Оптимізація умов рідинно-хроматографічного розділення амінокислот із дериватизацією перед колонкою 1-флуор-2,4-динітробензеном

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок м. Львів, вул. Донецька, 11, 79019, Україна

Оптимізація умов рідинно-хроматографічного розділення амінокислот із дериватизацією перед колонкою 1-флуор-2,4-динітробензеном

Р.Д. Остапів, канд. біол. наук,

В.І. Ткаченко, канд. біол. наук

Анотація

У статті описано етапи оптимізації параметрів рідинно-хроматографічного розділення дванадцяти амінокислот (аргініну, глутаміну, серину, аспарагіну, треоніну, гліцину, аланіну, проліну, метіоніну, триптофану, орнітину, лізину) із дериватизацією перед колонкою 1-флуор-2,4-динітробензеном. Досліджено ізократичні та градієнтні схеми елюювання. Зазначено зміни у кількісних параметрах хроматографічних піків за різних умов розділення дериватизованих амінокислот. Наведено деякі валідаційні характеристики, такі як повторюваність (ЯЗВ, %), діапазон лінійності та межа кількісного визначення. Параметри піків та досліджені валідаційні характеристики не виходять за межі, рекомендовані у Державній фармакопеї України (ДФУ), що дозволить у подальшому здійснити більш повну валідацію методики для кількісного визначення амінокислот у різноманітних матрицях: ін 'єкційних та пероральнихрозчинах, кормах та преміксах.

Ключові слова: ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИННА ХРОМАТОГРАФІЯ, АМІНОКИСЛОТИ, ДЕРИВАТИЗАЦІЯ, 1-ФЛУОР-2,4-ДИНІТРОБЕНЗЕН.

Summary

OPTIMIZATION OF LIQUID CHROMATOGRAPHIC CONDITIONS TO SEPARATE AMINO ACIDS WITH 1-FLUORO-2,4-DINITROBENZENE PRECOLUMN

DERIVATIZATION

R D. Ostapiv, V. І. Tkachenko

State Scientific Research Control Institute of Veterinary Medicinal Products and Feed Additives, Donetska str., Lviv, 79019, Ukraine

The article describes the optimization stages of liquid chromatographic separation parameters for amino acids (arginine, glutamine, serine, asparagine, threonine, glycine, alanine, proline, methionine, tryptophan, ornithine, lysine) with 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene precolumn derivatization. Isocratic and gradient schemes of elution have been investigated. Changes in the quantitative parameters of chromatographic peaks are indicated for different conditions of separation of derivatized amino acids. Some validation characteristics are given, such as repeatability (RSD,%), linearity range and quantification limit. The parameters of the peaks and the studied validation characteristics do not go beyond the limits recommended by the State Pharmacopoeia of Ukraine (SPU), which will allow further validation of the method for the quantitative determination of amino acids in different matrices: injectable and oral solutions, feeds and premixes.

Keywords: HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, AMINO ACIDS, DERIVATIZATION, 1 -FLUORO-2,4-DINITROBENZENE.

Аннотация

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЖИДКОСТНО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ДЕРИВАТИЗАЦИЕЙ ПЕРЕД КОЛОНКОЙ

1-ФТОР-2,4-ДИНИТРОБЕНЗОЛОМ

Р. Д. Остапив, В. И. Ткаченко

ГНИКИ ветеринарных препаратов и кормовых добавок ул. Донецкая, 11, г. Львов, 79019, Украина

В статье описаны этапы оптимизации параметров жидкостно-хроматографического разделения двенадцати аминокислот (аргинина, глутамина, серина, аспарагина, треонина, глицина, аланина, пролина, метионина, триптофана, орнитина, лизина) с дериватизацией перед колонкой 1-фтор-2,4-динитробензолом. Исследованы изократические и градиентные схемы элюирования. Отмечены изменения в количественных параметрах хроматографических пиков при различных условиях разделения дериватизированных аминокислот. Приведены валидационные характеристики, такие как повторяемость (RSD, %), диапазон линейности и предел количественного определения. Параметры пиков и исследованные валидационные характеристики не выходят за пределы, рекомендованные в Государственной фармакопее Украины (ГФУ), что позволит в дальнейшем осуществить более полную валидацию методики для количественного определения аминокислот в различных матрицах: инъекционных и пероральных растворах, кормах и премиксах.

Ключевые слова: ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ, АМИНОКИСЛОТЫ, ДЕРИВАТИЗАЦИЯ, 1-ФТОР-2,4-ДИНИТРОБЕНЗОЛ.

Амінокислоти - органічні сполуки, які одночасно містять у своєму складі амінні- (МНД та карбоксильні (-СООН) групи [1]. У ветеринарії вони застосовуються як важливі компоненти ін'єкційних та пероральних розчинів для лікування, а також складові преміксів та кормів для збільшення продуктивності тварин: ВРХ, свиней та птиці. Кількість таких ветеринарних препаратів на ринку України щороку зростає [2, 3]. Амінокислотовмісні ветпрепарати, премікси та корми значно відрізняються один від одного за складом, як амінокислот, так і матриці (особливо це стосується кормів і преміксів) [3]. У зв'язку з цим часто постає необхідність в адаптації існуючих рутинних методик кількісного визначення вмісту амінокислот, з метою підвищення їх селективності для аналізу ветеринарних препаратів та кормових добавок. Відома методика визначання кількості вільних амінокислот у тканинах із дериватизацією перед колонкою 1-флуор-2,4-динітробензеном, яка дозволяє ідентифікувати та кількісно визначити більшість амінокислот [4]. Описана методика є нескладною у виконанні та вимагає порівняно невеликих витрат часу та ресурсів.

Метою даної роботи було перевірити вплив зміни ряду умов хроматографічного розділення на селективність методики (величину фактора розділення та кількості одночасно визначуваних амінокислот).

Матеріали і методи. У роботі використовували сертифіковані стандартні зразки амінокислот (таурин, серин, треонін, аспарагін, глутамін, аргінін, аланін, гліцин, триптофан, лізин, метіонін, пролін, орнітин) виробництва Sigma-Aldrich. Основний розчин кожної амінокислоти з концентрацією 500 мкг/мл готували з урахуванням чистоти зразка, зазначеній у сертифікаті, шляхом розчинення у 0,05 М розчині натрій тетраборату 10-водного. Після цього основні розчини амінокислот розводили тим самим розчинником до потрібних концентрацій робочих розчинів 1-10 мкг/мл. Готували такі суміші амінокислот:

1) таурин, треонін, метіонін, триптофан та лізин;

2) аргінін, таурин, треонін, глутамін, гліцин, аланін;

3) аргінін, таурин, треонін, глутамін, гліцин, аланін, метіонін, триптофан, орнітин,

лізин;

4) аргінін, глутамін, серин, аспарагін, гліцин, аланін, пролін, метіонін, триптофан, орнітин, лізин.

До 4 мл робочого розчину амінокислот додавали 1 мл 0,05 M розчину 1-флуор-2,4- динітробензену у діоксані, зразки дериватизували за температури 40 °С впродовж 40 хв. Після дериватизації ємність з розчином швидко охолоджували у темному місці під струменем води і додавали 5 мл 50 % розчину ацетонітрилу. Розчином плацебо слугував 0,05 М розчин натрій тетраборату 10-водного. Для готування зразків використовували ацетонітрил виробництва LabScan, натрій тетраборат 10-водний виробництва Sigma-Aldrich та 1-флуор-2,4-динітробензен виробництва Fluka.

Хроматографічний аналіз виконано на рідинному хроматографі фірми Waters, оснащеному сепараційним модулем Alliance 2690 з діодноматричним детектором PAD 996. Вихідні (початкові) умови розділення зразків: хроматографічна колонка Luna C18 (2) 250 х 4,6мм, 5 рм; рухома фаза: суміш ацетонітрилу з 0,1 M розчином NaH2PЬ4, підкисленим до pH 2,0 1 M фосфатною кислотою) у співвідношенні 45 : 55. Об'єм інжекції складав 0,01 мл, швидкість потоку рухомої фази становила 1,0 мл/хв, температура колонки 25 °С, час одного розділення - 20 хвилин. Довжина хвилі детекції - 350 нм. Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Microsoft Excel 2010 [5].

Результати і обговорення. Хроматограми плацебо та розчинів амінокислот таурину та метіоніну, одержані за вищеописаних початкових умов розділення, представлені на рис 1.

Рис. 1 Хроматограми зразків розчинів таурину (А); та метіоніну (Б). Концентрація кожної амінокислоти - 10 мкг/мл.

Окрім таурину і метіоніну у склад преміксів та кормів для продуктивних та непродуктивних тварин подекуди входять треонін, лізин та триптофан [2]. Тому наступним кроком у дослідженні було включення цих амінокислот до складу тестової суміші, їх дериватизація та розділення, використовуючи ту саму вихідну схему хроматографічного аналізу (рис. 2.). Піки дериватизаційного реагенту

Рис. 2 Хроматограма суміші амінокислот (таурину, треоніну, метіоніну, триптофану та лізину) за початковою схемою аналізу (концентрація кожної - 10 мкг/мл).

Параметри хроматографічних піків амінокислот відповідали вимогам ДФУ (табл. 1).

Таблиця 1 Параметри хроматографічних піків амінокислот, розділених за початковою схемою аналізу

Оскільки не вдалось розділити амінокислоти за ізократичних умов елюювання, було застосовано градієнтне (табл. 2), і при цьому до тестової суміші було додано ще метіонін, триптофан, орнітин та лізин.

Таблиця 2 Умови градієнтного елюювання (перший варіант)