Вплив декстрану 70 на агрегацію протипухлинного цитокіна ЕМАР ІІ

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив декстрану 70 на агрегацію протипухлинного цитокіна ЕМАР ІІ

Л.А. Коломієць

Мета. Визначення впливу температури на агрегаційні властивості рекомбі- нантного цитокіна ЕМАР ІІ (ендотеліальний моноцит, що активує поліпептид ІІ) та його комплексу з поліцукридом декстраном 70 в розчині. Методи. Бактеріальна експресія рекомбінантного білка, метал-хелатувальна афінна хроматографія, динамічне розсіювання світла, моделювання просторової структури. Результати. Досліджені агрегаційні властивості рекомбінантного цитокіна ЕМАР ІІ та його комплексу з декстраном 70 і встановлені розміри комплекса методом динамічного розсіювання світла. Показана стабілізація цитокіна ЕМАР ІІ декстраном 70 при підвищенні температури в межах від 20 °С до 55 °С. За допомогою комп'ютерного моделювання молекулярного докінгу запропоновані можливі механізми агрегації цитокіну ЕМАР ІІ та його стабілізації декстраном 70. Висновки. Отримані результати свідчать, що протипухлинний рекомбінантний цитокін ЕМАР ІІ утворює білкові агрегати при підвищенні температури. Стабільність цитокіна ЕМАР ІІ в розчині підвищується в результаті взаємодії з декстраном 70. Стабілізація структури ЕМАР ІІ в комплексі розширює можливості досліджень протипухлинних властивостей цього цитокіна та його практичного використання. рекомбінантний цитокін білок декстран

Ключові слова: цитокін ЕМАР ІІ, декстран 70, агрегація, молекулярний докінг, E. coli BL21(DE3)pLysE.

Цель. Определение влияния температуры на агрегационные свойства рекомбинантного цитокина ЕМАР II (эндотелиальный моноцит активирующий полипептид II) и его комплекса с полисахаридом декстраном 70 в растворе. Методы. Бактериальная экспрессия рекомбинантного белка, металл-хелатирующая афинная хроматография, динамическое рассеяние света, моделирование пространственной структуры. Результаты. Исследованы агрегационные свойства рекомбинантного цитокина ЕМАР IIи его комплекса с декстраном 70 и установлены размеры комплекса методом динамичного рассеивания света. Показана стабилизация цитокина ЕМАР IIдекстраном 70 при повышении температуры в пределах от 20 °С до 55 °С. С помощью компьютерного моделирования молекулярного докинга предложены возможные механизмы агрегации цитокина ЕМАР II и его стабилизации декстраном 70. Выводы. Полученные результаты свидетельствуют, что противоопухолевый рекомбинантный цитокин ЕМАР IIобразует белковые агрегаты при повышении температуры. Стабильность структуры ЕМАР II в комплексе расширяет возможности исследований противоопухолевых свойств этого цитокина и его практического использования.

Ключевые слова: цитокин ЕМАРІІ, декстран 70, агрегация, молекулярный докинг, E. coli BL21(DE3) pLysE.

Aim. Determination of the effect of temperature on the aggregation properties of the recombinant cytokine EMAP II (endothelial monocyte activating polypeptide II) and its complex with polysaccharide dextran 70 in solution. Methods. Bacterial expression of recombinant protein, metal-chelated affinity chromatography, dynamic light scattering, spatial structure modeling. Results. The aggregation properties of the recombinant cytokine EMAP II and its complex with the dextran 70 were studied and the complex dimensions were determined by dynamic light scattering. The stabilization of the cytokine EMAP II with the dextran 70 was shown with increasing temperature in the range from 20 to 55° С. Using computer modelling of molecular docking, possible mechanisms for the aggregation of EMAP II cytokine and its stabilization with the dextran 70 were proposed. Conclusions. The results obtained indicate that the antitumor recombinant cytokine EMAP II forms protein aggregates with increasing temperature. The stability of the EMAP II structure in the complex expands the possibilities of studying the antitumor properties of this cytokine and its practical use.

Key words: cytokine EMAP II, dextran 70, aggregation, molecular docking, E. coli BL21(DE3) pLysE.

Терапевтичні засоби на основі білків стають все більш важливим класом фармацевтичних препаратів, які мають низку переваг перед загальновживаними лікарськими препаратами. Слід зазначити, що фармацевтичні препарати на основі білків проявляють більшу специфічність щодо мішеней та меншу токсичність. Білкові терапевтичні засоби використовуються в широкому спектрі медичних застосувань, включаючи гормональну терапію, онкологію, аутоімунні порушення, а також як протиінфекційні агенти [1, 2]. Одним із складних аспектів фармацевтичної розробки терапевтичних засобів на основі білків є значна лабільність їхньої структури, що робить цей клас препаратів дуже сприйнятливим до деградації під час виробництва, зберігання та введення в організм в якості лікарських препаратів [3]. В зв'язку з цим проблемі агрегації як важливому аспекту цілісності лікарських препаратів приділяється особлива увага.

При виробництві білкових терапевтичних засобів агрегація білків може виникати як в процесі експресії та очистки білків, так і в процесі зберігання таких ліків. Агрегати білків можуть викликати імуногенну реакцію у пацієнтів та призводити до значного зниження ефективності лікарських засобів. Саме тому агрегація білків вважається одним із найважливіших аспектів якості при розробці та оцінці біопрепаратів. При порушенні нативної структури білки втрачають функціональну активність, стають менш стабільними, а також підвищується їх здатність до агрегації, що може призвести до широкого спектру патологічних станів як клітин, так і організму в цілому [4, 5].

Найбільш ефективним засобом боротьби з агрегацією білків є використання лігандів, які запобігають утворенню білкових агрегатів. Ці допоміжні речовини широко використовують під час виробництва, очистки та приготування лікарських форм різних медичних препаратів [6].

Ендотеліальний моноцит, що активує поліпептид ІІ (ЕМАР ІІ) -- цито- кін, який проявляє протипухлинну та протизапальну активність, бере участь в ангіогенезі, ембріогенезі та деяких патологічних процесах, індукує апоптоз клітин ендотелію [7, 8]. Експресія ЕМАР II в тканинах підвищується при їх пошкодженні, що пов'язано з участю ЕМАР II в реакціях запалення: його здатністю залучати нейтрофіли в місце пошкодження, підвищувати чутливість тканин до фактора некрозу пухлин (ФНП) та індукувати апоптоз клітин[9-11].

Метою даної роботи було дослідження агрегаційних властивостей та розмірів рекомбінантного цитокіну ЕМАР ІІ та його комплексу з поліцукридом декстраном 70 для подальшого впровадження в практику та проведення доклінічних досліджень.

Матеріали і методи

Для отримання протипухлинного цитокіна ЕМАР ІІ в роботі використовували штам-продуцент рекомбінантного білка E. coli BL21(DE3)pLysE (“Stratagene”, США), трансформований плазмідною конструкцією рЕТЗОа- EMAP II. Експресуюча конструкція рЕТЗОа-EMAPII була створена на базі вектору pET-30a(+) (“Novagen”, США) і містила клоновану кДНК гену EMAP II під контролем промотора фага Т7. Селективним маркером плазміди є ген kan,який забезпечує стійкість трансформованих клітин до антибіотика кана- міцина. Плазмідну ДНК виділяли за допомогою Gene JET Plasmid Miniprep Kit фірми ''Thermo Scientific“. Концентрацію плазмідної ДНКвизначали на спектрофотометрі NanoDrop 2000 ('Thermo Scientific“, Литва).

Всі процедури з трансформації плазмідної конструкції рЕТ30а-ЕМАР ІІ в компетентні клітини E. coliта аналіз плазмід проводили методом електрофорезу в 0,7-1% агарозному гелі згідно [12].

Вирощування культури E. coli BL21(DE3)pLysE та індукцію експресії рекомбінатного ЕМАР ІІ в бактеріальрій культурі проводили в середовищі Луріа-Бертані (LB) (5 г дріжджового екстракту, 10 г триптону, 10 г NaCl на 1л) згідно [13]. Оптичну густину культури (ОГ₆₀₀) визначали спектрофотометрично (спектрофотометр BioMate-5, Велика Британія) при довжині хвилі 600 нм. Для індукції синтезу рекомбінантних білків до бактеріальної культури додавали індуктор експресії ІПТГ (ізопропіл^-тіогалактопіранозид, “Sigma”, США) до кінцевої концентрації 1,25 мМ.

Рекомбінантний білок отримували із супернатанту бактеріальних клітин після їх лізису за допомогою ультразвукового дезінтегратора методом метал-хелатувальної хроматографії на колонці з Ni-NTA-агаро- зою (Qiagen, Germany) [13]. Аналіз бактеріального білка проводили за допомогою SDS-гель-електрофорезу за методом Леммлі в денатуруючих умовах у 12% гелі [12], використовуючи суміш маркерних білків (ThermoScientific, Литва). Гелі забарвлювали CoomassieblueR-250. Концентрацію очищеного рекомбінантного білка ЕМАР ІІ визначали спектрофотометрично, використовуючи коефіцієнт екстинкції 8730 M^-1cm^-1при довжині хвилі 280 нм. Оскільки синтезовані у векторі рЕТ30а білки містять в своїй N-кінцевій амінокислотній послідовності кодований вектором 6His-tag, для його відщеплення від ЕМАР ІІ використовували ентерокіназу за стандартною методикою виробника (NewEnglandBiolabs) та рекомбінантний цитокін додатково очищали на колонці з Ni-NTA агарозою. Високий ступінь чистоти отриманих препаратів рекомбінантного EMAP II було показано раніше [14].

Нанокомпозитний препарат ЕМАР ІІ з декстраном 70 було створено згідно запатентованої корисної моделі [15]. Декстран 70 (“Біотика АТ”, Словаччина) розчиняли у аліквоті білка в 50 мМ Na-фосфатному буфері, рН 7,5 з 150 мМ NaCl та перемішували при кімнатній температурі протягом 2 год.

Для дослідження використовували ЕМАР ІІ в концентрації 0,6 мг/мл (6,87 мкМ) та декстран 70 в концентрації 50 мг/мл (7,1 мМ). Стехіометрія зв'язування декстрану 70 з цитокіном становила близько 1:1. Стехіометрія зв'язування (n) та константа зв'язування (K_d) були обчислені програмою OriginPro 8.0 згідно наведеного нижче рівняння:

де F₀та F - інтенсивність флуоресценції білка при максимальній довжині хвилі в присутності ліганду та без нього відповідно, K_a- константа асоціації, а n- стехіометрія комплексу. Числові значення досліджуваних величин були отримані за допомогою функції Analysis^ Fitting^ Fit Linear.Рівняння отримано в результаті обчисленьy = a + bx,де yта x відповідають виразам

Та

в той час як а та b - та n відповідно.

Вимірювання світлорозсіювання проводилина лазерному кореляційномуспектрометрі “ZetaSizer-3” обладнаному He-Ne лазером ЛГН-111 (Р = 25 мВт, X = 633 нм) з діапазоном вимірювання приладу від 1 нм до 20 мкм.

Реєстрацію та статистичне опрацювання лазерного випромінювання, розсіяного від розчину EMAPIIта його комплекса з декстраном-70, проводили 5-разово протягом 60 с в діапазоні температур від +20 °С до +55 °С під кутом розсіювання 90°.

Отримані результати вимірювань обробляли за допомогою сервісної комп'ютерної програми PCS-Sizemodev1.61.

Моделювання взаємодії між просторовими структурами EMAPIIпроводили за допомогою веб-серверів для макромолекулярного докінга Cluspro2.0 [16] та SymmDock [17]. Візуалізацію, аналіз просторової структури та розрахунок радіусу гірації здійснювали у програмному забезпеченні UCSFChimera[18]. Моделювання комплексу ЕМАР ІІ з декстраном 70 здійснювали за допомогою програми AutoDockVina[19]. Для проведення докінгу використано просторову структуру EMAPII, визначену методом рентгеноструктурного аналізу (PDBID: 1EUJ).

Результати та їх обговорення

Дослідження проводили на високоочищеному препараті рекомбінант- ного цитокіна EMAPII.

На початковому етапі роботи була проведена оцінка розміру поліцукриду декстрана 70 у розчині при кімнатній температурі методом динамічного розсіювання світла. Аналіз даних показав, що гідродинамічний діаметр полімерного вуглеводу знаходиться в діапазоні 0,4-4 нм. Наші дослідження по утворенню комплексу декстрану 70 з цитокіном при різних концентраціях полімеру показали, що стехіометрія зв'язування декстрану з EMAPII становить близько 1:1. Раніше нами було показано, що комплекс ЕМАР ІІ з декстраном 70 зберігає функціональну цитокінову активність [9]. Всі проведені в роботі дослідження по агрегації були проведені для цього комплексу.

Температурне плавлення рекомбінантного EMAPII та його комплексу з декстраном 70 вивчали в діапазоні температур 20-55 °С. Досліджуваний інтервал температур відповідає на наш погляд граничним температурним умовам використання та збереження білкових лікарських препаратів.

Аналіз спектрів EMAPIIпоказав, що при кімнатній температурі в розчині білка присутні значні за розмірами осередки розсіювання світла з розмірами 20-40 нм, що, ймовірно, зумовлено процесом утворення агрегатів білка різного розміру, оскільки теоретично розрахований комп'ютерним методом діаметр одної молекули EMAPII становить близько 3 нм. При подальшому підвищенні температури спостерігається плавлення білка, що супроводжується постійним зростанням розмірів агрегатів під впливом температури (рис. 1).

Наступним кроком було дослідження розмірів комплексу EMAPIIз декстраном 70 у розчині при різних температурах. З графіка на Рис.1 видно, що розміри комплексу EMAPII-декстран 70 при зростанні температури значно відрізняються від розмірів білка EMAPII. При підвищенні температури відбувається значне підвищення гідродинамічного діаметру часток вільного цитокіна у розчині. В той же час з підвищенням температури розмір частинок комплекса EMAPII-декстран 70 не змінюються і така тенденція зберігається до температури 55 °С. Ці дані свідчать про те, що комплекс EMAPII- декс- тран 70 досить стабільний і не руйнується при високих температурах , а також що поліцукрид декстран 70 стабілізує білкову глобулу EMAPII та перешкоджає процесу агрегації.

Fig. 1. Dimensions of EMAP II protein (1) and EMAR II complex with dextran 70 (2) in solution at different temperatures

Щоб з'ясувати природу формування агрегатів білка EMAP II проводили комп'ютерне моделювання взаємодії між окремими мономерами білка за допомогою веб-серверів для макромолекулярного докінга Cluspro 2.0 та SymmDock. Для комп'ютерного моделювання було використано просторову структуру EMAP II, визначену методом рентгеноструктурного аналізу (ProteinDataBankкод 1EUJ). Амінокислотна послідовність цитокіна EMAPII представлена на Рис. 2.

Аналіз просторових структур виявив, що одну з ключових ролей у формуванні контакту між різними молекулами EMAPIIвідіграє неструкту- рована петля ³⁴DVGEIAPR⁴¹молекули білка (в амінокислотній послідовності EMAPIIвиділена), яка при взаємодії з іншою молекулою білка блокує гідрофобну триптофанову “кишеню” на його поверхні (рис. 3).

Взаємодія між неструктурованою петлею і амінокислотним оточенням триптофанового залишка має гідрофобний характер, що може забезпечувати достатній рівень енергії зв'язування між ними, а просторова структура петлі ³⁴DVGEIAPR⁴¹відповідає формі триптофанової “кишені”. Завдяки цьому результати моделювання комплексів EMAPIIобома веб-серверами є практично ідентичними (рис. 4, 5). Таким чином, аналіз отриманих результатів свідчить, що ймовірним початковим механізмом утворення агрегатів EMAPIIу розчині при підвищених температурах є гідрофобна взаємодія між молекулами білка.

Рис. 2. Амінокислотна послідовність EMAPII. Неструктурована ділянка ³⁴DVGEIAPR⁴¹та амінокислотні залишки, що входять до триптофанової “кишені” виділені курсивом та підкреслені

Рис. 3. Формування молекулярних контактів між молекулами EMAPII в процесі утворення агрегатів білка. На одній молекулі EMAPII зображена неструктурована петля ³⁴DVGEIAPR⁴¹(виділена синім кольором), а на іншій молекулі EMAPII зображені амінокислотні залишки (виділені червоним кольором), що входять до триптофанової “кишені”

Для з'ясування механізму стабілізації протипухлинного препарату EMAP II декстраном 70 проводили комп'ютерний докінг поліцукриду з ци- токіном за допомогою програми AutoDock Vina (рис. 6). Отримані результати по докінгу та моделюванню утворення агрегатів ЕМАР ІІ вказують на те, що можливий механізм перешкоджання агрегації ЕМАР ІІ декстраном 70 полягає у зв'язуванні поліцукриду з неструктурованою петлею ³⁴DVGEIAPR⁴¹ та гідрофобною триптофановою "кишенею" в структурі білка. Згідно моделей у зв'язуванні декстрана 70 з ЕМАР ІІ залучені такі залишки, як Arg12,

Рис. 4. Модель просторової структури агрегатів EMAPII, отриманої в результаті макромолекулярного докінгу окремих молекул EMAPII за допомогою веб-сервера Cluspro2.0. Різними кольорами виділені молекули EMAPII, які взаємодіють між собою, утворюючи агрегат

Рис. 5. Модель просторової структури агрегатів молекул EMAPII, отриманої в результаті макромолекулярного докінгу двох молекул EMAPII за допомогою веб-сервера SymmDock. Різними кольорами виділені молекули EMAP II, які взаємодіють між собою, утворюючи агрегат

Рис. 6. Модель просторової структури комплексу EMAPII--декстран 70, отриманої в результаті макромолекулярного докінгу молекул EMAPII та декстрану 70 за допомогою програми AutoDockVina. Залишки білка, які зв'язуються з поліцукридом виділені червоним кольором, а декстран 70 -- зеленим

Отже, згідно даних комп'ютерного моделювання структури комплексаЕМАР II з поліцукридом окремі молекули декстрана 70 блокують потенційні сайти на поверхні білка, відповідальні за утворення агрегатів ЕМАР II. Результати по моделюванню узгоджуються з експериментальними даними по термостабілізації комплекса, отриманими методом динамічного світлорозсіювання.

В результаті дослідження впливу температури на агрегаційні властивості протипухлинного цитокіну ЕМАР II та створено термостабільний комплекс білка з декстраном 70 зі зниженою агрегацією. Термостабільність комплексу відкриває перспективи для подальшого використання ЕМАР II в фармакологічних дослідженнях як нового потенційного протипухлинного препарата.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Pйrez-Herrero E., Fernвndez-Medarde A. Advanced targeted therapies in cancer: Drug nanocarriers, the future of chemotherapy // Eur. J. Pharm. Biopharm.

- 2015, - 93. - P. 52-79.

2. Pesarrodona M., Jauset T., Diaz-Riascos Z.Vet al. Antitumoral proteins to breast cancer by local administration of functional inclusion bodies // Adv. Sci.

- 2019. - 6, №18. doi: 10.1002/advs.201900849.

3. Chaudhuri R., Cheng Y, Middaugh C.R., Volkin D.B. High-Throughput Biophysical Analysis of Protein Therapeutics to Examine Interrelationships Between Aggregate Formation and Conformational Stability // AAPS J. - 2013. - 16, № 1. - Р 48-64.

4. Bond M.D., Panek M.E., Zhang Z., Wang D., Mehndiratta P, Zhao H., Volkin D.B. Evaluation of a Dual-Wavelength Size Exclusion HPLC Method With Improved Sensitivity to Detect Protein Aggregates and Its Use to Better Characterize Degradation Pathways of an IgG1 Monoclonal Antibody // J. Pharm. Sci. - 2010. - 99, № 6. - Р 2582-2597.

5. Wuchner K., Bьchler J., Spycher R., Dalmonte P, Volkin, D.B. Develop- ment of a Microflow Digital Imaging Assay to Characterize Protein Particulates During Storage of a High Concentration IgG1 Monoclonal Antibody Formulation // J. Pharm. Sci. - 2010. - 99, №8. - Р 3343-3361.

6. Wu F, Zhou Z., Su J., Wei L., Yuan W., Jin T Development of dextran nanoparticles for stabilizing delicate proteins // Nanoscale Res. Let. - 2013. - 8, № 1. 197. doi: 10.1186/1556-276X-8-197.

7. Reznikov A, Chaykovskaya L, Polyakova L, Kornelyuk A. Antitumor effect of endothelial monocyte-activating polypeptide-II on human prostate adenocarcinoma in mouse xenograft model // Exp. Oncol. - 2007. - 29. - Р 267-71.

8. Lal C.V., Schwarz M.A. Vascular Mediators in Chronic Lung Disease of Infancy: Role of Endothelial Monocyte Activating Polypeptide II (EMAP II) Birth Defects Res. - 2014. 100, № 1. - Р 180-188.

9. Kolomiets-Babenko L.A., Bohorad-Kobelska O.S., Kovalchuk N.L., Spivak M. Ja., KornelyukA.I. Nanocomposite Complex EMAP II Influence on Tumor Necrosis Factor and Interferon // Biotech. Acta. - 2016. - 9, № 5. - P 18-23.

10. Berger A.C., Alexander H.R., Wu PC.et al. Tumor necrosis factor receptor I (p53) is upregulated on endothelial cell by exposure to the tumor derived cytokine endothelial monocyte-activating polypeptide II (EMAP II) // Cytokine. - 2000. - 12, № . - P 992-1000.

11. Kwon H.-S., ParkM.C., Kim D.G., Cho K., Park Y.W., Han, J.M., Kim. Identification of CD23 as a functional receptor for the proinflammatory cytokine AIMP1/p43 // Journal of Cell Science. - 2012. - 125, № 19. - Р4620-4629.

12. Sambrook J., Fritsch E.F., andManiatis T Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. - New York: C.S.H.L. Press, 1989.

13. Бабенко Л.А., Скоробогатов О.Ю., Дубровський О.Л., Корнелюк О.І. Оптимізація бактеріальної експресії протипухлинного цитокіна ЕМАР ІІ в клітинах E.coli BL21(DE3)pLysE // Мікр.Біотех. - 2010. - № 3. - С. 21-31.

14. Д.М. Ложко, І.Ю. Жуков, О.І. Корнелюк.Бактеріальна експресія та мічення ізотопами 13C/15N цитокіну EMAP II для структурних досліджень методом ЯМР-спектроскопії // Biopol. Cell. - 2011. - 27, № 4. - P. 273-278.

15. Корнелюк О.І., Бабенко Л.А., Козлов О.В. Нанокомпозитний протипухлинний препарат. Патент № 64374. Опубліковано 10.11.2011, Бюл^ 21.

16. Comeau S.R., GatchellD.W., Vajda S., Camacho C.J. ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes // Bioinformatics. - 2004. - 20, № 1. - P. 45-50.

17. Schneidman-Duhovny D., Inbar Y., Nussinov R., Wolf-son H.J.PatchDock and SymmDock: servers for rigid and symmetric docking // Nucl. Acids Res. - 2005. - 1, № 33 (Web Server Issue). - P. W363-W367.

18. PettersenE.F., GoddardT.D., HuangC.C., Couch G.S., GreenblattD.M., Meng E.C., Ferrin TE. UCSF Chimera-A visualization system for exploratory research and analysis // J. Comput. Chem. - 2004. - 25, № 13. - P. 1605-1612.

19. Trott O, Olson A.J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading //

J.Comp. Chem. - 2010. - 31, № 2. - P. 455-461.

Размещено на Allbest.ru