Флуоресцентная и конфокальная микроскопия

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

Флуоресцентная и конфокальная микроскопия

Флуоресцентный микроскоп - специализированный оптический микроскоп, предназначенный для изучения свойств органических или неорганических веществ с использованием явления флуоресценции.

Молекулы способны поглощать кванты света и переходить в электронно-возбужденные состояния. Возвращение молекулы в «обычное» (основное) состояние, сопровождающееся излучением света, называют люминесценцией. Разновидность люминесценции, при которой переходы осуществляются между двумя состояниями одинаковой мультиплетности называется флуоресценцией.

Основной принцип работы флуоресцентного микроскопа заключается в облучении образца заданной определенной полосой длин волн, вызывающих его флуоресценцию. Затем необходимо выделить намного более слабое излучение флуоресценции. В идеально настроенном микроскопе, только свет от флуоресценции должен достичь детектора так, чтобы в результате флуоресцентные структуры выделялись с высокой контрастностью.

Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа состоит из источника излучения, возбуждающего и запирающего светофильтров и специального люминесцентного объектива (рисунок 1). Источник света излучает волны, которые проходят через фильтр, где отсекаются волны другого спектрального ряда. Лучи попадают на изучаемый препарат и вызывают его люминесценцию. Свет люминесценции проходит через запирающий фильтр, который не пропускает свет возбуждения и далее формирует изображение в объективе [3].

Люминесцентные (флуоресцентные) микроскопы широко применяют в микробиологии, цитологических исследованиях и гистохимии. С их помощью удобно изучать живые клетки, диагностировать злокачественные образования, выявлять нуклеиновые кислоты, мукополисахариды и муцины.

Рисунок 1. Схема флуоресцентного микроскопа

Флуоресцентная микроскопия представляет собой удобный метод анализа различных биологических объектов за счет их способности излучать при облучении светом. Молекулы многих биологических объектов способны поглощать кванты возбуждающего излучения и переходить в электронно-возбужденное состояние (верхние энергетические уровни), а затем снова возвращаться в основное состояние (нижний энергетический уровень).

Но в данной ситуации есть два важных аспекта, которые негативно влияют на результаты измерений:

· Во-первых, биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо;

· Во-вторых, при использовании обычных оптических флуоресцентных микроскопов при исследовании достаточно «толстых» образцов помимо излучения от точки, находящейся в фокусе, приемник/оптическая система будет регистрировать и фоновое излучение от областей, находящихся вне фокальной плоскости объектива.

Данная проблема дала толчок развитию конфокальной флуоресцентной микроскопии и использованию специальных вспомогательных веществ (флюорофоров), отличающихся сильной флуоресценцией при облучении их светом. Таким образом, появилась возможность отсекать фоновое излучение с помощью специальных диафрагм (пинхол), используемых в конфокальных микроскопах и получать специфически контрастную окраску и делать снимки с высоким разрешением многих внутриклеточных белковых структур [2]. флуоресцентный микроскоп конфокальный фильтрация

Конфокальная флуоресцентная микроскопия отличается от обычной флуоресцентной микроскопии, в первую очередь, улучшенным разрешением вдоль оптической оси объектива, которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации флуоресценции, излучаемой образцом.

Рисунок 2 поясняет этот принцип: Луч лазера (непрерывная линия) с помощью селективного зеркала (СЗ) направляется в объектив микроскопа и фокусируется в точку Т0 в глубине исследуемого объекта. Флуоресценция, излучаемая из этой точки (прерывистая линия), собирается объективом и фокусируется линзой Л в сопряженной фокальной плоскости объектива, проходя через отверстие в конфокальной диафрагме (КД) к фотоэлектронному умножителю (ФЭУ) (а). Флуоресценция, излучаемая из точек Т+ (б) и Т- (в), дефокусирована на КД и к ФЭУ не проникает. Таким образом обеспечивается подавление флуоресценции, испускаемой из точек образца, расположенных выше и ниже фокуса объектива, и улучшается разрешение вдоль оптической оси объектива [1].

Рисунок 2. Принцип конфокальной фильтрации сигнала [1]

Если в обычных флуоресцентных микроскопах в качестве источника света, возбуждающего флуоресценцию, используется ртутная или ксеноновая лампа, то в современных конфокальных микроскопах - это лазер. Преимущество лазеров по сравнению с ламповыми источниками света - это монохроматичность генерируемого света (ширина линии генерации значительно меньше 1 нм) и малая расходимость (т.е. высокая параллельность) пучка света. Монохроматичность возбуждающего флуоресценцию света дает возможность расширить спектральный диапазон регистрируемой флуоресценции и улучшить подавление светорассеяния на длине волны возбуждения. Малая расходимость пучка света способствует более эффективной работе оптической системы микроскопа, уменьшает число бликов, связанных с отклонением света от расчетного оптического пути, улучшает точность фокусировки пучка света и уменьшает объем, в который можно сфокусировать свет на образце [2].

Луч лазера наводится на образец через объектив с использованием, так называемого, селективного зеркала (СЗ, рисунок 2). Специальное многослойное напыление из диэлектрических материалов обеспечивает высокоэффективное отражение света на длине волны генерации лазера и почти 100% пропускание света в остальном спектральном диапазоне. На образце лазер освещает не все поле зрения, как в ламповом флуоресцентном микроскопе, а фокусируется в точку. Флуоресцентное излучение, возбуждаемое лазером, собирается тем же объективом. СЗ отражает рассеянный образцом лазерный свет, пропуская через себя к системе детекции (фотоэлектронный умножитель, ФЭУ) флуоресцентное излучение, очищенное от паразитного светорассеяния.

Очевидно, что лазерный луч возбуждает флуоресценцию во всех слоях образца, через которые он проходит. Флуоресценция, излучаемая слоями, расположенными выше и ниже фокальной плоскости, если она попадает на ФЭУ, регистрируется вместе с основным сигналом из фокуса объектива и ухудшает разрешение оптической системы. Чтобы улучшить разрешение, используется конфокальная диафрагма, которая помещается в сопряженной фокальной плоскости объектива, точнее, в той плоскости, где микроскоп фокусирует флуоресценцию, собранную из фокуса объектива (рисунок 2). Через диафрагму проходит только та флуоресценция, которая излучается из небольшого объема вблизи фокуса лазерного луча под объективом (рисунок 2, а). Флуоресценция, испускаемая слоями выше и ниже фокуса, оказывается дефокусированной на конфокальной диафрагме и через нее к ФЭУ не проникает (рисунок 2, б, в).

На рисунке 3 представлена принципиальная схема трехканального лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Совместное использование в одном микроскопе нескольких лазеров (рисунок 3) позволяет перекрыть весь спектральный диапазон, необходимый для возбуждения исследуемых флуорофоров.

Световые пучки от разных лазеров с помощью системы, состоящей из зеркала (З) и полупрозрачных зеркал (ПЗ) сводятся в один соосный пучок и через перестраиваемый акустооптический фильтр (АОФ) заводятся в оптическую систему микроскопа. АОФ за счет быстроизменяемой пропускающей способности на заданных длинах волн пропускает в микроскоп только то лазерное излучение, которое используется в данный момент для возбуждения флуоресценции, блокируя свет на остальных лазерных длинах волн. При необходимости АОФ способен пропускать свет сразу на нескольких длинах волн, обеспечивая одновременное возбуждение нескольких флуорофоров, значительно отличающихся по спектрам возбуждения и испускания флуоресценции [1].

Как описано выше, луч лазера, отразившись от СЗ (имеется несколько сменных СЗ для разных лазеров), проходит через объектив, фокусируется в заданную точку образца и возбуждает в ней флуоресценцию. Между СЗ и объективом установлена система из двух зеркал-сканеров (рисунок 3), которая позволяет направить лазерный луч в любую точку в плоскости препарата в пределах поля зрения объектива.

Рисунок 3. Принципиальная схема трёхканального лазерного сканирующего конфокального микроскопа [1]

Луч лазера обозначен сплошной линией. Флуоресценция, испускаемая препаратом в диапазоне длин волн л1 - л4, обозначена прерывистой линией. АОФ_акустооптический фильтр, ДЗ1 и ДЗ2 - дихроичные зеркала, которые отражают свет с длиной волны короче л2 и л3 соответственно и пропускают через себя более длинноволновый свет, то есть делят флуоресценцию в области длин волн л1 -л4 , на три широких спектральных диапазона л1 -л2 , л2 -л3 и л3 -л4 , З - зеркало, КД1 , КД2 и КД3 - конфокальные диафрагмы, Л1 , Л2 и Л3 - фокусирующие линзы, ПЗ - полупрозрачное зеркало, Р - интерференционная решетка, раскладывающая флуоресценцию препарата в спектр, СЗ - селективное зеркало, Ф1 , Ф2 и Ф3 - оптические фильтры, ФЭУ1 , ФЭУ2 и ФЭУ3 - фотоэлектронные умножители.

Источники

1. А. В. Феофанов. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях / А. В. Феофанов // Успехи биологической химии. - 2016. - т. 47. - с.371-410.

2. Lavrentovich O. D. Confocal Fluorescence Microscopy / O. D. Lavrentovich // Characterization of Materials. - 2012. - р. 1-15.

3. Коржевский Д. Э. Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии / Д. Э. Коржевский. - Санкт-Питербург: СпецЛит, 2014. - с. 1-22.

Размещено на Allbest.ru