Ионный обмен на сильных ионитах

Полная исследовательская публикация ___________________________________ Донцов А.Г.

Размещено на http://www.allbest.ru/

28 ________________ http://butlerov.com/ _____________ ©--Butlerov Communications. 2013. Vol.33. No.2. P.27-32.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ионный обмен на сильных ионитах

Одним из направлений исследований в биохимии является установление взаимосвязи между структурой и физиологической активностью природных биополимеров, таких напри-мер, как пектины, многие из которых проявляют иммуностимулирующее действие [1].

Структурно-химические исследования пектиновых полисахаридов проводятся на основе направленного ферментативного гидролиза, который позволяет не только установить их состав и строение, но и получить новые физиологически активные фрагменты [2, 3].

В природе деструкцию пектиновых веществ проводят внеклеточные пектиназы с различными механизмами действия.

Важной группой пектинолитических ферментов являются полигалактуроназы, которые катализируют гидролитическое расщепление б - (1,4) - связей между неэтерифицированными остатками галактопиранозилуроновых кислот D-галактуронанов. Эндополигалактуроназы разрушают D-галактуронаны неупорядоченным образом с предпочтительным гидролизом внутренних связей полимера, тогда как экзополигалактуроназы отщепляют концевые остатки D-галактуроновой кислоты [4].

Основными требованиями к ферментным препаратам для структурных исследований пектинов являются их высокая чистота и активность, что определяется необходимостью исследования продуктов гидролиза. В связи с этим целью настоящего исследования являлся поиск физико-химических методов воздействия на растворы пектиназ, приводящих одновременно к их очистке и активации.

Примеры очистки и выделения полигалактуроназ из культуральных жидкостей и ферментных препаратов приведены в работах [5-9]. В них описано использование различных комбинаций физико-химических методов таких как, осаждение солями и органическими растворителями, ультрафильтрация, адсорбция, ионный обмен, а также методов адсорбционной, ионообменной, гидрофобной и эксклюзионной колоночной хроматографии.

Характерным недостатком практически всех методик очистки являются потери активности на каждой стадии обработки (5-10%), что в итоге приводит к существенному снижению выхода целевого продукта в пересчете на активность.

Как правило, эффективность процессов очистки ферментов оценивают по увеличению их удельной активности (единицы активности/мг белка), что в целом можно рассматривать как активацию полученного препарата.

Однако следует учитывать, что рост удельной активности достигается преимущественно за счет удаления из раствора неактивных белков и не всегда связан с увеличением активности самих ферментов. Практическим результатом активации ферментов должен быть не только рост удельной активности, но также и увеличение выхода ферментативной активности после обработки.

Активность ферментов является кинетической величиной и определяется как начальная скорость образования продукта ферментативной реакции или деструкции субстрата. В строении ферментов заложена возможность регуляции их активности за счет изменения пространственной конфигурации молекул при взаимодействии активных и аллостерических центров, за счет обратимого образования олигомерных ассоциатов или при контролируемой метаболитами адсорбции ферментов на субклеточных структурах.

Регуляция активности внутриклеточных ферментов строго детерминирована взаимодействиями с продуктами предыдущих биохимических реакций, ингибирующими или активирующими ферменты. Так, например, связывание метаболитов-регуляторов в аллостерических центрах белковой молекулы способно привести к их взаимодействию с активными центрами и изменению конформационного состояния молекулы фермента. Это влечет за собой изменение каталитических характеристик активных центров. Подобный механизм регуляции активности ферментов называется аллостерическим, а метаболиты-регуляторы называют аллостерическими эффекторами.

Изменение активности внутриклеточных ферментов может происходить при образовании ассоциатов большего размера, чем исходные молекулы или олигомерных структур, построенных из отдельных субъединиц. Связи между субъединицами имеют, как правило, нековалентный характер, что в определенных условиях определяет возможность диссоциации ассоциатов на отдельные субъединицы, отличающиеся по каталитической активности от ферментного олигомера. Положение равновесия между олигомерными формами фермента регулируется присутствием коферментов и аллостерических эффекторов. Подобный механизм регуляции активности ферментов называется диссоциативным.

Существует также адсорбционный механизм регуляции активности внутриклеточных ферментов, который реализуется в случае контролируемой метаболитами адсорбции ферментов субклеточными структурами, например мембранами клеток. В этом случае адсорбированные ферменты имеют иное микроокружение, нежели в растворе, и, соответственно, иные каталитические характеристики.

Адсорбированные ферменты проявляют большую стабильность по сравнению со свободными ферментами [10].

Внеклеточные ферменты, находясь в растворе, также испытывают в той или иной степени влияние микроокружения. Помимо того, что сами ферменты могут содержать в эффекторных центрах остатки субстрата, присутствующие в растворе примеси, не обладающие каталитической активностью, могут воздействовать на ферменты снижая их активность. Так, например, показано, что ионы металлов, присутствующие в ферментных растворах, могут ингибировать [5, 11] или активировать [12] действие пектинолитических ферментов.

Присутствие в растворе неактивных белков способно привести к образованию ассоциатов с молекулами ферментов за счет ионных или гидрофобных взаимодействий и возникновению стерических затруднений при функционировании активных центров молекул ферментов. Кроме того, известно, что многие пектиназы являются гликопротеинами, то есть содержат в своем составе олиго- или полисахаридные цепи, связанные с основной молекулой фермента ковалентными связями. Величина углеводного остатка, по-видимому, также будет влиять на пространственное расположение активных и эффекторных центров и на подвижность молекул фермента в растворе.

Учитывая сказанное, представляется возможным создание процессов очистки и выделения ферментов при которых в результате удаления ингибиторов и снижения степени воздействия ингибирующих факторов, помимо высокой степени очистки будет достигаться также и активация ферментов.

Метод ионного обмена широко применяют для фракционирования ферментов, а также для удаления ионогенных примесей из ферментных растворов.

Для ионообменной очистки полигалактуроназ используют, главным образом, слабые ионообменники на основе целлюлозы, агарозы и декстрана [5, 6, 11, 12].

Слабые ионообменники позволяют проводить очистку ферментов в «мягких» условиях, но имеют низкую обменную емкость. Считается, что сильнокислотные и сильноосновные иониты могут приводить к существенной инактивации и даже денатурации ферментов вследствие высокой разницы значений рН в объеме раствора и вблизи поверхности ионитов (эффект Доннана) [13]. Тем не менее, такие их характеристики, как высокая обменная емкость и широкий рабочий диапазон значений рН среды могут оказаться полезными для очистки и препаративного получения ферментных препаратов.

В данной работе приведены результаты применения метода ионного обмена на сильных ионитах для препаративной очистки и активации полигалактуроназ.

В работе использовали сильнокислотные катионообменные смолы Amberlite CG-120 (США) и КУ-2 (Россия), сильноосновную анионообменную смолу Amberlite CG-400 (США), а также слабый катионит КБ-4 (Россия), полигалактуроновую и б-D-галактуроновую кислоты (ICN, США). Все другие использованные реактивы имели аналитическую чистоту. Для унификации гранулометрического состава смолы просеивали и отбирали фракции с размерам частиц от 100 до 250 мкм. Смолы КУ-2 и КБ-4 перед просеиванием размалывали после высушивания при 105°С. Источником полигалактуроназ являлся коммерческий ферментный препарат Пектофоетидин Г3х (Приволжский биохимзавод), полученный при глубинном культивировании гриба Aspergillus foetidus.

Полигалактуроназную активность оценивали по образованию восстанавливающих сахаров с помощью метода Шомоди-Нельсона [14], используя D-галактуроновую кислоту в качестве стандарта.

Полигалактуроновую кислоту (ПГК) использовали как субстрат. Анализ проводили путем инкубации 0.1 мл ферментного раствора с 0.1 мл 1.0%-го раствора ПГК в 0.1 М Na-ацетатном буфере (рН 5.0) при 50°C в течение 10 мин. Единица активности соответствовала количеству ферментов, приводящему к образованию 1 мМ восстанавливающих сахаров в пересчете на D-галактуроновую кислоту за 1 минуту при рН 5.0 и оптимальной температуре 50°C.

Удельную активность рассчитывали как соотношение активности раствора (ед/мл) и концентрации белка (мг/мл), установленной по модифицированному методу Лоури [15]. Цветность ферментных растворов оценивали путем определения их оптической плотности при л = 340 нм на фотоколориметре КФК 3-01 (Россия).

Все операции по очистке ферментов выполняли при комнатной температуре путем добавления 80-100 г. смолы к 1000 мл ферментного раствора с последующим перемешиванием в течение 30 мин. и фильтрованием. Концентрация ферментных растворов составляла 10 г./л. Сорбцию полигалактуроназ на катионообменниках проводили после концентрирования и обессоливания ферментных растворов с помощью диафильтрации против 0.1 М ацетатного буфера с рН 4.5 на установке «Миллипор» (США) со спиральным модулем TFF-6 с пределом пропускания 30 кДа. Десорбцию пектиназ со смол проводили с помощью 0.25 М фосфатного буфера с рН 6.0.

При разработке комбинированных способов очистки ферментных растворов важно учитывать селективность отдельных методов при удалении неактивных примесей в целях сохранения исходной активности ферментов в процессе очистки. Для оценки селективности очистки с помощью сильных ионитов мы использовали показатель S_p, равный соотношению степени очистки и величины потерь общей активности исходного ферментного раствора при заданном значении рН. Учет селективности отдельных методов очистки помогает правильно определить их последовательность в комбинированных способах очистки.

Несмотря на то, что сильные иониты применяют главным образом для обессоливания воды при водоподготовке, для выделения и концентрирования ценных элементов и очистки сточных вод, они весьма эффективно снижают цветность ферментных растворов, обусловленную присутствием ионогенных органических примесей.

Степень обесцвечивания ферментных растворов сильно зависит от значений рН среды. Увеличение значения рН растворов приводит к снижению эффекта очистки для катионообменной смолы и, наоборот, к увеличению степени очистки для анионообменной смолы. Показано, что степень очистки по цветности для катионита составляет от 30 до 50, а для анионита - от 68 до 83% (рис. 1а).

а) б) в)

Рис. 1. Влияние рН среды (по оси абсцисс) при обработке растворов Пектофоетидина Г3х анионитом Amberlite CG-400 (1) и катионитом Amberlite CG-120 (2) на: а) степень очистки по цветности P_цв (%; по оси ординат), б) потери активности растворов (доля исходной активности, %; по оси ординат), в) изменение индекса избирательности очистки S_p растворов (по оси ординат)

пектинолитический анионит раствор полигалактуроназа

Более высокая степень очистки для анионообменника связана, по-видимому, с преобла-данием в ферментном растворе анионных примесей. Снижение общей активности ферментных растворов в ходе ионообменной очистки также определяется значением рН среды (рис. 1б).

Анализ данных (рис. 1а, б) показывает, что при максимальной степени очистки по цвет-ности наблюдаются и наибольшие потери ферментативной активности исходного раствора. Результатом влияния значений рН на цветность и активность ферментных растворов при ионообменных обработках является изменение показателя избирательности очистки S_p, максимальные значения которого отмечены для анионита при значениях рН от 3.0 до 4.0, а для катионита в диапазоне рН от 6.0 до 7.0 (рис. 1в).

Поэтому при использовании сильных ионитов в комбинированных схемах очистки, для увеличения выхода ферментов, целесообразно применять сильные аниониты в слабокислой, а сильные катиониты - в нейтральной среде.

Потери активности ферментных растворов при обработках сильными ионитами могут быть связаны либо с инактивацией ферментов, либо с их сорбцией. Если сорбция ферментов смолами является обратимым процессом, то они могут использоваться не только для очистки, но и для выделения ферментов.

Так как максимум рН-стабильности большинства пектинолитических ферментов находится в слабокислой среде, то наибольший интерес для их выделения из растворов представляют сильные катиониты.

Показано, что при обработке сильными катионитами максимальное снижение общей активности растворов наблюдается при значениях рН от 3.5 до 4.0 (рис. 2).

Увеличение рН раствора приводит к снижению величины потерь активности ферментов, а обработка при рН выше 5.0 способствует некоторой активации полигалактуроназ: общая активность растворов после обработки смолами КУ-2 и Amberlite CG-120 увеличивается по сравнению с исходной на 20-50%. Это можно объяснить удалением некоторых ингибиторов, таких как ионы металлов, многие из которых, например Cu²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Mn²⁺, снижают активность полигалактуроназ на 40-50% при концентрациях 0.5-1.0 mM [5, 11, 12]. Следует отметить, что для слабого катионита КБ-4 подобный эффект не наблюдался.

Для установления обратимости процесса сорбции полигалактуроназ и оценки степени их инактивации было проведено выделение ферментов с помощью катионообменных смол при различных значениях рН растворов.

Рис. 2. Изменение активности (% исходной величины; по оси ординат) раствора Пектофоетидина Г3х при обработке катионообменными смолами: КУ-2 (1), Amberlite CG-120 (2) и КБ-4 (3) в рабочем диапазоне pH среды (по оси абсцисс)

Обработки проводили после концентрирования и обессоливания растворов Пектофоетидина Г3х с помощью ультра- и диафильтрации. Степень инактивации полигалактуроназ оценивали по выходу активности после их десорбции со смол 0.25 М фосфатным буфером с рН 6.0.

а) б)

Рис. 3. Выход (а) ферментативной активности (%; по оси ординат) и изменение (б) удельной активности пектиназ (ед./мг белка; по оси ординат) после десорбции с катионообменных смол: КУ-2 (1), Amberlite CG-120 (2) и КБ-4 (3) в рабочем диапазоне pH среды (по оси абсцисс)

Как видно из рис. 3а, заметной инактивации полигалактуроназ при обработке сильными катионитами не происходит. Напротив, при сорбции в диапазоне рН от 4.0 до 5.0 наблюдается некоторая активация ферментов после их десорбции: выход ферментативной активности увеличивается в 1.25-1.50 раза от количества адсорбированной активности.

По-видимому, это можно объяснить тем, что полигалактуроназы, являясь гликопротеинами, содержат в своей структуре углеводные фракции, которые могут действовать как аллостерические эффекторы. Углеводная часть может состоять из ковалентно-связанных фрагментов и из пектиновых остатков, связанных ионными связями.

Вероятно, в результате образования более прочных ионных связей между ферментами и смолами происходит вытеснение нековалентно-связанных углеводных фрагментов, выступающих в роли аллостерических эффекторов и снижающих активность ферментов.

Важным результатом является также устранение после десорбции ферментов действия ингибиторов, присутствавших в исходном растворе. Анализ изменения удельной активности полигалактуроназ после их десорбции со смол показывает (рис 3б), что высокая избирательность сорбции с помощью катионообменников наблюдается при значениях рН от 4.0 до 5.0. Наибольшую избирательность проявляют смолы КУ-2 и КБ-4. Однако смола КБ-4 является слабым катионообменником и имеет низкую обменную ёмкость, что может создать трудности при ее использовании в препаративных процессах очистки.

Для достижения высокой селективности очистки полигалактуроназ и увеличения выхода ферментативной активности целесообразно применять сильные аниониты в слабокислой (рН 4.0), а сильные катиониты - в нейтральной среде (рН 6.0-7.0). При строгом соблюдении оптимальных условий обработки удается избежать существенной инактивации ферментов. Сильнокислотные катиониты можно использовать с высокой эффективностью не только для очистки, но также для выделения полигалактуроназ из раствора и их активации. Применение сильных катионитов для очистки и выделения полигалактуроназ из ферментных растворов позволяет увеличить выход целевого продукта по активности на 20-50%.

Литература

пектинолитический анионит раствор полигалактуроназа

[1] S.V. Popov, G. Yu. Popova, R.G. Ovodova et al. Anti-inflammatory activity of the pectic polysaccharide from Comarum palustre. Fitoterapia. 2005. Vol.76. Р.281-287.

[2] M.A.K. Williams, G.M.C. Buffet, T.J. Foster et al. Simulation of endo-PG digest patterns and implications for the determination of pectin fine structure. Carbohyd. Res. 2001. Vol.334. P.243-250.

[3] W.G.T. Willats, L. Mc Cartney, W. Mackie. Pectin: cell biology and prospects for functional analysis. Plant Mol. Biol. 2001. Vol.47. Р.9-27.

[4] Родионова Н.А., Безбородов А.М. О локализации систем ферментов, катализирующих расщепление полисахаридов растительных клеточных стенок у высших растений. Пектиназы (Обзор). Прикл. биохим. Микробиол. 1997. Т.33. №5. С. 467-487.

[5] N.A. Devi, G.A. Appu Rao. Fractionation, purification, and preliminary characterization of polygalacturonases produced by Aspergillus carbonarius. Enzyme Microb. Technol. 1996. Vol.18. No.1. P.59-65.

[6] D.R. Kashyap, S. Chandra, A. Kaul et al. Production, purification and characterization of pectinase from a Bacillus sp. DT7. World J. Microbiol. Biotechnol. 2000. Vol.16. P.277-282.

[7] C. Oliva, M. Regente, M. Feldman et al. Purification and characterization of an endopolygalacturonase produced by Sclerotinia sclerotiorum. Biologia plantarum. 1999. Vol.42. No.4. P.609-614.

[8] Донцов А.Г., Хозяинова З.В., Шубаков А.А., Оводов Ю.С. Cпособ получения пектолитического ферментного препарата. Патент №2195492. Россия. МПК⁷. С12N9/14. Заяв. 04.09.2000. Опубл. в БИ №36 27.12.2002.

[9] Донцов А.Г. Применение активных углей для очистки пектинолитических ферментов. Биотехнология. 2009. №6. С. 71-73.

[10] Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов. М.: Наука. 1992. 62 с.

[11] T. Kobayashi, N. Higaki, N. Yajima et al. Purification and properties of a galacturonic asid-releasing exopolygalacturonase from a strain Bacillus. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. Vol.65. No.4. P.842-847.

[12] N. Pathnak, G. Sanwal. Multiple forms of polygalacturonase from banana fruits. Phytochemistry. 1998. Vol.48. No.2. P.249-255.

[13] Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир. 1985. 358 с.

[14] N. Nelson. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. J. Biol. Chem. 1944. Vol.153. P.375-380.

[15] Донцов А.Г., Тарабукин Д.В., Ванчикова Е.В. Оптимизация условий определения белка в ферментных растворах по методу Лоури. Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2009. Т.75. №2. С. 18-20.

Размещено на Allbest.ru