Оценка некоторых биохимических показателей культуры ткани Panax ginseng C.A. Mey, культивируемой на стандартной среде и на среде с нанотрубками

Полная исследовательская публикация ______ Кириллова Н.В., Стрелкова М.А. и Спасенкова О.М.

Размещено на http://www.allbest.ru/

154 _____________ http://butlerov.com/ _____________ ©--Butlerov Communications. 2017. Vol.49. No.2. P.152-158.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оценка некоторых биохимических показателей культуры ткани Panax ginseng C.A. Mey, культивируемой на стандартной среде и на среде с нанотрубками

Кириллова Надежда Васильевна, Стрелкова Маргарита Андреевна, Спасенкова Ольга Михайловна Кафедра биохимии. ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академии».

Аннотация

Нанотехнологии являются одной из наиболее интенсивно развивающихся областей науки, в том числе, медицины и фармации. Современная технология позволяет работать с веществами в микрометровых и нанометровых масштабах, а именно такие размеры характерны для основных биологических структур - клеток, их основных органелл и молекул. Функционализированные нанотрубки могут служить переносчиками, как небольших молекул различных веществ, так и макромолекулярных комплексов. Применение нанотехнологий в медицине в основном касается таких её областей, как доставка активных биологически активных веществ, новые методы и средства лечения, диагностика на нанометровом уровне in vivo, диагностика in vitro, медицинские импланты, а также разработка разнообразных по структуре и функциональности молекулярных машин.

Клетки, ткани или органы высших растений, выращенные вне целого растительного организма на искусственных питательных средах, являются составной частью биотехнологии растений. Методы выращивания культур клеток, тканей и органов растений позволяют не только всесторонне исследовать как физиолого-биохимические характеристики растительного организма, но и предлагать принципиально новые клеточные технологии для промышленности, медицины, сельского хозяйства. В настоящее время культуры клеток растений, выращиваемые в строго контролируемых условиях, широко используются в качестве модели для оценки влияния различных факторов внешней среды на физиологические и биохимические процессы, также для фармакологического тестирования ксенобиотиков.

В данном исследовании проведена оценка влияния углеродных нанотрубок на некоторые биохимические процессы в культивируемых клетках Panax ginseng C.A. Mey. Изучен уровень активности основных ферментов антиоксидантной защиты и состояние биосинтетической способности культуры клеток ткани, выращенной на стандартной и на модифицированной углеродными нанотрубками средах. Показана возможность участия углеродных нанотрубок в регуляции клеточного метаболизма на уровне антиоксидантной ферментативной и белоксинтезирующей активности растительных клеток, культивируемых in vitro.

Ключевые слова: культура тканей лекарственных растений, антиоксидантная ферментативная активность, биосинтетическая активность, углеродные нанотрубки.

углеродный нанотрубка клетка метаболизм

Abstract

Nanotechnology is one of the most intensively developing fields of science specifically medicine and pharmacy. Modern technologies can make it possible to work with substances in macro- or nanometric manipulation because this scale is appropriate for the general biological structures namely cells, its organelles and molecules. Functionalized nanotubes may act either as small molecules transporters of different substances or as macromolecular complexes. Nanotechnology application in medicine mainly deals with biologically-active agents delivery, new methods and treatment facilities, diagnostic testing on nanoscale in vivo, diagnostic testing in vitro, medicinal implants along with molecular machine invention of different constructions and functionality.

All cells, tissue parts of higher plants cultivated outside the plant itself on artificial nutrient medium are considered to be of great interest for plant biotechnology. Growth methods of cell culture, tissue or parts of plants help not just study its physiological or biochemical peculiarities comprehensively but suggest absolutely revolutionary cell-structure technologies for industry, medicine, agriculture. At present time plant cells cultivated in strictly controlled conditions are widely used as models to assess the impact of environmental factors on physiological and biochemical processes along with xenobiotic pharmacological testing.

In this paper you can find the impact assessment of carbon nanotubes on some biochemical processes happened in cultivated cells Panax ginseng C.A. Mey. The degree of basic ferments activity in antioxidant support and biosynthetic ability of cell culture, grown on standard environment, as well as on that one which is modificated with the help of carbon nanotubes, are also given here. Carbon nanotubes can be applied to cell metabolism regulation at antioxidant fermented-scale activity and protein-synthesized activity of plant cells cultivated in vitro.

Keywords: tissue culture of medicinal herbs, antioxidant fermented activity, biosynthetic activity, carbon nanotube.

Введение

Нанотехнологии являются одной из наиболее интенсивно развивающихся областей науки и постепенно занимают все более важное место в таких ее областях, как в том числе, медицина и фармация [1, 2]. В настоящее время наномедицина предполагает внедрение достижений современных нанотехнологий при лечении наследственных и приобретенных заболеваний человека [3-6].

В настоящее время культивируемые растительные ткани и органы используются в качестве модели для изучения метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растительного организма растений для решения ряда фундаментальных теоретических проблем. В частности, выращивание клеток вне организма позволяют ученым лучше понять биохимические механизмы тех процессов, которые происходят в интактном растении [7-11]. В последние годы на основе культивируемых растительных тканей и органов были созданы промышленные технологии с целью получения экономически важных целевых продуктов [8]. В то же время получение высокопродуктивных штаммов тканей растений требует дальнейшего глубокого изучения биосинтетических процессов и способов их регуляции, а также биохимических механизмов усиления синтеза продуктов вторичного метаболизма.

Целью нашего исследования было сравнительное изучение основных биохимических показателей клеток женьшеня обыкновенного, культивируемых на стандартной среде и на среде, модифицированной углеродными нанотрубками.

1. Экспериментальная часть

Исследования проводили на культуре ткани женьшеня обыкновенного (Panax Ginseng C.A. Mey), выращенного на стандартной агаризованной среде Мурасиге и Скуга, модифицированной Н.Ф. Писецкой [12] (контрольная проба). Штамм P.Ginseng выращивали также на стандартной среде, которую готовили на воде, в которую предварительно были внесены углеродные нанотрубки (УН) в концентрации 1 : 100000 (опытная проба). Использованные углеродные нанотрубки принадлежат к семейству фуллереновых модификаций углерода, представляющие собой цельные однослойные цилиндрические структуры, образованные листками графита с наружным диаметром 0.6-2.4 нм [13, 14]. Продолжительность одного пассажа составляла 35-40 суток. В работе использовали ткань женьшеня 2-3 пассажей.

Для выделения цитозольной фракции навеску ткани женьшеня соответствующего возраста гомогенизировали в ступке на холоду с 0.1 М фосфатным буфером (рН = 7.8) в присутствии 0.1% тритона Х-100 при соотношении ткань-буфер 1: 10. Полученный гомогенат оставляли при 4 °С в течение 30 мин и затем центрифугировали на микрофуге В при 12000 g 5 мин. Осадок отбрасывали. Для анализа использовали супернатант, в котором определяли активность супероксиддисмутазы (СОД) [15], активность пероксидазы [16] и содержание белка по методу Лоури [17]. Представленные результаты обрабатывали статистически. Для оценки различий между экспериментальными данными использовали критерий Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне вероятности p ? 0.05.

2. Результаты и их обсуждение

Выбор ферментов в данной работе был не случаен. Ферменты СОД и пероксидаза являются основными ферментами клеточного метаболизма кислорода и принимают активное участие в регуляции свободнорадикальных процессах в клетках. В частности, СОД регулирует содержание супероксидных радикалов, препятствуя образованию более токсичных активных форм кислорода (синглетного кислорода, гидроксильного радикала и другие).

Жизненно важным ферментом для высших растений является пероксидаза, которая обеспечивает ферментативное окисление различных субстратов (фенолов, ароматических аминов, индоламинов, НАД(Ф)Н и другие). Кроме того, одной из основных функций пероксидазы является защита растений от неблагоприятных биотических и абиотических факторов. Биосинтетическую способность культивируемых клеток оценивали по содержанию общего белка, так как именно этот показатель определяет скорость роста ткани. Таким образом, сопоставление биохимических показателей, указанных выше, дает возможность использовать их в качестве маркеров физиологического состояния клеток и позволяет проводить сравнительный анализ культивируемых клеток в норме и при действии различных факторов, в частности, при введении в культивируемую среду нанокомпонентов (углеродных нанотрубок).

Данные проведенных ранее исследований свидетельствуют о высокой биосовместимости и отсутствии токсичности у нанотрубок в концентрациях до 10 мкМ [18].

Существует три способа использования нанотрубок для доставки и высвобождения биологически активных веществ [19]. Первый способ заключается в сорбировании активных молекул на сети нанотрубок или внутри их пучка. Второй способ предполагает химическое присоединение вещества к внешней стенке нанотрубок. Третий способ предполагает помещение молекул вещества внутрь просвета нанотрубок. Важным этапом превращения нанотрубок в эффективный носитель вещества является функционализация поверхности нанотрубок [20], то есть присоединение к ней химических группировок, играющих роль связующего звена между поверхностью наночастиц и молекулой вещества. Существует несколько методов функционали-зации нанокомонентов. Во первых, функционализации могут подвергаться дефектные участки стенок нанотрубок. Во-вторых, функционализация может обеспечиваться ковалентным или нековалентным связыванием химических групп с поверхностью интактной стенки. Стабилизация субмолекулярных структур в результате нековалентных связей осуществляется за счет вандер-ваальсовых или р-р-стекинг взаимодействий. Особый интерес представляют конъюгаты с пептидами и белками, причем, способность связываться коррелирует с количеством ароматических аминокислот в пептиде.

Покрытые пептидами нанотрубки объединяются в волокна, в которых нанотрубки расположены по оси волокна. Нанотрубки могут служить переносчиками как небольших молекул, так и макромолекулярных комплексов. Большой интерес представляют результаты исследований, посвященных переносу с помощью нанотрубок молекул белков и нуклеиновых кислот. Присоединение к нанотрубкам молекул интерферирующей РНК, направленной против обратной транскриптазы теломеразы, с последующим введением данной конструкции в клетки вызывало эффективное подавление экспрессии гена-мишени [21]. Вопрос доставки нанотрубок внутрь клетки различных молекул и механизмы взаимодействия нанотрубок с клетками остается неясным до последнего времени. При этом, одни авторы считают, что нанотрубки поступают в клетку путем эндоцитоза [22]. Если на поверхности нанотрубок адсорбированы белки, то при последующим взаимодействии этого комплекса с клеточными мембранами происходит его интернализация с образованием эндосом и далее эндосомы транспортируются в цитоплазму клеток или клеточные органоиды. Возможен также транспорт нанотрубок и в клеточное ядро. Другие авторы рассматривают в качестве возможного механизма транспорта диффузию каркаса нанотрубок в липидный бислой [23].

Еще один вариант использования нанотрубок в качестве носителей биологически активных веществ основан на помещении активной молекулы в просвет нанотрубки, что превращает последнюю в своеобразный наноконтейнер [24].

В настоящем исследовании проводили сравнительное изучение метаболических процессов на модели культивируемых растительных клеток в стандартных условиях и при введении в биологическую систему углеродных нанотрубок (УН). Экспериментальные данные, полученные в данном исследовании представлены на рис. 1-3. Как видно из представленных данных (рис. 1), активность СОД изменяется фазно и отмечается два максимума ферментативной активности - на 25 и на 35-37 сутки роста как для контрольных, так и для опытных проб.

Как было установлено в ранее проведенных исследованиях на этих этапах культивирования Panax ginseng возрастает также и митотический индекс [25].

Рис. 1. Активность СОД в культивируемых клетках Panax Ginseng в контрольных и опытных образцах

Возрастание митотического индекса связано с процессами дыхания и повышением потребления кислорода делящимися клетками. Эти процессы приводят к повышению активности дыхательных ферментов, что, в свою очередь, обуславливает усиленную генерацию активных форм кислорода и приводит к нарушению окислительно-восстановительного равновесия в клетках, в адаптивной регуляции которого особая роль отводится ферментам антиоксидантной защиты. К ферментам первой линии антиоксидантной защиты относится СОД. Повышение активности этого фермента в контрольных и опытных образцах отмечается на всех этапах культивирования, причем, этот процесс в большей степени выражен для культуры, выращенной на среде с нанотрубками. Уровень активности СОД в опытной пробе был выше контрольных значений на 25 сутки роста - на 23%, на 30 сутки - на 10% и на 37 сутки роста - на 15% соответственно.

Пероксидазная активность в контрольных образцах описывается двумя максимумами на 16 и 25 сутки роста и с последующим повышением ферментативной активности после 30 суток (рис. 2). У опытных образцов также отмечались 2 пика ферментативной активности - на 20 и 35 сутки культивирования.

Рис. 2. Активность пероксидазы в культивируемых клетках Panax Ginseng в контрольных и опытных образцах

Активация фермента на 15-20 сутки связана с увеличением потребления кислорода активно делящимися клетками. Возрастание пероксидазной активности на поздних этапах культивирования (35-37 сутки) совпадает с окончанием активного прироста биомассы, актива-цией процессов старения, накоплением токсических перекисных соединений, являющимися истинными субстратами для пероксидазы.

Для культуры, выращенной на питательной среде с нанотрубками, также характерны некоторые модификации пероксидазной ферментативной активности. Активность пероксидазы на 20 сутки роста превышала контрольные значения на 30% и на 10% к 35 суткам в опытных образцах. Это связано с особенностями метаболизма перекиси водорода и ее утилизации клетками в опытных образцах в процессе старения ткани на поздних этапах ее культивирования.

Рис. 3. Содержание белка в культивируемых клетках Panax Ginseng в контрольных и опытных образцах

Биосинтетическую способность культивируемых клеток оценивали по содержанию общего белка (рис. 3). Как видно из представленных данных, максимальное накопление белка в культивируемых клетках женьшеня происходит с 10 по 20 сутки. Эта закономерность характерна и для опытных образцов, причем, содержание белка в опытных пробах превышало контроль на 12%. После двадцатых суток культивирования происходит постепенное снижение концентрации общего белка до 3.0 мг/г биомассы в опытных образцах и до 2.2 мг/г биомассы в контрольных пробах. К 25-30 суткам культура выходит в стационарную фазу роста, в которой ростовые процессы происходят за счет роста клеток растяжением, при этом в растягивающихся клетках идет интенсивный синтез белка

В наших экспериментах отмечен второй максимум содержания белка для опытных образцов (25 сутки роста). Содержание общего белка в опытных образцах достоверно увеличивалось после 20 суток выращивания культуры клеток по сравнению с опытными образцами. Еще в большей степени этот эффект был выражен на более поздних сроках культивирования растительной ткани. Так, на 37 сутки роста содержание внутриклеточного белка в контроле было снижено почти на 40% по сравнению с опытным образцом.

Заключение

В данной работе проведен анализ уровня активности основных ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы и пероксидазы) и биосинтетической способности культивируемых клеток по содержанию внутриклеточного белка в культуре Panax ginseng, выращенной на стандартной среде и в среде с нанотрубками. Сопоставление данных показателей, которые используются в качестве маркеров физиологического состояния клеток, показало, что введение в среду культивирования углеродных нанотрубок приводит к активации антиоксидантной ферментативной системы. Биосинтетическая (белоксинтезирующая) способность культивируемых клеток Panax ginseng на среде с нанотрубками значительно возрастала после 15 суток роста и превышала контрольные значения вплоть до 37 суток (на 30-40%).

Полученные результаты указывают, по-видимому, на то, что механизмы внутриклеточного транспорта растительных клеток обеспечивают поступление нанотрубок в жизнеспособные компартменты клетки и возможность регуляции обменных процессов на молекулярном уровне (матричная активность генов и регуляция биосинтеза белка на уровне транскрипции и трансляции). Наряду с этим, нанотрубки могут увеличивать количество пластического материала в клетке, представляя собой молекулярный транспортер для доставки белков, аминокислот и так далее in vivo. Поверхность нанотрубок заряжена отрицательно и лучшее связывание происходит с основными белками и аминокислотами за счет электростатических взаимодействий. Клетки захватывают эти конъюгаты эндоцитозом, а после высвобождения из эндосом конъюгаты поступают в цитоплазму, при этом белок остается нативным и не теряет своей биологической активности. Кроме того, нанотрубки способны и сами как образовывать транспортные каналы, так и выполнять роль блокаторов ионных каналов [1, 3].

Выводы

1. Активность супероксиддисмутазы в опытных образцах превышала контрольные значения на 15-20%. В стационарной фазе роста активность пероксидазы в опытной пробе возрастала до 30% на фоне контрольных образцов.

2. Белоксинтезирующая активность культивируемых клеток Panax ginseng C.A. Mey на среде с нанотрубками превышала контрольные значения в стационарной фазе роста на 30-40%.

Литература

1. Балабанов В.И. Нанотехнологии. Наука будущего. М.: Эксмо. 2009. 256с.

2. M. Foldvari, M. Bagonluri. Carbon nanotubes as functional exсipients for nanomedicines: pharmaceutical properties. Nanomedicine. 2008. Vol.4. No.3. Р.173-182.

3. Нанотехнологии в биологии и медицине. Сб. научных трудов под редакцией Шляхто Е.В. Изд-во Любавич. 2008. 320с.

4. Ощепков М.С., Цветкова О.И., Лебедева А.Ю., Федоров Ю.В., Федорова О.А. Молекулярные машины на основе супрамолекулярных систем. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.39. №10. С.1-22. ROI: jbc-01/14-39-10-1; M.S. Oschepkov, O.I. Tsvetkova, A.Yu. Lebedeva, Yu.V. Fedorov, O.A. Fedorova. Molecular machines based on supramolecular systems. Butlerov Communications. 2014. Vol.39. No.10. ROI: jbc-02/14-39-10-1

5. Горбачук В.В., Зиатдинова Р.В., Стойков И.И. Сорбция бычьего сывороточного альбумина гибридным органо-неорганическим материалом на основе наночастиц диоксида крмния, функционализированных кремнийорганическим производным тиакаликс[4]арена. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.39. №10. С.23-28. ROI: jbc-01/14-39-10-23; V.V. Gorbachuk, R.V. Ziatdinova, I.I. Stoikov. Sorption of bovine serum albumin with hybrid organo-inorganic material based on silicon dioxide nanoparticles, functionalized with organosilicon derivative of thiacalix[4]arene Butlerov Communications. 2014. Vol.39. No.10. ROI: jbc-02/14-39-10-23

6. Кусков А.Н., Куликов П.П., Бабкина С.С., Штильман М.И. Получение и анализ свойств наночастиц на основе амфифильного поли-N-винил-2-пррилидона. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.38. №4. С.109-118. ROI: jbc-01/14-38-4-109; A.N. Kuskov, P.P. Kulikov, S.S. Babkina, M.I. Shtilman. Preparation and analysis of the properties of nanoparticles based on amphiphilic poly-N-vinyl-2-pyrrolidone. Butlerov Communications. 2014. Vol.38. No.4. ROI: jbc-02/14-38-4-109

7. Носов А.М. Культура клеток высших растений - уникальная система, модель, инструмент. Физиология растений. 1999. Т.46. №6. С.837-844.

8. Пивоварова Н.С., Кириллова Н.В., Каухова И.Е., слепян Л.В., Марченко А.Л. Разработка технологии водных извлечений на основе биомассы штамма Polyscias filicifolia (Moore ex Fournier) Bailey. Бутлеровские сообщения. 2016. Т.45. №2. С.113-118. ROI: jbc-01/16-45-2-113; N.S. Pivovarova, N.V. Kirillova, I.E. Kaukhova, L.I. Slepyan, A.L. Marchenko. Development of water extraction technology on the basis of the biomass of polyscias Filicifolia (moore ex fournier) bailey strain Butlerov Communications. 2016. Vol.45. No.2. ROI: jbc-02/16-45-2-113

9. Кириллова Н.В., Слепян Л.И. , Каухова И.Е., Марченко А.Л., Пивоварова Н.С., Стрелкова М.А. Влияние постоянного магнитного поля на рост и биологическую активность клеток штамма Polyscias filicifolia (Moore ex Fournier) Bailey. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.37. №1. С.138-146. ROI: jbc-01/14-37-1-138; N.S. Pivovarova, N.V. Kirillova, L.I. Slepyan, I.E. Kaukhova, M.A. Strelkova. The influence of the permanent magnetic field on growth and biological activity of callus culture of Polyscias filicifolia (Moore ex Fournier) Bailey. Butlerov Communications. 2014. Vol.37. No.1. ROI: jbc-02/14-37-1-138

10. Стрелкова М.А., Кириллова Н.В., Пивоварова Н.С. Изменение уровня перекисного окисления липидов в культивируемых клетках ткани Polyscias filicifolia при воздействии постоянного магнитного поля. Бутлеровские сообщения. 2015. Т.43. №8. С.36-41. ROI: jbc-01/15-43-8-36; M.A. Strelkova, N.V. Kirillova, N.S. Kuzmina. The change in the level of lipid peroxidation in cultured cells tissue Polyscias filicifolia under the influence of a constant magnetic field. Butlerov Communications. 2015. Vol.43. No.8. ROI: jbc-02/15-43-8-36

11. Кириллова Н.В., Стрелкова М.А., Заблоцкая И.В. Влияние некоторых ксенобиотиков на состояние антиоксидантной ферментной системы культивируемых растительных клеток. Растительные ресурсы. 2003. Т.39. Вып.2. С.113-119.

12. Писецкая Н.Ф. К вопросу о подборе питательной среды для культуры ткани женьшеня. Растительные ресурсы. 1970. Т.6. Вып.4. С.516-522.

13. Слепян Л.И., Каухова И.Е., Громова О.Н., Кузьмин Н.С., Кириллова Н.В., Стрелкова М.А. Роль банков лекарственных растений в биотехнологии и фармации. Междисциплинарный научный и прикладной журнал «Биосфера». 2012. Т.4. №2. С.142-149.

14. Слепян Л.И., Каухова И.Е., Громова О.Н., Летенко Д.Г., Давыдов В.В. Оценка безопасности углеродных нанотрубок при культивировании штаммов клеток женьшеня. Межрегиональный тематический сборник научных трудов, посвященный 200-летию со дня рождения российского гения медицины и хирургии Н.И. Пирогова «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной патологии». Рязань. 2010. С.141-151.

15. H.P. Misra, I. Fridovich. The univalent reduction of oxygen by reduced flevins and quinines. J Biol. Chem. 1972. Vol.247. No.1. P.188-192.

16. J.H. Bovaird, T.T. Ngo, Y.M. Jen hott. Optimizing the o-phenilendiamine assay for horseeradish peroxidase: effects of phosphate and pH, substrate and enzyme concentrations, and stopping reagents. Clin. Chem. 1982. Vol.28. P.2423-2426.

17. O.H. Lowry, N.J. Rossenbrough, A.L. Farr, R.J. Randall. Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951. Vol.193. No.1. P.268-275.

18. Слепян Л.И., Каухова И.Е., Белявский Ю., Давыдов В.В. Нанотехнологии в фармации и медицине: некоторые достижения сегодня и большие перспективы в будущем. Актуальные проблемы клинической и экспериментальной патологии: сборник научных трудов, посвященный 100-летию со дня рождения А. Адо. Рязань. 2009. С.182-202.

19. M. Foldvari, M. Bagonluri. Carbon nanotubes as functional exсipients for nanomedicines: 2 Drug delivery and biocompatibility issues. Nanomedicine. 2008. Vol.4. No.3. Р.183-200.

20. J. Li, H. Ng, H. Chen. Carbon nanotubes for biomedical application. Methods mol. Biol. 2005. Vol.300. P.191-223.

21. Z. Zhang, X. Yang, Y. Zhang. Delivery of telomerase reverse transcriptase small interferring RNA in complex with positively charged single-walled carbon nanotubes suppresses tumor growth. Clin. Cancer Res. 2006. Vol.12. P.4933-4939.

22. N.W.S. Kam, T.C. Jessop, P.A. Wender, H. Dai. Nanotube molecular transporters: internalization of carbon nanotube-protein conjugates into mammalian cells. J. Am. Chem. Soc. 2004. Vol.126. P.6850-6851.

23. D. Pantarotto, R. Singh, D. Carthy. Functionalized carbon nanotubes for plasmid DNA gene delivery. Angew Chem Int Edn Engl. 2004. Vol.43. P.5242-5246.

24. K. Shaitan, Y. Tourleigh, D. Golic. Computer-aided molecular design of nanocontainers for inclusion and targeted delivery of bioactive compounds. J. Drug Del Sci Tech. 2006. Vol.16. P.253-258.

25. Высоцкая Р.И. Культура ткани женьшеня (биология и перспектива использования в медицине): Автореферат, дисс…. канд. биол. наук. Л. 1978. 27с.

Размещено на Allbest.ru