Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРCТВО ОБРAЗОВAНИЯ И НAУКИ РФ

ФГБОУ ВО «Тверской государственный университет»

Химико-технологический факультет

Направление «Химия»

Выпускная работа бакалавра

Качественный анализ антибиотиков тетрациклинового ряда методом тонкослойной хроматографии

Автор: Григорьева Наталья Николаевна

Научный руководитель

к.х.н., доцент Феофанова

Марианна Александровна

Тверь 2018



ВВЕДЕНИЕ

Антибиотики тетрациклиного ряда, как и сам тетрациклин, были открыты в середине ХХ столетия. Препараты этой группы схожи по фармалогическим свойствам, имеют общий механизм воздействия и имеют полную перекрестную резистентность. Имеют так же и различия: сила терапевтического эффекта, в метаболизме и в адсорбции.

К определению антибиотиков, интерес заметно вырос, особенно в наше время: хорошее противомикробное действие, значительно не высокая цена, огромный диапазон в использовании. Тетрациклины используются не только в медицине, но и в сельском хозяйстве: стимулятор роста животных, профилактика и лечение, производство кормов и продуктов питания - для увеличения их срока годности. Но, как и все антибиотики, тетрациклины, имеют свои недостатки и побочные эффекты, очень важно, соблюдать все правила и рекомендации врачей по применению препаратов данного ряда.

До сих пор, по широте спектра применения, антибиотики тетрациклинового ряда, занимают ведущие позиции среди множества ветеринарных препаратов. Тетрациклины присутствуют в продуктах питания, почве, воде, и их не разрешено использовать в особо крупных размерах так как они образовывают микроорганизмы устойчивые к антибиотикам, что неблагоприятно сказывается на здоровье человека. Но современных производителей животных и растительных продуктов питания данное свойство антибиотика не останавливает, и часто тетрациклины используют в больших количествах, ведь для сельских хозяйств есть масса «плюсов» в использовании этого не дорогого антибиотика: стимуляция роста, способность к повышению аппетита у животных и наилучшему использованию питательных веществ корма, что приводит к сокращению расходов корма, на значительное время сохраняют сроки годности, мяса, рыбы, овощей и фруктов.

Для обнаружения и отнесения антибиотиков тетрациклинового ряда имеется множество хроматографических методов. Совсем не давно был распространён метод бумажной хроматографии, он славился простым наличием аппаратуры и достаточно высокой скоростью анализа. Для придания сорбенту определенного свойства, его необходимо предварительно обработать соответствующим реагентом. Так, для антибиотиков тетрациклинового ряда, которые образовывают хелаты, что обуславливает снижение биодоступность тетрациклинов, используют пластинки с силикагелем, который пропитан раствором динатриевой соли ЭДТА. Так же для обнаружения многих антибиотиков пользуются противоточным распределением и электрофорезом. Метод газо - жидкостной хроматографии (ГЖХ) в последнее время не пользуется особым спросом в идентификации и разделении веществ и постепенно на его замену приходит высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), главные преимущества этого метода заключаются в том, что имеет при разделении высокую эффективность и скорость, так же детектирование элюента не имеет сопряженности с разрушением компонентов в исследуемой смеси. Но ВЭЖХ имеет и свои недостатки: при смене антибиотика необходимо менять режим детектирования, и систему растворителей, и второй существенный недостаток - невозможно анализировать сразу несколько смесей одновременно, в отличии от бумажной и тонкослойной хроматографии.

В настоящее время, для немногих антибиотиков из тысячи известных, разработаны методики идентификации, так же не все классифицированы. Из научных материалов, мне удалось обнаружить, что с помощью данных, обоснованных на методе тонкослойной хроматографии (ТСХ) классифицировали 151 антибиотик, борющиеся с опухолью. Методики обнаружения антибиотиков, во времени не претерпели существенных изменений.

В своей выпускной работе я буду проводить один из методов количественного анализа антибиотиков тетрациклинового ряда - это метод тонкослойной хроматографии. Данный метод имеет ряд преимуществ:

1) Экспрессность. В большинстве случаев нет необходимости в предварительной пробоподготовке (концентрирование, фильтрование, обезвоживание и т.д.). Простое приготовление анализируемой пробы. Сравнительно не долгая элюция, в зависимости от длинны хроматограммы, состава элюента.

2) Универсальность. В различных условиях и многомерного элюирования можно разделить многие образцы, так же есть возможность комбинировать элюенты, менять тип хроматографии.

3) Расход анализируемого вещества. Для данной выпускной работы мне потребовалось: 5,0664 гр. - тетрациклина и 1,3344гр. - доксициклина.

4) Простота выполнения методики ТСХ.

Нет необходимости в особых навыках и умениях.

5) Простота протоколирования результатов.

Хроматограмма может храниться достаточно длительное время в качестве «живого свидетеля» анализа. Можно так же фотосканировать, сканировать или фоторграфировать полученные окрашенные пятна.

6) Простота оборудования.

Для анализа понадобилась хроматографическая камера, хроматографическая пластина размером 10*10, подвижная фаза и УФ лампа.

7) Стоимость.

Метод ТСХ - один из самых дешевых и эффективных методов анализа. Поэтому я выбрала данный метод, как наиболее подходящий. Опираясь на литературные данные, я пришла к выводу, что в современной медицине особое внимание занимают антибиотики, они делятся на много видов, но наибольший интерес вызвал ряд тетрациклина, в этой работе я поставила перед собой цель, провести количественный анализ фармацевтических препаратов и разработать наиболее оптимальную методику по определению антибиотиков ряда тетрациклина

Для достижения цели мною были поставлены следующие задачи:

1. Выбор оптимального метода химического анализа содержания антибиотиков ряда тетрациклина в фармацевтических препаратах и их количественное определение.

2. Отработка метода на модельных объектах и фармацевтических препаратах.

3. Сделать выводы и дать рекомендации по применению выбранной мною методики для дальнейшего практического применения.



1. ЛИТЕРАТУРНЙ ОБЗОР

1.1 Общие сведения

Антибиотики ряда тетрациклина обнаружили при изучении почвенных грибов, собранных в разных уголках планеты. В 1949 году медицинской практике был предложен первый препарат - хлортетрациклин. Потом было выяснено, что тетрациклины имеют большой противомикробный диапазон, подавляющий рикситий, хламидий, грамотрицательных и грамположительных бактерий.

В настоящее время данные антибиотики назначают редко, так как при приеме широко распространены на практике резистетные штаммы микроорганизмов и серьезные побочные эффекты. Антибиотики ряда тетрациклина разделают на природные и полусинтетически. В современном мире из природных лекарств применяют только тетрациклин, тетрациклин гипохлорид и окситетрациклин. На практике же, наибольшие внимание привлекают полусинтетические тетрациклины: доксициклин ( вибрамицин), гликоциклин (миноцин), метациклин (родномицин), которые вытеснили другие препараты этой группы

доксициклин тетрациклин антибиотик хроматография

1.2 Тетрациклин и его физико-химические свойства

Суммарная формула: C22H24N2O8. Молекулярная масса: 444,4 г / моль.

Тетрациклин - натуральный антибиотик, является основанием, светло-желтый кристаллический порошок, не имеет запаха, горький на вкус, гигроскопичен; при длительноми хранении на свету - он темнеет. При 28° С растворимость в воде составляет 1,7 мг/мл. Растворяется в метаноле, формамиде, пиридине, этиленгликоле. Не растворяется в бензоле, эфире и петролейном эфире, ацетоне. Имеет амфотерные свойства, что и подтверждает способность образовывать соли с неорганическими и органическими кислотами, щелочными, и щелочноземельными металлами.

В основном тетрациклин применяют при заболевании дыхательных путей и органов дыхания: ангины, бронхита, гнойного плеврита, пневмоний различной этиологии (пневмококковой, стафилококковой, фридлендеровской и др.), бактериальной и амебной дизентерии, коклюша, гонореи, сыпного и возвратного тифа, трахомы и пситтакоза. При инфекции мочевых путей - тетрациклин оказывает довольно хорошее действие. Один из антибиотиков, который хорошо справляется с заболеваниями, вызванные микробами, устойчивыми к стрептомицину и бензилпенициллину. Назначение препарата: профилактика и лечение инфекционных осложнений после хирургического вмешательства, особенно при операциях на брюшной полости и легких, при перитоните, хирургическом сепсисе.

Введение тетрациклина

Принимают во внутрь, в виде таблеток или капсул, после еды. Для взрослого человека, наиболее, оптимальная доза препарата - 250 мг. Дозировка: 3--4 раза в сутки, можно запивать водой или холодным молоком. Суточная норма для взрослого человека 2 г. Для детей, старше 8 - ми лет - суточная норма - 20--25 мг/кг. В случае тяжелого течения болезни лечение начинаются с дозы, которая в 2 раза больше однократной. В такой ситуации, наиболее адекватным становиться парентеральное введение антибиотика. Дозу тетрациклина уменьшают в том случае, когда нормализуется температура, лечение необходимо продолжать еще 1 - 3 дня, после отсутствия симптомов заболевания. Продолжительность курса лечения: 5--10 дней и более (в зависимости от формы и особенностей течения заболевания). Лечение можно повторить после 4--7-дневиого перерыва.

Местное применение тетрациклина

Местно применяют, для лечения больных с ожогами, флегмонами, маститами, абсцессами, орошением раневой поверхности или введении водного раствора тетрациклина в гнойную рану после предварительного удаления гноя. Сейчас, тетрациклин, не стоит в первых рядах для лечения инфекционных заболеваний - это связано с частыми случаями побочных эффектов, появлению тетрациклинустойчивых микроорганизмов и типом бактеритического действия. Так, в практике при возникновении инфекции, вызываемых стрептококками, стафилококками, пневмококками, менингококками, тетрациклин назначается тогда, когда штаммы возбудителей устойчивы или у пациентов имеется повышенная чувствительность к пенициллинам, цефалоспоринам, эритромицину, линкомицину.

Тетрациклины хорошо взаимодействуют с другими группами антибиотиков широкого действия (аминогликозиды), совместное применение врачи назначают при эндотоксическом шоке и бактериемии, которым способствуют грамотрицательные бактерии. Дает хорошие результаты лечения острого и хронического бруцеллеза (в сочетании со стрептомицином), сибирской язвы, туляремии, лечение и профилактика холеры. Для лечения гонореи является всё так же пенициллиновая группа (бензилпенициллин, ампициллин). Во врачебной практике известны случаи устойчивости гонококков к пенициллинам или индивидуальная непереносимость, тогда назначают тетрациклин.

Тетрациклин является отличным препаратом в отношении микоплазм и отличный антибиотик при пневмонии, синовиальных оболочек воспаления брюшины и. д. Тетрациклинотерапию так же могут проводить достаточно длительное время до положительных результатов, при хроническом заболевании, обуславливающими микоплазмы.

Так же тетрациклин имеет свои недостатки: при ботулизме он не эффективен, инфекциях, вызванными протеем, дрожжевыми грибами и др.

1.3 Доксициклин и его физико-химические свойства

б-6-Дезокси-5-окситетрациклин. Суммарная формула: С22Н24O8. Молекулярная масса: 513 г/моль

Доксициклин - полусинтетический антибиотик. Входит в ряд антибиотиков тетрациклиновой группы. Выпускается в форме капсул.

Амфотерное соединение, образущее растворимые соли с кислотами и основаниями. Доксициклин - светло-желтое кристаллическое вещество. Стабилен в щелочной и кислых средах, схож с окситетрациклином. Сохраняется при комнатной температуре, около 4-х недель в человеческой сыворотке, без потери активности. По стабильности - превосходить окситетрациклин и тетрациклин.

Есть возможность сочетать с молочными продуктами, препаратами кальция, антацидами, слабительными, с содержанием магния, продуктами железа, опасности не представляет, но возникает риск ослабления свойств антибиотика.

Антимикробное действие

Доксициклин по своим антибактериальным действиям схож с другими антибиотиками тетрациклинового ряда. По свойствам активности in vitro по отношению стафилококков, энтерококков и стрептококков - превосходит их. Но почти соответствует активности всех тетрациклинов против грамотрицательных микроорганизмов.

На бактериальную клетку действует бактериостатически. В течение первых 3 - 4 пересадок бактерий - развивается медленно, ступенчато, после, быстро возрастает. Культура бактерий - грамотрицательных - в основном устойчивые в доксициклину.

Доксициклин обладает и достоинствами по отношению к другим антибиотикам семейства тетрациклина - растворимость в липидах и в меньшей степени связывается с ионами кальция.

Всасывание, распределение, выведение

Особенность доксициклина в том, что антибактериальное вещество высвобождается равномерно и медленно или несколькими порциями, что позволяет быстро и плотно всасываться, что не дано другим тетрациклинам, благодаря этому свойству и происходит лучшая проходимость сквозь тканевые барьеры. Максимальное количество, устанавливаемое в крови, происходит через 2--2 Ѕ после перорального введения (смотрите таблицу 1).

Таблица 1. Концентрация доксициклина в сыворотке крови после однократного приема внутрь.

Доза, мг	Концентрация (мкг/мл) после введения через
	1ч.	2ч.	3ч.	6ч.	9ч.	12ч.	24ч.
100	1,3
200	1,5 - 2,5	1,9 - 4,0	2,0 - 4,7	1,4 - 2	2,1	1,4 - 0,5	0,5 - 1,4
400	-	-	-	-	-	-	2,3
100Ч2	В среднем 2--3 мкг/мл
200 каждые	Через 3 ч после 4-го введения 2--4 мкг/мл

Показания к применению схожи, что и для тетрациклина. Предназначен для лечения органов дыхания (бронхиты, бронхопневмония, крупозная пневмания), также фарингитов, тонзиллитов и др., вызываемых чувствительными к антибиотику штаммами Haemophilus influenzae , Staphylococcus, Streptococcus, при заболеваниях мягких тканей (абсцессы, импетиго, фурункулез, флегмоны) паралельно с хирургическими методами лечения; в заболевании мочевыводящих путей, вызыванных чувствительными штаммами Neisseria gonorrhoeae,Escherichia coli, Klebsiella, Staphylococcus и др.; инфекции желудочно-кишечного тракта, так же в ситуациях, когда прописано лечение антибиотиками ряда тетрациклина.

При лечении доксициклином, их схемы, с тетрациклином, значительно различаются: с первого дня лечения, суточная доза составляет 200 мг (100 мг каждые 12 ч), далее по 100 мг 1 раз в день. При тяжелой форме инфекции антибиотик вводят каждые 12 ч. по 100 мг. Для детей, старше 8 лет дозировка доксициклина составляет: расчета 5 мг/кг в первый день и 2 мг/кг в курсе дальнейшего лечения. Прием антибиотика прекращают по исчезновению симптомов заболевания, а при стрептококковых инфекциях -- не меньше 10 дней.

При раздражении желудочно - кишечного тракта врачи рекомендуют принимать антибиотик с молоком или пищей т. к. в таких условиях доксициклин минимально всасывается, в отличии от тетрациклина, находящегося в аналогичных условиях.

Доксициклин и тетрациклин имеют сходства: побочные явления, частота осложнений (аллергические реакции)

Но есть и различия: синтетический препарат довольно редко вызывает диспепсические явления и раздражение слизистых оболочек, в отличии от природного тетрациклина.

1.4 Количественное определения антибиотиков тетрациклинового ряда

Существует большое количество методов исследования тетрациклинов: для количественного состава в лекарствах, для обнаружения в продуктах питания, объектах окружающей среды, кормах, жидкостях. Самый эффективный, быстродействующий и простой в использовании - хроматографический, так же иммунохимические методы анализа. Меньше методик по определению такими методами как: электрофотометрический, электрохимический и спектрофотометрический.

1.4.1 Хроматография

Экспериментальный метод, в ходе которого, происходит разделение компонентов между стационарной (неподвижной) и подвижной фазами называется хроматографией. В зависимости от стационарной фазы хроматография бывает распределительная и абсорбционная.

Адсорбционная хроматография имеет твердое вещество для стационарной фазы, которое, в свою очередь, адсорбирует парциально каждый компонент из анализируемой смеси.

Процесс, при котором происходит поглощение поверхностью другого вещества, называется адсорбция. Часто, адсорбцию путают с абсорбцией, в отличии от первого, второй процесс поглощается всем объемом и диффундирует в объеме другого вещества (см. рис. 1).

Рисунок 1. Процессы адсорбции и абсорбции

Стационарной фазой в распределительной хроматографии - это жидкость. Распределение компонентов анализируемой жидкости распределяются между подвижной фазой и жидкостью стационарной фазы.

Вся суть хроматографического разделения заключается в следующем: происходит движение подвижной фазы над неподвижной, под этим воздействием и происходит отделение всех компонентов подвижной фазы. Хроматография включает в себя две важные стадии: распределение частичек происходит между двумя фазами; разделение смеси происходит на неподвижной фазе или в непрерывном потоке подвижной фазы.

В хроматографии за распределение компонентов анализируемой смеси отвечает коэффициент распределения (1)

(1)

Чем больше коэффициент распределения у компонента, тем больше преимущество растворимости в подвижной фазе и соответственно быстрое перемещение в неподвижной фазе. А соответственно, чем меньше коэффициент распределения, то преимущество переходит на неподвижную твердую фазу или происходит абсорбация в неподвижной жидкой фазе, а при движении подвижной фазы над неподвижной, этот компонент медленно движется по неподвижной фазе.

В органическом синтезе - хроматография является важной частью процессов выделения и разделения веществ, так же она необходима для проверки на чистоту вещества, прошедшего синтез. Так же хроматографический метод анализа очень хорошо подходит для качественного и количественного анализа при идентификации разделенных компонентов веществ.

Хроматография, в переводе с греческого, расшифровывается, как «цветопись», первые методики по предназначались именно для разделения окрашенных веществ.

1.4.2. Классификация хроматографии

а) Колоночная хроматография.

Для разделения твердых смесей используют колоночную хроматографию, она так же является разновидностью адсорбционной хроматографии.

Для неподвижной фазы используют твердый адсорбент, к примеру - оксид алюминия, роль подвижной фазы играет любой подходящий растворитель. Сначала в стеклянную колонку добавляют взвесь двух фаз. На дно камеры помещают подкладку из стекловаты, для предотвращения вытекания взвеси (рис. 2).

Рисунок 2. Колоночная хроматография

Растворитель помещают в колонку тогда, когда взвесь полностью осядет и заполняют до тех пор, пока его уровень станет немного выше твердой фазы. Сверху наливают раствор, полученный при смешении взвеси с растворителем. После прохождения раствора через колонку, необходимо добавить немного растворителя, обязательно порциально, для проверки уровня растворителя, выше он или нет по отношению к неподвижной фазе. В ходе колоночного разделения происходит процесс прохождения растворителя через колонку - элюирование. А элюент - это раствор, используемый для элюирования. Постепенное разделение компонентов происходит тогда, когда смесь проходит вдоль хроматографической колонки. Визуально разделение компонентов можно наблюдать при окрашенных (пигменты, красители) частичках анализируемой смеси. На рисунке 3 можно увидеть как протекает разделение двухкомпонентной смеси.

Рисунок 3. Пики элюирования

Время элюирования данного компонента - это время прохождения анализируемой смеси через колонку. Для последовательных порций элюированных компонентов предназначены колбы и пробирки. Для получения чистого компонента, проводят перегонку.

б) Тонкослойная хроматография

Еще одна разновидность адсорбционной хроматографии - тонкослойная хроматография. Этот метод хорошо подходит для органической химии при определении соединения и его чистоты. Роль твердой фазы играют: силикагель, целлюлоза или глинозём, соединение, имеющее связующее вещество (крахмал). Такое вещество тоненько и однородно раскатывают по стеклянной поверхности пластины и обязательно дают подсохнуть. С одной стороны, в конце, точечно наносят испытуемый образец, для легкости определения, рядышком наносят взвеси известных веществ. Затем, после высыхания нанесенных пятен, пластину, тем же концом опускают в хроматографическую камеру (см. рис. 4), обязательно накрытой крышкой, во избежание испарения растворителя.

Рисунок 4. Камера для хроматографирования

По пластинке растворитель поднимается медленно, за счет капилярного действия. Когда линия растворителя проходит пятна, происходит перемещение растворенного в них вещества. Как уже было сказано выше, их скорость передвижения напрямую зависит от коэффициента распределения. Пластину вынимают, когда фронт растворителя приблизился к краю хроматографической пластины, далее сушат, в основном в сушильном шкафу. Некоторые компоненты смеси можно обнаружить визуально, если пятна невозможно увидеть обычным зрением, тогда следует проявить пластину. Существует не мало способов проявления пластин: газовые камеры каких - либо соединений (пары йода), УФ - лампы, опрыскивание окрашивающим соединением (нингидрин) и многое другое. Каждые компоненты смесей охарактеризовываются с помощью коэффициента удерживания (2), тесно связанный с коэффициентом распределения.

(2)

Рисунок 5. Результирующая картина разделения на ТСХ-пластинке после проведенного опыта. Вещество Х - неизвестно, А, В - известные вещества. Вещество представлено двумя образцами С и С0

Проанализировав рис. 5 несложно обнаружить что неизвестное вещество «Х» является смесью соединений В и С. Так же вещество С - представляет собой чистое вещество, а вот С0 уже загрязнено, т.к. на хроматограмме наблюдаются несколько пятен,св том числе и вещества А. Для вещества С можно определить коэффициент удерживания по формуле (3)

(3)



в) Хроматография на бумаге

Вид распределительной хроматографии, неподвижная фаза - жидкость. Подвижная фаза представляет собой органическую жидкость; для стационарной фазы чаще используют адсорбированную на бумаге воду. Тонкослойная и бумажная хроматографии очень схожи между собой.

Хроматография на бумаге имеет два варианта протекания: восходящая (см. рис. 6), у которой конец хроматограммы погружен в растворитель и нисходящая (см. рис. 7), в которой растворитель находится в верхней части бачка.

Рисунок 6. Восходящая хроматография на бумаге. Пятно X - неизвестное вещество. Пятна А, В и С - известные вещества, необходимы для сравнения

Проанализировав хроматограмму, очевидно, что неизвестное вещество «Х» содержит в себе соединения - «А» и «В».



Рисунок 7. Нисходящая хроматограмма на бумаге

Основное и уникальное преимущество бумажной хроматографии - это долговременное хранение, для дальнейшего исследования и сапостовления.

г) Газовая хроматография

Газовая хроматография делиться на два вида.

Глинозем или силикагель - это неподвижные фазы газоадсорбционной хроматографии, в основном применяемые в анализе. В настоящее время данный метод используется на практике редко.

Наиболее популярна и распространена газожидкостная хроматография. Она является разновидностью распределительной хроматографии. Роль стационарной фазы осуществляет алкан, имеющий длинную углеродную цепь и высокую температуру кипения. Ля поддержания этой фазы используют твёрдый носитель, твёрдое, пористое, инертное вещество (глинозём, древесный уголь, оксид кремния) которое добавляют в колонку (см. рис 8.):



Рисунок 8. Схема действия газожидкостного хроматографа

Подвижная фаза - гелий, аргон, азот или водород. Такой газ носит название газ - носитель. Для подачи исследуемого образца пользуются медицинским шприцем. При испарении образец, при помощи газа - носителя, перемещается вдоль колонки. Смеси, находящиеся в колонке, в зависимости от коэффициента распределения, перемещаются с разными скоростями. Когда каждое вещество попадает на детектор, самописец начинает свою работу - последовательно записывать пики исследуемых веществ, в итоге получают газовую хроматограмму (см. рис 9):



1. Инжекционный пик (начало эксперимента)

2. Водород

3. Кислород (пик воздуха)

4. Моноксид углерода

5. Метан

6. Этан

7. Диоксид углерода

8. Этилен

9. Пропан

10. Ацетилен

11. Пропилен

Рисунок 9. Газовая хроматограмма смеси газов

Для измерения разности в теплопроводности у чистого газа - носителя и выделенного компонента смеси, в системе имеется специальный детектор (катарометр), его можно применять как для неорганических соединений, так и для органических. Для разделения органических соединений используют пламенно - ионизационный детектор. Разделенные компоненты, содержащиеся в газе - носителе сжигают в пламени водорода; измеряют концентрацию ионов, образующихся в пламени, по электропроводности.

Для соединений, содержащих серу, фосфор, галогены и азот применяют электронозахватный детектор. Газ - носитель ионизируется и становится электропроводным. В анализируемой смеси частички регенерируются электронами, что способствует индивидуальному поглощению в разной степени. За счет этого эффекта идет уменьшение электропроводности, зависящее так же и от концентрации анализируемой смеси. Данный способ детектирования очень чувствителен. Такой метод нашел себя в количественном определении пищевых продуктов, инсектицидов, содержащих галогены и причих анализируемых смесей.

На рисунке 9 представлена хроматограмма смеси газов. При вводе исследуемой жидкости в хроматограф, на хроматограмме, этому моменту соответствует инжекционный пик. Далее все пики соответствуют каждому компоненту изучаемой смеси. Газожидкостная хроматограмма имеет время удерживание - это расстояние от инжекционного пика до пика каждой частички (шкала времени). Время удерживания зависит от условий эксперимента (скорость протекания газа - носителя, температура, концентрация и природа неподвижной фазы) и состава определенного соединения.

д) Жидкостная хроматография

Еще один хроматографический метод разделения веществ - жидкостная хроматография. Она представляет собой целую группу методов разделения, в ходе которых, изучаемое вещество распределяется между подвижными и неподвижными фазами, которая в свою очередь имеет большую удельную поверхность, над которой происходит перемещение жидкой фазы. Хроматографию можно проводить на бумаге: колоночная хроматография, высокоэффективная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография.

В настоящее время предпочтение отдают ВЭЖХ. Это связано с возможностью определения нелетучих соединений и так же возможностью использовать совместно с газовой хроматографией. В практике ВЭЖХ используют для быстрого определения естественных компонентов в продуктах питания, загрязнений, всяческих добавок. Высокая производительность разделения достигается благодаря большой удельной поверхности и применении маленьких твердых носителей одинаковых по размерам. Но такие носители оказывают немалое сопротивление течению жидкости. Для этого нужны немаленькие давления, чтобы через микрозернистые носители проходил поток подвижной фазы. В следствии этого ВЭЖХ получила второе название - жидкостная хроматография высокого давления.



2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Исходные вещества и реагенты. Аппаратура

Для исследования были выбраны антибиотики рядя: тетрациклин и доксициклин. Некоторые физико - химический свойства представлены в таблице 2.

Таблица 2. Наименование и некоторые физико-химические свойства изученных тетрациклинов.

Соединение	Заместитель (R - группа)	Мол. масса	lgP	рКа1	рКа2	рКа3
Тетрациклин	R1 =H	R2 =ОH	R3 =H	444	- 1,25	3,2	7,78	9,6
Доксициклин	R1 =H	R2 =H	R3 =ОH	444	- 0,54	3,5	7,7	9,5

В качестве сорбента использовали силикагель СТХ - 1ВЭ, связующее вещество - силиказоль.

Анализируемые растворы были приготовлены растворением точных навесок препаратов, растворенных в смеси растворителя, состоящего из ацетона и 0,01н соляной кислоты. Для элюента понадобились: этилацетат, ацетон и вода.

Хроматография проводилась восходящим способом. Для того что бы проявить пятна, согласно методики, понадобился концентрированный раствор аммиака, а для еще более яркого проявления пятен и для дальнейшего количественного анализа, потребовался кристаллический йод.

Аппаратура. Стеклянная камера с плотной крышкой. Для сушки хроматограммы - сушильный шкаф, стеклянная камера, насыщенная порами концентрированного аммиака и вторая, такая же камера, насыщенная парами кристаллического йода, ультрафиолетовая лампа, сканер, компьютер.



2.2 Методика проведения эксперимента

На линию старта микрошприцом наносят пробы точек на расстоянии 1 см. одна от другой и на 1,5 см. от нижнего края пластины: 5мкл. раствора каждого антибиотика.

Пластину с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течении 1 - 2 мин., помещают в камеру со смесью растворителей этилацетат : ацетон : вода (20 : 19 : 3) и хроматографируют восходящим способом.

Когда растворители поднимутся на 7 - 8 см. от линии старта, пластину вынимают и сушат на воздухе 10 мин., потом 5 мин. в сушильном шкафу (100 С0). По охлаждении пластины, помещают на 3 - 5 минут в сушильный шкаф и после просматривают на свете УФ - лампы. [20]

2.3 Подбор объема и концентрации

Для совей работы 0,01 н соляную кислоту я готовила следующим образом: из 2н кислоты по формуле (3) я рассчитала необходимый объем воды для получения нужной концентрации при исходных данных: V1 = 1 мл; С1 = 2 н; С2 = 0,01 н.

(3),

где V1 - объем 2н соляной кислоты; V2 - объем растворителя; С1 - начальная концентрация соляной кислоты, С2 - концентрация, которую необходимо получить.

V2 = V1 * С2 / V1 = 2 * 1 / 0,01 = 200 мл.

Концентрация Ст (тетрациклина) и Сд (доксициклина) была рассчитана по формуле 4.



(4)

где, m - масса вещества; V - объем вещества.

Исходные данные:

mт - 1354 мг.; mд = 1334 мг.; V - 50 мл.

Ст = 1354 / 50 = 27,08 мг/мл

Сд = 1334 / 50 = 26,68 мг/мл

При первичном проведении эксперимента пятна на хроматограмме оказались очень крупными - что свидетельствует о высокой концентрации исследуемых веществ (см. рис. 10):

Рисунок 10. Первичная хроматограмма с высокой концентрацией антибиотиков

После, я уменьшила концентрация в 2 раза - добавила еще 40 мл. ацетона и 10 мл. 0,01н соляной кислоты в каждый первичный раствор исследуемых антибиотиков:

Ст2 = 27,08 / 2 = 13,54 мг/мл

Сд2 = 26,68 / 2 = 13,34 мг/мл

Концентрация, смеси тетрациклин : доксициклин (1:1) будет рассчитываться по формуле (5)

(5)

Ссмесь =

2.4 Проведение эксперимента

Приготовление растворов антибиотиков.

В две мерных колбы поместила исследуемы образцы антибиотиков mт = 1354 мг. и mд = 1334 мг., после, в каждую колбу внесла 20 мл. 0,01 н соляной кислоты, полностью растворила и затем 80мл. ацетона.

Приготовление элюента.

В мерный цилиндр с притертой крышкой, вместимостью 50 мл добавила 20 мл. этилацетата, 19 мл. ацетона и 3 мл. воды.

Выполнение анализа.

На линию старта хроматографической пластины нанесла 4 пробы на расстоянии друг от друга в 1 см. и на 1,5 см. от нижнего края первой пластины: 3 мкл. - тетрациклина, 3 мкл. - доксициклина, смесь тетрациклина и доксициклина в соотношениях: 2:1 и 1:2.

Хроматографическую пластину, с нанесенными образцами, высушила на коздухе в течении 2-х минут и поместила в хроматографическую камеру со смесью растворителя, содержащего: этилацетат, ацетон и воду (40:28:6) и хроматографировала восходящим способом.

Когда фронт подвижной фазы поднялся от линии старта на 7 см., вынула пластину из камеры, 10 минут сушила на камере, затем 5 минут в сушильном шкафу при 1000 С. После того, как пластина остынет, поместила её в камеру с парами аммиака на 5 мин.

Камеру для аммиака сконструировала следующим образом: стеклянная банка с высокими стенками и плотной крышкой, к которой прикреплена проволока с держателем. А внутри самой банки 20 мл. концентрированного аммиака. Хроматограмму подвесила под куполом крышки за держатель и плотно закрыла крышку. Данный этап проходил под тягой.

Затем для проявления пятен, просмотрела хроматографическую пластину под ультрафиолетовой лампой и карандашом обвела проявленные точкиє

Полученные пятна оказались не совсем подходящими для дальнейшего анализа в программе «Хромоскан», тогда для проявления цвета, хроматограмму поместила в камеру с парами кристаллического йода (см. рисунок 11):

Рисунок 11. Хроматограмма после паров йода

Камера с парами йода представляла собой ту же конструкцию что и камера с парами аммиака, только на дно сосуда поместила несколько кристалликов йода и для быстрого эффекта, камеру с хроматограммой и йодом, немного подогрела - хроматограмма стала ярко - желтого цвета, а пятна стали более яркими и насыщенными, но данный эффект временный.

2.5 Обработка полученных результатов

В ходе исследования мною были обнаружены пятна тетрациклина и доксициклина в фармацевтических препаратах «тетрациклин» и «доксициклин». Обработку полученной хроматограммы произвела в специализированном программном обеспечении «Хромоска» (см.рис. 12)

Рис.12. Обработка полученных результатов в программе «Хромоскан».

Далее провела апроксимацию полученных результатов и выделились все четыре пика (см. рис 13.):



Рис. 13. Апроксимация

Затем по пропорции высчитала количественное содержание антибиотиков.

1. Точка тетрациклина

То получим следующее:

2. Точка доксициклина

То получим следующее:

3. Точка с соотношением тетрациклин : доксициклин (1:2)

То получим следующее:

4. Точка соотношения тетрациклин: доксициклин (2:1)

То получим следующее:

Исходя из количественных расчетных данных можно сделать вывод о находящихся активных веществах в фармацевтических препаратах: «Тетрациклин» - активное вещество тетрациклин - 2,342 мг/мл; «Доксициклин» - активное вещество доксициклин - 1,468 мг/мл.



3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как было описано в литературном обзоре, методик определения антибиотиков ряда тетрациклина, не только в препаратах но и продуктах животного и растительного происхождения, невероятно много. В качестве объекта исследования в основном используют мясо животных, рыбу, молочные продукты, фрукты и овощи.

Для анализа антибиотиков отлично подходит хроматографический метод анализа, так же используют газовую хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию и тонкослойную хроматографию.

Тонкослойная хроматография - единственная хроматография, которая может проводить полноценный анализ неизвестной смеси. Многие химики описывают ТХ, как «успешный» метод разделения органических кислот, полуколичественный анализ микробиологических, фармацептических объектов. Так как данный метод не требует дорогостоящего оборудования, применяется на практике в наших химических лабораториях, имеет хорошую разделительную способность, большую чувствительность - выбор за нами был очевиден в пользу тонкослойной хроматографии.

Главная задача методики ТС - это правильный выбор стационарной и подвижной фаз, а также проявителя. При изучении литературы, свой выбор остановили на сорбенте - силикагель, содержащий в себе активные силанольные и силоксановые группы. Для нас оптимально было выбрать вариант с закрепленном слое, для этого были выбраны пластинки «Sorbfil».

Предварительные эксперименты использования антибиотиков показали сначала малую концентрацию - пятна не проявлялись, затем я увеличила массу антибиотиков. Было установлено, что для приготовления стандартных растворов оптимальная масса тетрациклина - 13,54 мг, а доксициклина - 13,34 мг, а растворять их в следующих соотношениях:

уксусная кислота : ацетон = 20 : 52

Проанализировав литературу по методам определения антибиотиков тетрациклинового ряда, остановили свой выбор на проявителе состоящего из УФ - лампы. Их используют для обнаружения флуоресцирующих соединений (пятна светятся при облучении пластинки УФ-светом) или нефлуоресцирующих веществ. Таким образом проявляют, алкалоиды, антибиотики, витамины и другие лекарственные вещества.

Для проведения количественного анализа мы воспользовались методом неразрушающего контроля - денситометрия хроматографической пластинки. Для того, чтобы построить калибровочный график, как уже было описано выше, мы, для денситометрирования использовали отсканированную хроматограму при специализированной компьютерной программы «Хромоскан» [21]



ВЫВОДЫ

1. Подобраны оптимальные условия для проведения качественного анализа антибиотиков семейства тетрациклинов.

2. Показана достоверность полученных результатов по представленной методике на примере практической смеси антибиотиков, содержащих тетрациклин и доксициклин.

3. Определено количественное содержание тетрациклина и доксициклина в фармацевтических препаратах.



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Навашин С. М., Фомина И. П. Рациональная антибиотикотерапия. - М.: Медицина, 1982 - 496 с.

2. Фримантл М. Химия в действии. В 2-х ч. Ч. 1: Пер. с англ. -- М.: Мир, 1998 - 528 с.

3. Герольд М., Вондрачек М., Насачек Я., Доскочил И. Антибиотики. - М.: «Медицина», 1966

4. Айвазов Б.В. Практическое руководство по хроматографии. - М.: Высшая школа, 1968 - 281 с.

5. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. - М.: Мир, 1981 - 522 с.

6. Крылова Ю. Ф., В. М. Бобырева. Формалокология. - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999 - 352 с.

7. Айвазов Б.В. Практическое руководство по хроматографии. - М.: Высшая школа, 1968 - 280 с.

8. Лурье А.А. Сорбенты и хроматографические носители. - М.: Химия 1972 - 320 с.

9. Тонкослойная хроматография. Перевод под редакцией доктора хим. наук профессора В.Г Березкина / М: - «Мир», 1981, - 616 с.

10. Козлов Р.С. Проблема антибиотикорезистентности в педиатрии. / Р. С. Козлов. - М.: РМЖ 2014 - 238 с.

11. Василевский И.В. Некоторые пути решения проблемы антибиотикорезистентности на современном этапе. / И. В. Василевский. - М.: Медицина 2008.

12. Хроматография: Практическое приложение метода: В 2 - х Ч. 2. Пер. с англ. / Под ред. Э. Хефтмана. - М.: Мир, 1986 - 422 с.

13. Яшин Я. И., Яшин Е. Я., Яшин А. Я. Газовая хроматография. - М.: 2009 528 с.

14. Рудаков О. Б., Востров И. А. Спутник хроматографиста. - Воронеж: Водолей, 2004 - 528 с.

15. Яковлев С.В., Сидоренко С.В., Спичак Т.В. Стратегия и тактика рационального применения антимикробных средств в амбулаторной практике: Российские практические рекомендации. / С. В. Яковлев, С. В. Сидоренко, Т. В. Спичак. - М.: Престо, 2014.

16. Хроматография, под ред. Э. Хефгмана, пер. с англ., ч. 1-2, - М.: Мир, 1986 - 336 с.

17. Количественный анализ хроматографическим методом, под ред. Э. Кэца, пер. с англ. - М.: Мир, 1990 - 320 с.

18. Шаршунова М. и др. Тонкослойная хроматография в формации и клинической и клинической биохимии. - М.: Мир, - 1980 - 273 с.

19. Рясенский С. С. Компьютерная сканирующая денситометрия / С.С. Рясенский // Вестник Тверского Государственного университета. - Серия: Химия, 2006, №8, с. 116. - 121.

Размещено на Allbest.ru

...