрировали на Фурье-спектрометре Spectrum 400 (Perkin Elmer).

Масс-спектры регистрировали на масс-спектрометре Bruker Ultraflex III MALDI-TOF (в матрице п-нитроанилина).

Температуру плавления веществ определяли на нагревательном столике Boetius.

Дополнительный контроль чистоты веществ и контроль протекания реакции проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках Silica G, 200 m, UV 254.

5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26,27,28-тетра[(этоксикарбонил)метокси]тиакаликс[4]арен (конус 1, 1,3-альтернат 2) были синтезированы как описано ранее [22], Т.пл. (1) 180 єС (лит. 180 єС), Т.пл. (2) 331 єС (лит. 331 єС [22]).

5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26,27,28-тетракис-[N-(1'-(3'-аза-6'-гидроксигексил)-карб-амоилметокси)]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен в конфигурации конус (3). В круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой и обратным холодильником, поместили 0.50 г (0.47 ммоль) п-трет-бутилтиакаликс[4]арена 1 и 30 мл смеси толуола и метанола (1:1). Затем добавили 0.5 мл (4.94 ммоль) N-(2-гидроксиэтил)этилендиамина. Реакционную смесь кипятили в течение 84 часов. После охлаж-дения реакционной смеси удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт был осажден из реакционной смеси ацетонитрилом и перекристаллизован из ацетонитрила. Продукт осушали над NaOH при пониженном давлении и получили в виде белого кристаллического порошка. Выход: 0.58 г (96 %). Т.пл.: 169 °C. Спектр ЯМР 1H (ДМСО-d6, , м.д., J/Гц): 1.07 (с, 36H, (CH3)3C), 2.57 (т, 8H, 3JHH = 5.8 Гц, -NHCH2CH2OH), 2.63 (т, 8H, 3JHH = 6.5 Гц, -C(O)NHCH2CH2NH-), 3.26 (т, 8H, -C(O)NHCH2CH2 NH-), 3.33 (уш. с, 8H, NH, OH), 3.42 (т, 8H, 3JHH = 5.6 Гц, -NHCH2CH2OH), 4.79 (с, 8H, -CH2C(O)NH), 7.39 (с, 8H, ArH), 8.36 (уш. т, 4H, 3JHH = 5.7 Гц, -C(O)NH). Спектр ЯМР 13С (CDCl3, , м.д.): 169.39, 157.58, 147.58, 134.88, 128.06, 74.57, 60.92, 51.60, 48.85, 39.40, 34.29, 31.09. ИК-спектр (/cм-1): 3302 (OH); 1664 (C(O)). Масс-спектр (MALDI-TOF): Вычислено [М+] m/z = 1296.6, Найдено: [M+H]+ m/z =1297.8, [M+Na]+ m/z =1319.9. Элементный анализ: Вычислено: C, 59.23; H, 7.46; N, 8.63; S, 9.88 %. C64H96N8O12S4. Найдено: C, 58.43; H, 7.35; N, 8.20; S, 10.76.

5,11,17,23-Тетра-трет-бутил-25,26,27,28-тетракис-[N-(1'-(3'-аза-5'-гидроксигексил)-карб-амоилметокси)]-2,8,14,20-тетратиакаликс[4]арен в конфигурации 1,3-альтернат (4). В круглодонной колбе, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильником, добавляли 0.50 г (0.47 ммоль) п-трет-бутилтиакаликс[4]арена 2 и 30 мл смеси толуол и метанол (2:1). Затем к реакционной смеси добавили 0.5 мл (4.94 ммоль) N-(2-гидроксиэтил)этилендиамин. Реакционную смесь кипятили в течение 84 часов. Затем растворитель удалили с помощью роторного испарителя. Реакционная смесь была растворена в 20 мл хлороформа, и экстрагирована водой (3Ч30 мл), а органическая фракция была упарена при пониженном давлении. Продукт осушали над NaOH при пониженном давлении и получили в виде белого кристаллического порошка. Выход 0.59 г (98 %). Т.пл.: 166 °C. Спектр ЯМР 1H (ДМСО-d6, , м.д., J/Гц): 1.20 (с, 36H, (CH3)3C), 2.57 (т, 8H, 3JHH = 5.8 Гц, -NHCH2CH2OH), 2.62 (т, 8H, 3JHH = 6.7 Гц, -C(O)NHCH2CH2NH-), 3.18 (м, 8H, -C(O)NHCH2CH2NH-), 3.34 (уш. с, 8H, NH, OH), 3.42 (т, 8H, 3JHH = 5.7 Гц, -NHCH2CH2OH), 3.91 (с, 8H, -OCH2C(O)NH), 7.56 (с, 8H, ArH), 7.79 (уш. т, 4H, 3JHH = 5.3 Гц, -C(O)NH). Спектр ЯМР 13С (CDCl3, , м.д.): 168.62, 156.58, 147.54, 132.88, 127.15, 70.91, 60.89, 51.02, 48.72, 39.43, 34.35, 31.16. ИК-спектр (/cм-1): 3412 (NH); 3301 (OH); 1664 (C(O)NH). Масс-спектр (MALDI-TOF): Вычислено [М+] m/z =1296.6, Найдено: [[M+H]+ m/z =1298.1, [M+K]+ m/z =1336. Элементный анализ: Вычислено: C, 59.23; H, 7.46; N, 8.63; S, 9.88 %. C64H96N8O12S4. Найдено: C, 60.78; H, 7.24; N, 8.34; S, 10.71.

Размерное распределение частиц (по интенсивности, объёму, количеству и индекс полидис-персности) образующихся либо при самоагрегации тиакаликсарена, либо в результате его взаимодействия с ДНК было определено методом динамического светорассеяния в полистирольных кюветах при 25 °C. Измерение проводилось на анализаторе размеров наночастиц Zetasizer Nano ZS (Malvern), оснащённом 4 мВ He-Ne лазером с длиной волны - 633 нм, угол детектирования рассеянного света - 173о с автоматическим определением позиции измерения внутри кювет. Обработка результатов была выполнена программой DTS (Dispersion Technology Software 4.20). Эксперименты выполнялись в 10 мM буфере Tris-HCl в присутствие 10 мМ NaCl (pH=7.4). Концентрация рецепторов составляла 2.1·10-6 M, а для ДНК - 1.6·10-5 M. Были изучены системы с различным мольным соотношением (рецептор: ДНК = 0.26, 0.50, 1.00, 1.31, 1.95, 2.81, 3.90, 13.13, 100) после одночасового выдерживания. В ходе определения гидродинамического размера частиц для каждой системы было проведено не менее трех независимых экспериментов. Статистическая обработка данных проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Ошибка метода динамического светорассеяния при определении размера частиц составляет менее 2 %.

2.Результаты и их обсуждение

Для того чтобы ввести дополнительные возможности образования водородных связей в макроцикле, в дополнение к свойствам обусловленным аминогруппами, нами был выбран олигоамин N-(2-гидроксиэтил) этилендиамин, содержащий две аминогруппы и гидроксильную группу, разделенные этиленовыми линкерами в качестве реагента для функционализации тетраэфиров п-трет-бутилтиакаликс[4]арена 1 и 2. Известно, что реакции аминолиза хорошо протекают в метаноле [23]. Однако, тетраэфиры 1 и 2 плохо растворимы в данном раствори-теле, причем конфигурационный изомер 1,3-альтернат растворим хуже, чем изомер конус, поэтому было решено использовать толуол, как второй растворитель с метанолом в соотно-шениях 3:1 и 2:1 соответственно. Аминолиз тетраэфиров 1 и 2 N-(2-гидроксиэтил)этиленди-амином в смеси растворителей толуол/метанол при нагревании привел к тетразамещенным продуктам (3 и 4), каждый фрагмент которых содержит концевую гидроксильную группу, отделенную от вторичной аминогруппы этиленовым линкером (схема).

Схема. Синтез соединений 3, 4

В ЯМР-спектре 1H соединения 3 (рис. 1), сигналы трет-бутильных, оксиметиленовых и ароматических протонов наблюдаются в виде синглетов при 1.07, 4.79 и 7.39 м.д. соответственно. Сигналы амидных протонов при оксиметиленовом фрагменте проявляются как уширенный триплет в слабом поле при 8.36 м.д. с константой спин-спинового взаимодействия 3JHH = 5.7 Гц. Протоны метиленовых групп «А» и «B» представляют мультиплет при 3.26 м.д и триплет в области 2.63 м.д. с константой спин-спинового взаимодействия 3JHH = 6.5 Гц соответственно. Аналогично метиленовые протоны -NHCH2CH2OH фрагмента наблюдаются как триплеты («C», «D») в области при 2.70 и 3.42 м.д с константами спин-спинового взаимодействия 3JHH = 5.8 и 5.6 Гц соответственно.

В спектре ЯМР 1H соединения 4 в конфигурации 1,3-альтернат наблюдается та же мультиплетность, но с небольшими отличиями в химических сдвигах сигналов протонов, за исключением сигналов оксиметиленовых групп (синглет при 3.91 м.д.) и амидных протонов (уширеный триплет при 7.79 м.д. с константой спин-спинового взаимодействия 3JHH = 5,4 Гц), которые существенно различаются по химическим сдвигам в сравнении с 3. Следовательно, химические сдвиги, мультиплетность и интегральная интенсивность сигналов протонов в ЯМР 1Н спектров соединения 3 и 4 хорошо согласуются с предлагаемой структурой.

Молекулярные массы ионов соединений 3 и 4, полученные с помощью MALDI-TOF масс спектрометрии (соединение 3: m/z [M+H]+ = 1297.8, [M+Na]+=1319.9 и соединение 4: m/z [M+H]+ = 1297.8) подтвердили предполагаемые структуры соединений 3 и 4.

Рис. 1. Спектр ЯМР 1Н соединения 3 (в (CD3)2SO, 25 єC, 400 МГц)

синтетический вектор фрагмент

Таблица. Размеры агрегатов (гидродинамические диаметры частиц d1, d2, d3, нм) и площади максимумов (S1, S2, S3, %) распределения частиц по интенсивности, образованных в результате самоассоциации и агрегации макроциклов 3, 4 (2.1·10-6 М) с ДНК из тимуса теленка (1.6·10-5 М) буфере 10 мM буфере Tris-HCl в присутствие NaCl (pH = 7.4)

Таблица

Одним из обязательных свойств эффективных трансфекционных агентов является их способность образовывать наноразмерные агрегаты с молекулами ДНК. В растворе ДНК находится в глобулярной форме, причем глобула может быть практически развернутой, а может быть довольно компактной, что сильно зависит от ионной силы раствора, особенно от присутствия катионов металлов [24]. Способность ДНК изменять конформацию реализуется при транспорте ДНК через клеточную мембрану. В связи с этим биомолекулы или синтетические вещества, способствующие образованию компактной конформации, имеют большое значение для невирусного переноса (трансфекции) нуклеиновых кислот [25]. Поэтому было исследована способность синтезированных N-(2-гидроксиэтил)этилендиамин производных п-трет-бутилтиакаликс[4]арена в конфигурациях конус (3) и 1,3-альтернат (4) образовывать наноразмерные агрегаты с ДНК из тимуса теленка. Несмотря на то, что у данного заместителя отсутствует первичная аминогруппа, заместители в макроциклах 3, 4 содержат дополнительную гидроксильную группу, что должно увеличить сродство к ДНК за счет межмолекулярных взаимодействий гидроксигруппы с фосфатными и углеводными группами ДНК. В растворах модельной ДНК с концентрацией 1.6·10-5 моль/л методом динамического светорассеяния показано образование агрегатов микронного размера (таблица). При этом наб-людалось достаточно высокое значение индекса полидисперсности PDI = 0.65.

Рис. 2. Размерное распределение частиц по интенсивности для раствора 4 (2.1·10-6М) + ДНК из тимуса телёнка (1.6 · 10-5 М) в мольном соотношении [H]/[G] = 0.26 по числу частиц в буфере (10 мM Tris-HCl, 10 мM NaCl, pH = 7.4)

Рис. 3. Размерное распределение частиц по интенсивности для раствора 3 (2.1·10-6М) + ДНК из тимуса телёнка (1.6·10-5 М) в мольном соотношении [H]/[G] = 13.13 частиц в буфере (10 мM Tris-HCl, 10 мM NaCl, pH=7.4)

Методом динамического светорассеяния (таблица) показано, что взаимодействие соединений 3 и 4 с ДНК не привело к образованию агрегатов наночастиц. Даже при высоком мольном соотношении «соединение/ДНК», равном 13.13, в случае соединений 3 и 4 образуются агрегаты сравнительно больших размеров с высоким индексом полидисперности. Тем не менее, из таблицы видно, что макроцикл 3 в конфигурации конус способен образовывать монодисперсные системы (PDI = 0.24±0.02) и упаковывать молекулы ДНК в агрегаты с наименьшим размером 239.6±9.03 нм при высоком мольном соотношении [H]/[G] = 13.13 (рис. 2). Наоборот, макроцикл 4 в конфигурации 1,3-альтернат образует монодисперсные системы, содержащие агрегаты с размером 492.1±41.9 нм при низком мольном соотношении [H]/[G] = 0.26 (рис. 3). Причем гидродинамический размер агрегатов 4/ДНК в два раза больше агрегатов 3/ДНК. Очевидно, это обусловлено различной формой агрегатов и способностью различных конфигураций макроцикла (конус, 1,3-альтернат) к «упаковыванию» ДНК [26, 27].

Невысокую способность синтезированных каликсаренов 3 и 4 к агрегации с ДНК из тимуса теленка, по-видимому, связана с низким количеством групп, способных к водородному связыванию с фрагментами ДНК (амино-, гидрокси-, аммонийных групп) в структуре тиакаликс[4]арена, а также с их высокой склонностью к самоагрегации в условиях эксперимента (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ NaCl, рН = 7.4). Несмотря на это, была продемонстрирована способность соединений 3 и 4 к взаимодействию с ДНК из тимуса теленка и образованию агрегатов «макроцикл/ДНК».

Заключение

синтетический вектор фрагмент

Таким образом, синтезированы производные п-трет-бутилтиакаликс[4]арена, функционализированные по нижнему ободу фрагментами N-(2-гидроксиэтил)этилендиамина в конфигурациях конус и 1,3-альтернат. Структура и состав новых производных 3 и 4 были охарактеризованы ЯМР 1H, 13C, 2М ЯМР NOESY 1H-1H, ИК спектроскопией, масс-спектрометрией (MALDI-TOF) и элементным анализом. Исследована способность синтезированных макро-циклов образовывать наноразмерные агрегаты с молекулами ДНК.

1. Впервые синтезированы производные п-трет-бутилтиакаликс[4]арена, функционализированные по нижнему ободу фрагментами N-(2-гидроксиэтил)этилендиамина в конфигурациях конус и 1,3-альтернат.

2. Продемонстрирована способность соединений 3 и 4 к взаимодействию с ДНК из тимуса теленка и образованию агрегатов «макроцикл/ДНК». Показано, что макроцикл 3 в конфигурации конус способен образовывать монодисперсные системы агрегатов с ДНК при высоком мольном соотношении [H]/[G], в то время как макроцикл 4 в конфигурации 1,3-альтернат, наоборот, образует монодисперсные системы агрегатов при низком мольном соотношении.

Литература

синтетический вектор фрагмент

1.Gao X., Kim K.-S., Liu D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. AAPS J. 2007. Vol.9. P.E92-104.

2.Stryer L. Biochemistry. W. H. Freemand. New York Biochem. Text. 1995. P.1120.

3.Nimse S. B., Kim T. Biological applications of functionalized calixarenes. Chem. Soc. Rev. 2013. Vol.42. P.366-386.

4.Schьhle D. T., Peters J.A., Schatz J. Metal binding calixarenes with potential biomimetic and biomedical applications. Coord. Chem. Rev. 2011. P.2727-2745.

5.Gokel G. W., Leevy W.M., Weber M.E. Crown ethers: sensors for ions and molecular scaffolds for materials and biological models. Chem. Rev. 2004. Vol.104. P.2723-2750.

6.Drain C. M., Varotto A., Radivojevic I. Self-organized porphyrinic materials. Chem. Rev. 2009. Vol.109. P.1630-1658.

7.Sansone F., Baldini L., Casnati A., Ungaro R. Calixarenes: from biomimetic receptors to multivalent ligands for biomolecular recognition. New J. Chem. The Royal Society of Chemistry. 2010. Vol.34. P.2715.

8.Evtugyn G.A., Shamagsumova R.V., Padnya P.V., Stoikov I.I., Antipin I.S. Cholinesterase sensor based on glassy carbon electrode modified with Ag nanoparticles decorated with macrocyclic ligands. Talanta. 2014. Vol.127. P.9-17.

9.Evtugyn G.A., Younusov R.R., Ivanov A.N., Sitdikov R.R., Galuchin A.V., Budnikov H.C., Stoikov I.I., Antipin I.S. Cholinesterase Biosensors Based on Screen-Printed Electrodes Modified with Co-Phtalocyanine and Polycarboxylated Thiacalixarenes. Electroanalysis. 2012. Vol.24. P.554-562.

10.Evtugyn G.A., Shamagsumova R.V., Sitdikov R.R., Stoikov I.I., Antipin I.S., Ageeva M.V., Hianik T. Dopamine Sensor Based on a Composite of Silver Nanoparticles Implemented in the Electroactive Matrix of Calixarenes. Electroanalysis. 2011. Vol.23. P.2281-2289.

Размещено на Allbest.ru