Псевдоген PTENP1, в отличие от гена PTEN, метилирован в нормальных, гиперпластических и малигнизированных тканях эндометрия женщин среднего и пожилого возраста

Размещено на http://www.allbest.ru/

Псевдоген PTENP1, в отличие от гена PTEN, метилирован в нормальных, гиперпластических и малигнизированных тканях эндометрия женщин среднего и пожилого возраста

Т. Ф. Коваленко

РЕФЕРАТ Опухолевый супрессор PTENконтролирует многие клеточные функции, включая клеточный цикл, апоптоз, старение, транскрипцию и трансляцию мРНК многих генов. В клетках различных опухолей PTENчасто инактивируется генетическими мутациями и эпимутациями. В данной работе изучено метилирование гена PTENи его псевдогена PTENP1как возможного генетического маркера гиперплазий (ГЭ) и рака (РЭ) эндометрия. Метилирование 5'-концевых участков PTENи PTENP1анализировали с помощью метилчувствительной ПЦР в геномной ДНК, выделенной из тканей 57 злокачественных опухолей и 43 гиперплазий эндометрия, нормальных тканей 24 женщин в возрасте 17-34 лет и 19 женщин в возрасте 45-65 лет, а также из 20 образцов периферической венозной крови больных РЭ. Установлено, что ни в одном из образцов ДНК ген PTENне был метилирован. В отличие от этого, метилирование псевдогена PTENP1 обнаружено во всех исследованных тканях, кроме периферической крови. Сравнение частот метилирования PTENP1в группах РЭ и ГЭ и в контрольной группе женщин среднего и пожилого возраста (СПВ) не выявило статистически значимых различий между ними (0.80 <р< 0.50). Во всех этих группах выявлен высокий уровень метилирования (71-77% у пациенток против 58% в контрольной группе). При этом обнаружены значимые различия в частотах метилирования PTENP1в нормальном эндометрии молодых (4%) и СПВ (58%) женщин (р< 0.001). Сделан вывод, что метилирование псевдогена PTENP1может отражать возрастные изменения и не имеет прямой связи с исследуемой патологией эндометрия. Предполагается, что в зависимости от влияния метилированного PTENP1на экспрессию гена PTENметилирование псевдогена может защищать организм от развития РЭ и/или служить маркером предракового состояния клеток эндометрия. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА гиперплазия эндометрия, длинные некодирующие РНК, метилирование ДНК, рак эндометрия, PTEN, PTENP1.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ГЭ - гиперплазия эндометрия; РЭ - рак эндометрия; днРНК - длинные некодирующие РНК; кэРНК - конкурирующая эндогенная РНК; миРНК - микроРНК; СПВ - средний (45-55 лет) и пожилой (старше 55 лет) возраст; сРНК - смысловая РНК; асРНК - антисмысловая РНК; MRE- microRNArecognitionelement(элемент, узнающий микроРНК); PICS- PTEN-loss-inducedcellularsenescence(клеточное старение, индуцированное потерей PTEN);PTEN- phosphataseandtensinhomolog (гомолог фосфатазы и тензина).

ВВЕДЕНИЕ

Рак эндометрия (РЭ) - одно из самых распространенных онкологических заболеваний женских половых путей, частота которого составляет 4.8% от всех онкопатологий у женщин [1]. Вероятность возникновения РЭ увеличивается с возрастом: к 75 годам кумулятивные риски заболевания достигают 1%, а смерти - 0.2%. Хотя РЭ рассматривается как постменопаузальное заболевание, которое развивается у женщин старше 50 лет, до 14% клинических случаев РЭ диагностируется в пременопаузе, и из них только 5% у женщин моложе 40 лет [2-4]. Распространение ожирения и метаболического синдрома в популяциях Европы и Северной Америки, сопровождающиеся повышением уровня эндогенных эстрогенов, а также общее старение населения этих стран позволяет предполагать значительное возрастание инцидентов заболевания в этих регионах в ближайшем будущем [5]. Все это диктует необходимость исследования этиологии, а также поиска биомаркеров ранней диагностики РЭ с целью его предупреждения и проведения своевременного адекватного лечения.

В зависимости от сферы применения в медицине биомаркеры принято разделять на прогностические, предиктивные и фармакодинамические [6]. Биомаркеры первого типа используют для оценки тяжести заболевания и выживаемости пациентов независимо от проводимого лечения. Предиктивные биомаркеры позволяют предсказывать реакцию больных на проводимое лечение, а фармакодинамические - индивидуальный ответ пациента на воздействие лекарственных препаратов с учетом генетических особенностей молекулярных мишеней используемых лекарств, а также ферментов их метаболизма.

На основе биомаркеров РЭ традиционно разделяют на два подтипа [1, 7-9]. Наиболее часто встречающийся и, как правило, спорадически возникающий РЭ типа I, обычно характеризуется наличием высокодифференцированных клеток, по гистологическим характеристикам является эндометриоидным, а сами клетки опухоли обнаруживают нормальный диплоидный кариотип, нестабильность микросателлитов (MSI) и экспрессируют рецепторы эстрогенов (ER) и прогестерона (PR). При РЭ типа I мутации в гене опухолевого супрессора ТР53 происходят редко, и больные имеют хорошие шансы на выздоровление. В отличие от этого, РЭ типа II не относится к эндометриоидным опухолям, содержит низкодифференцированные клетки, для многих из которых характерна анеуплоидия, отсутствуют генетические изменения в белке р53, а ER и PR не экспрессируются. При этом течение болезни имеет неблагоприятный прогноз. псевдоген эндометрия бисульфитная конверсия

Данные гистологического и молекулярно-генетического анализа позволяют разделить РЭ типа II на несколько дополнительных подтипов, в том числе серозный и светлоклеточный РЭ, а также сарцино- саркому [1]. Проведенный недавно с использованием глубокого секвенирования геномной ДНК метаанализ мутаций в опухолях эндометрия выявил также значительную гетерогенность их мутационных спектров и позволил разделить РЭ на четыре группы [7].

Одним из факторов риска развития РЭ являются гиперпластические процессы в эндометрии, которые происходят на фоне дисбаланса эндогенных стероидных гормонов: эстрогенов и прогестерона [10-12]. ГЭ отличает избыточная пролиферация клеток, сопровождаемая характерными морфологическими изменениями ткани. По классификации ВОЗ 94 в гиперплазии эндометрия выделяют ГЭ без атипии и ГЭ с атипией, которые, в свою очередь, делятся на простые и комплексные [10, 11]. Своевременно выявленные ГЭ обычно хорошо отвечают на терапию. Тем не менее комплексные ГЭ без атипии и с ати- пией трансформируются в РЭ приблизительно в 25 и 50% случаев соответственно [13]. Как при раке, так и при гиперплазии в разной степени нарушен контроль пролиферации клеток, что сопровождается увеличением числа клеток в единице объема ткани.

Клетки РЭ гораздо чаще содержат мутации в генах сигнального пути РМК/АКТ, чем клетки опухолей других типов [7, 14]. Серин-треониновая протеинкиназа АКТ регулирует многие клеточные функции

[15] . Важнейшим негативным регулятором передачи сигналов по этому пути является фосфатаза двойной специфичности РТЕ№ Мутации в гене PTEN, расположенном на хромосоме 10q23.3, часто обнаруживают при ГЭ и в 93% случаев РЭ. Основной субстрат PTEN - вторичный посредник фосфатидилинозитол- (3,4,5)-трифосфат (Р№3), под действием PTEN утрачивает З'-фосфатную группу, превращаясь в Р№2. Дефосфорилированный Р№2 теряет способность активировать АКТ, что блокирует передачу сигнала по этому пути и подавляет многие клеточные активности и функции, включая прохождение по клеточному циклу, апоптоз, подвижность и полярность клеток, их старение, самообновление стволовых клеток, процессы транскрипции и трансляции. Для проявления супрессорных свойств PTEN важна его альтернативная протеинфосфатазная активность, вовлеченная в дефосфорилирование проапоптотических белков, протеинкиназ и факторов транскрипции [15

17] . Недавно обнаружили внеклеточные и внутриядерные супрессорные функции РТЕ^ независимые от его фосфатазной активности [18]. Все это указывает на PTEN как наважный прогностический и предиктивный биомаркер канцерогенеза [19], а также освещает молекулярные механизмы участия PTEN в этиологии РЭ и подчеркивает необходимость изучения регуляции его активности в норме и при РЭ.

В нормальных тканях ген PTEN экспрессируется конститутивно, и его функции строго контролируются [17, 20]. Активность PTEN регулируется на всех уровнях его экспрессии: путем активации и подавления транскрипции [21-23], посттранскрипционно на уровне мРНК с участием многочисленных микроРНК [24, 25], а также на посттрансляционном уровне посредством ковалентных модификаций белкового продукта и взаимодействий с многочисленными мембранными, цитоплазматическими и ядерными белками [20]. Как позитивный, так и негативный контроль транскрипции гена PTEN происходит с участием нескольких факторов транскрипции, а в подавление транскрипции вовлечены эпигенетические механизмы. В последнем случае имеет место метилирование промоторных участков ДНК гена PTEN, а также деацетилирование гистонов хроматина на промоторе. Таким образом, имеющиеся данные показывают, что инактивация гена опухолевого супрессора РТЕ^ ассоциированная с прогрессией опухолей при ГЭ и РЭ, может происходить под действием как генетических, так и эпигенетических мутаций.

Процессированный (не содержащий интронов) псевдоген PTENP1, расположенный на хромосоме 9р13.3, на 98.6% гомологичен функциональному гену PTEN, однако не экспрессирует белок PTEN из-за потери кодона инициации трансляции в результате мутации [26]. PTENP1, как правило, транскрибируется с образованием трех длинных некодирующих РНК (днРНК) - одной смысловой (сРНК) и двух антисмысловых (асРНК) а и в [27]. Транскрипция происходит с двух разнонаправленных, перекрывающихся промоторов, и образующиеся транскрипты выполняют важные регуляторные функции: сРНК проявляет в клетке свойства конкурирующей эндогенной РНК (кэРНК) [28-30]. В соответствии с этим механизмом, сайты связывания микроРНК (миРНК) MRE, локализованные на сРНК псевдогена, конкурируют с MRE мРНК гена PTENза взаимодействующие с ними специфические миРНК, препятствуя их ингибирующему действию на трансляцию РТЕ^мРНК. В том же направлении действует и по- лиаденилированная асРНК-в. Она взаимодействует с 5'-концом неполиаденилированной PTENP1-сРНК и стабилизирует ее, обеспечивая более эффективное конкурирующее действие последней. В отличие от этого, асРНК-а обеспечивает доставку по крайней мере двух белков, участвующих в перестройке хроматина - ДНК-метилтрансферазы ЗА (DNMT3A) и Zeste-энхансера (EZH2), к промотору гена PTEN [27]. Эти белки обеспечивают тримети- лирование гистона НЗ по остатку Lys27 (Н3К27те3), маркеру неактивного хроматина с подавленной транскрипцией. Разнонаправленное действие транс- криптов псевдогена PTENP1 на экспрессию гена опухолевого супрессора PTEN предполагает необходимость тонкой регуляции их соотношения в клетке. Механизмы такой регуляции, которые могут быть нарушены в опухолях, не изучены. Делеции псевдогена PTENP1 обнаружены в спорадических опухолях прямой кишки [28], а также при первичной и метастатической меланоме [31]. Другой возможный механизм инактивации псевдогена PTENP1 путем метилирования его промоторной области выявлен при раке легкого [32], а недавно в опухолях светлоклеточного рака почки [33].

Ранее мы впервые обнаружили метилирование 5'-концевой промоторной области псевдогена PTENP1 при РЭ и ГЭ [34]. В настоящей работе метилирование PTENP1 при РЭ и ГЭ было изучено более детально, а также впервые выявлено метилирование исследуемой области псевдогена в клетках нормального эндометрия женщин среднего и пожилого возраста (СПВ). Кроме того, проанализирован статус метилирования областей промотора гена PTEN, не изученных ранее при РЭ и ГЭ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пациенты и образцы тканей

В работе использовали образцы тканей 143 пациенток Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина, а также московских клинических больниц № 4 и 55. В исследование были включены образцы тканей 57 больных РЭ (средний возраст 61.9 ± 7.8 лет) и 43 пациенток с простой гиперплазией эндометрия (средний возраст 52.1 ± 6.5 лет). Кроме того, исследовали периферическую венозную кровь 20 больных РЭ из основной группы (средний возраст ± 7.6 лет), у которых обнаружено метилирование PTENP1 в эндометрии. Контрольную группу составили 43 женщины с гистологически неизмененным эндометрием, проходившие обследование в связи с подозрением на предраковое состояние эндометрия. Данная группа включала две подгруппы: 24 женщины в возрасте от 17 до 34 лет (средний возраст ± 4.8 лет) и 19 женщин в возрасте от 45 до 65 лет (средний возраст 52.5 ± 6.0 лет). Сравнение среднего возраста контрольной подгруппы (45-65 лет) и группы больных РЭ (57 человек) с использованием критерия Манна-Уитни выявило статистически значимые различия (р< 0.05). Поэтому при сравнении метилирования псевдогена PTENP1 из группы больных РЭ были исключены женщины старше 59 лет и выделена подгруппа из 24 больных (48-59 лет, средний возраст - 54.3 ± 3.4 лет), которая по этому признаку не отличалась от контрольной подгруппы (р = 0.095). Использовали как свежезамороженные ткани, полученные во время операций или при взятии биопсии, так и образцы, фиксированные формалином и заключенные в парафиновые блоки. Периферическую венозную кровь брали путем пункции локтевой вены. В качестве антикоагулянта добавляли 3.8% раствор цитрата натрия в соотношении 1 : 9. Стадии РЭ классифицировали в соответствии с рекомендациями Международной федерации акушерства и гинекологии (FIGO). Гистологический тип РЭ определяли в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения. Согласие на обработку данных получено от всех пациенток, включенных в исследование.

Выделение ДНК и ее бисульфитная конверсия

Геномную ДНК выделяли стандартным методом с применением фенола и гуанидинхлорида [35]. В случае образцов ткани, заключенных в парафиновые блоки, каждый блок измельчали с помощью микротома до фрагментов толщиной 10 мкм. Далее проводили депарафинизацию образца и экстракцию ДНК согласно методике [36] с незначительными модификациями. Концентрацию ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, США). Бисульфитную конверсию проводили с помощью EpiTectBisulfiteKit (Qiagen, Германия) согласно протоколу, предложенному фирмой-производителем.

Метилчувствительная ПЦР

Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 67 мМ Трис-HCl(pH 8.8), 16.6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0.01% Твин 20, 2 мМ MgCl₂, четыре дезоксирибонуклеозидтрифос- фата (0.2 мМ каждый; «Сибэнзим», Россия), прямой и обратный праймеры (0.5 мкМ каждый), 25 нг конвертированной бисульфитом ДНК и 0.5--1.0 ед. Taq- ДНК-полимеразы. Taq-ДНК-полимеразу получали из рекомбинантного штамма E. coli PVG-A1 по методу Патрушева и др. с незначительными модификациями [37]. В качестве полностью метилированного контроля использовали ДНК, выделенную из лимфоцитов крови человека, метилированную in vitroс помощью метилазы SssI («Сибэнзим», Россия) и обработанную бисульфитом натрия. Неметилированным контролем служила ДНК лимфоцитов крови, конвертированная бисульфитом натрия. После проведения ПЦР на термоциклере Mastercycler pro (Eppendorf, Германия) продукты амплификации анализировали методом электрофореза в 3% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В качестве маркера молекулярной массы использовали 100 + 50 п.н. ДНК- маркер («Сибэнзим», Россия). Типичный результат,полученный с использованием метилчувствитель- ной ПЦР, представлен на рис. 1. Последовательности праймеров, а также условия проведения ПЦР- амплификации с каждой из пар праймеров приведены в табл. 1. С целью исключения неспецифического отжига праймеров для каждой их пары проводили оптимизацию температуры отжига в градиенте температур. Кроме того, для предотвращения появления неспецифических продуктов ПЦР в результате «переамплификации» подбирали оптимальное количество циклов. При анализе 5'-концевой области псевдогена PTENP1использовали праймеры, приведенные в [32]. Участок PTEN2промотора гена PTEN(рис. 2) анализировали с помощью праймеров, разработанных нами. Статус метилирования локусов PTEN4и PTEN5анализировали с использованием праймеров [38] и [32] соответственно.

Таблица 1. Праймеры и условия ПЦР, использованные для определения статуса метилирования промоторов гена РТЕЫ и его псевдогена РТЕЫР1

Примечание. М - метилированный; и - неметилированный; F - прямой праймер; R - обратный праймер; РЫР - праймеры для амплификации участков псевдогена; РЫ - праймеры для амплификации участков гена РТЕЫ.

Рис. 1. Анализ статуса метилирования 5'-концевой области псевдогена PTENP1с помощью метилчув- ствительной ПЦР. н и м - продукт ПЦР-амплификации, образующийся в присутствии праймеров к неметилированной или метилированной матрице соответственно.

В качестве матрицы использовали следующие образцы ДНК, подвергнутые бисульфитной конверсии: нК - из периферической крови (неметилированный контроль), мК - из периферической крови, метилированная invitroс помощью метилазы SssI(метилированный контроль), 3 - из разных опухолей, в которых исследуемая область псевдогена метилирована во всех клетках (1), неметилирована во всех клетках (2), метилирована в части клеток (3). К₀ - амплификация в отсутствие ДНК, М - маркер молекулярных масс

Рис. 2. Исследованные участки гена РТЕЫ (А) и псевдогена РТЕЫР1 (Б). Голубым прямоугольником обозначена область минимального промотора гена РТЕЫ; загнутые красные и зеленые стрелки обозначают точки инициации транскрипции РТЕЫ и РТЕЫР1 соответственно; черные разнонаправленные стрелки обозначают положение праймеров для ПЦР; сРНК - смысловая РНК, асРНК-а и -в- антисмысловые РНК-а и -Р, цифры указывают на расстояние от ATG-кодона (А) или от точки инициации синтеза сРНК (Б)

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ SPSSv. 22 (SPSSInc.). Различия в частотах метилирования гена PTENи его псевдогена PTENP1 в группах оценивали с использованием двухстороннего метода Хи-квадрат и точного критерия Фишера. Статистические различия среднего возраста между группами оценивали с применением критерия Манна-Уитни.

В данной работе нами исследованы три участка в окрестностях минимального промотора гена PTEN, которые включают потенциально метилируемые CpG-последовательности, ранее не анализированные при РЭ (рис. 2). Последовательность, фланкированная праймерами PN2, располагается на 685 п.н. выше ATG-кодона и примыкает непосредственно к минимальному промотору. Область между праймерами PN4 расположена на 1913 п.н. выше ATG-кодона. Метилирование данного участка изучали при меланоме [38]. Последовательность, локализованная между праймерами PN5, метилирование которой уже изучено при раке легкого, располагается на 2300 п.н. выше ATG-кодона [32].

Начиная работу, мы прежде всего установили, что ни в одном из образцов ДНК, выделенных из анализируемых тканей, включая РЭ, ГЭ и нормальный эндометрий, ген PTEN в изучаемых областях промотора не метилирован (табл. 2). Хотя это не исключало наличия в нем генетических мутаций, однако указывало на то, что у наших пациенток ген не мог быть инактивирован с помощью такого эпигенетического механизма. Поэтому в соответствии с опубликованными данными, мы предположили, что инактивация PTEN могла осуществляться по известному механизму кэРНК через подавление транскрипции псевдогена PTENP1 путем метилирования его 5'-концевой области.

Действительно, высокая частота метилирования PTENP1 обнаружена во всех образцах ткани эндометрия, кроме нормального эндометрия молодых женщин (табл. 2). В то же время 73% (8 из 11, табл. 2) образцов нормального эндометрия женщин СПВ с метилированным PTENP1 оказалисьмозаичными, т.е. содержали некоторое количество клеток с неметилированным или частично метилированным псевдогеном (данные не представлены). Мозаичное метилирование псевдогена выявлено и в ряде образцов тканей эндометрия пациенток с ГЭ и РЭ (см., например, рис. 1, дорожки 3н и 3м), что могло быть обусловлено, в том числе, загрязнением биоптатов опухолей нормальными клетками. Метилирование было тканеспецифичным и не наблюдалось в крови пациенток. Сравнение частот метилирования PTENP1 в группах РЭ и ГЭ и в контрольной группе женщин СПВ не выявило статистически значимых различий между ними (0.45 <р< 0.35). Во всех группах уровень метилирования был высоким (71-77% у пациенток против 58% в контрольной подгруппе 2). При этом средний возраст пациенток с РЭ и ГЭ, включенных в это исследование, соответствовал среднему возрасту женщин контрольной подгруппы 2 (54.3, 52.1 и 52.5 лет соответственно). Не обнаружено значимых различий в метилировании PTENP1 и в подгруппах основной группы РЭ, в которых пациентки были разделены по клинико-патологическим характеристикам: возрасту, стадии заболевания, глубине инвазии опухолей в миометрий, степени дифференци- ровки раковых клеток, а также подтипам опухолей (табл. 3). Однако найдены статистически значимые различия в частотах метилирования PTENP1 в нормальном эндометрии молодых (4%) и женщин СПВ (58%) (р< 0.001). Такие результаты оказались неожиданными. Они позволяют предполагать, что метилирование псевдогена PTENP1 отражает, в первую очередь, возрастные изменения в организме человека и не связано непосредственно с исследуемой патологией эндометрия.

Таблица 2. Метилирование промоторов гена PTEN и псевдогена PTENP1 в нормальных, гиперпластических и ма-лигнизированных тканях эндометрия

Примечание. Двусторонний точный критерий Фишера. *Первая цифра - процент метилированных образцов ДНК, вторая цифра - число метилированных образцов, третья цифра - общее число образцов. **Из основной группы в 57 человек с РЭ выделена подгруппа, соответствующая по возрасту контрольной группе сравнения. ***Нормальный эндометрий 24 (17-34) против 52.5 (45-65). ****Против нормального эндометрия 52.5 (45-65).

Таблица 3. Ассоциация метилирования псевдогена РТЕЫР1 с клинико-патологическими характеристиками больных раком эндометрия

Примечание. Точный критерий Фишера, двусторонний. М - метилированный, Н - неметилированный.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В 2001 г. Salvesen и соавт. впервые попытались проанализировать статус метилирования промотора гена PTEN при РЭ. Метилирование было обнаружено у 19% пациенток. Однако эти данные оказались ошибочными, поскольку не учитывали высокую гомологию между геном и его псевдогеном PTENP1

[39] . Позднее Zysman и соавт. также исследовали метилирование промоторной области PTEN при РЭ

[40] . В этом случае в метилчувствительной ПЦР использовали уже PTEN-специфичные праймеры. Анализировали два сайта: первый - в минимальном промоторе гена PTEN, а второй - вблизи ATG- кодона. Оба сайта оказались неметилированными. Эти данные позволили предположить, что при исследовании промотора гена PTEN с использованием праймеров, не дифференцирующихPTEN и его псевдоген, выявляется метилирование именно PTENP1, но не PTEN. Статус метилирования других участков гена PTEN с PTEN-специфичными праймерами при РЭ и ГЭ больше не анализировали. Тем не менее метилирование иных участков промоторной области этого гена обнаружено и при других онкологических заболеваниях [32, 38, 41]. Поэтому мы предположили, что в тканях РЭ могли быть метилированы уже исследованные и новые последовательности промоторной области гена PTEN, которые ранее не изучалипри этом заболевании. Руководствуясь этим, мы выбрали для исследования новый локус, расположенный в непосредственной близости от минимального промотора, а также две дистально расположенных последовательности, которые уже анализировали ранее (рис. 2, подробнее см. раздел «Результаты»). Один из них, локализованный между праймерами PN4,был метилирован в 60% случаев меланомы [38].

Как показано нами, проанализированные последовательности промоторной области гена PTEN не метилированы ни в одном из изученных образцов тканей. С учетом этих, а также опубликованных данных мы сделали вывод о том, что метилирование промотора гена PTENне участвует в его инактивации при РЭ и ГЭ, по крайней мере, у наших пациенток. Поэтому мы предположили, что в этом случае подавление экспрессии гена PTENмогло происходить по механизму конкурирующих эндогенных РНК или с участием асРНК путем ингибирования транскрипции псевдогена PTENP1через метилирование его промоторной области.

Действительно, мы обнаружили высокую частоту метилирования 5'-концевой области PTENP1у пациенток с РЭ (70.83%), а также при ГЭ без атипии и с атипией (73.33 и 76.92 % соответственно, табл.2). Эти результаты соответствуют опубликованным данным. В частности, метилирование 5'-концевой области псевдогена PTENP1выявляли в 66% случаев мелкоклеточного рака легкого [32]. Однако неожиданным оказалось метилирование псевдогена в образцах эндометрия, полученного от здоровых женщин в возрасте 45-65 лет. Метилирование в этой контрольной подгруппе обнаружили в 57.89% случаев. В то же время метилирование PTENP1имело место лишь у 4% здоровых молодых женщин в возрасте от 17 до 34 лет (табл. 2). Различия в частотах метилирования ДНК в этих подгруппах были статистически значимыми ^ < 0.001). Дальнейший анализ не выявил значимых различий в частотах метилирования PTENP1у здоровых женщин СПВ и пациенток с РЭ и ГЭ. Также не обнаружено корреляции между метилированием псевдогена и стадиями РЭ, степенью диффе- ренцировки клеток, глубиной инвазии в миометрий или подтипами рака (табл.3). Необходимо также подчеркнуть отсутствие метилирования в крови пациенток с РЭ, в эндометрии которых псевдоген был метилирован. Все это указывает на тканеспецифический характер данного явления, которое сопровождает изменения в здоровом эндометрии при старении организма человека.

В настоящее время не известно, как обнаруженное нами метилирование исследуемой области псевдогена PTENP1влияет на его экспрессию и экспрессию гена PTEN. Теоретически возможны три варианта последствий метилирования: отсутствие влияния на экспрессию PTEN,подавление или стимуляция его работы. Упомянутые во «Введении» три PTENP1-днРНК (рис. 2), синтезируемые с исследуемого промотора, оказывают противоположное действие [27]. PTENP1-асРНК-aингибирует транскрипцию PTENчерез гетерохроматинизацию его промотора путем триметилирования гистона H3 в этом участке хроматина.PTENP1-сРНК,конкурируя за миРНК с PTEN-мРНК, выполняет функции кэРНК, а PTENP1-асРНК-Pстабилизирует PTENP1- сРНК. Физиологический исход метилирования псевдогена будет зависеть от изменения соотношения между этими тремя PTENP1-PHKв клетках эндометрия. Стабилизация или стимуляция работы гена опухолевого супрессора PTENпри преимущественном одновременном синтезе PTENP1-сРНК и PTENP1-асРНК-Pможет защищать от канцерогенеза. Последствие подавления его активности может быть двояким. Частичная инактивация PTENпод действием этого эпигенетического механизма может быть маркером предракового состояния клеток эндометрия. В то же время полная быстрая его инактивация также могла бы выполнять защитные функции в стареющих клетках эндометрия.

Недавно группой P. Pandolfiбыл обнаружен новый PTEN-зависимый механизм старения клеток, получивший название клеточного старения, индуцированного инактивацией PTEN (PTEN-loss-inducedcellularsenescence - PICS) [42].В отличие от классических механизмов старения, например, под действием гиперактивации онкогенов PICS(по крайней мере, у мышей [42] и в первичных клетках эпителия человека [43]) может быстро развиваться в непролиферирующих клетках в отсутствие клеточного ответа на повреждение ДНК. При этом развитие PICSзависит от уровня активности внутриклеточного PTEN. Старение клеток и блокирование клеточного цикла по этому механизму в еще немалигнизированных клетках происходят при полной инактивации PTEN, тогда как его частичная инактивация может сопровождаться инициацией канцерогенеза и пролиферацией малигнизированных клеток [42]. В этой связи можно предположить, что PTEN, частично инактивированный соматическими мутациями в клетках эндометрия, создает опасность малигнизации клеток. Поэтому для полного подавления прохождения клеток по клеточному циклу и предотвращения развития опухолей по этому механизму необходима быстрая полная инактивация PTEN. Это, по-видимому, могло происходить путем подавления транскрипции псевдогена PTENP1 через метилирование его промотора и/или истощения кэРНК, функции которой выполняет PTENP1-сРНК. Если такое предположение верно, то метилирование PTENP1 можно рассматривать как одно из звеньев защиты от стареющих клеток с высоким риском малигнизации. В этом случае метилирование PTENP1,обнаруживаемое в клетках ГЭ и РЭ, может быть следствием предшествовавшей или еще происходящей борьбы с их злокачественным перерождением. Для подтверждения или опровержения этой модели требуется проведение дополнительных исследований влияния метилирования PTENP1 на экспрессию гена PTEN.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате изучения нормальных тканей, злокачественных опухолей и гиперплазий эндометрия у женщин разного возраста установлено, что ни в одной из них промоторная область гена опухолевого супрессора PTEN не метилирована. В отличие от этого, двунаправленный промотор псевдогена PTENP1 метилирован с высокой частотой во всех исследованных тканях, кроме эндометрия молодых здоровых женщин, а также крови больных раком эндометрия. Сделан вывод, что метилирование псевдогена PTENP1 отражает возрастные изменения в организме человека и может не быть связано непосредственно с исследуемой патологией эндометрия. Обосновано предположение, согласно которому в зависимости от влияния метилированного PTENP1 на экспрессию гена PTEN метилирование псевдогена может защищать организм от развития РЭ или служить маркером предракового состояния клеток. Для выбора между этими альтернативными возможностями необходимо дополнительно исследовать влияние метилирования PTENP1 на экспрессию гена PTEN в культивируемых клетках человека.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Morice P., Leary A., Creutzberg C., Abu-Rustum N., Darai E. // Lancet. 2016. V. 387. № 10023. P. 1094-1108.

2. Evans-Metcalf E.R., Brooks S.E., Reale F.R., Baker S.P. // Obstet. Gynecol. 1998. V. 91. P. 349-354.

3. Duska L.R., Garrett A., Rueda B.R., Haas J., Chang Y., Fuller A.F. // Gynecol. Oncol. 2001. V. 83. P. 388-393.

4. Garg K., Soslow R.A. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2014. V. 138.

P. 335-342.

5. Sheikh M.A., Althouse A.D., Freese K.E., Soisson S., Edwards R.P., Welburn S., Sukumvanich P., Comerci J., Kelley J., LaPorte R.E., et al. // Future Oncol. 2014. V. 10. P. 2561-2568.

6. Werner H.M.J., Salvesen H.B. // Curr. Oncol. Rep. 2014. V. 16. P. 403.

7. Cancer Genome Atlas Research Network, Kandoth C., Schultz

N., Cherniack A.D., Akbani R., Liu Y., Shen H., et al. // Nature. 2013. V. 497. № 7447. P. 67-73.

8. Bokhman J.V. // Gynecol. Oncol. 1983. V. 15. P. 10-17.

9. Tsikouras P., Bouchlariotou S., Vrachnis N., Dafopoulos A., Galazios G., Csorba R., von Tempelhoff F.G. // Eur. J. Obstetr. Gynecol. Reprod. Biol. 2013. V. 169. P. 1-9.

10. Mazur M.T. // Annals Diagn. Pathol. 2005. V. 9. P. 174-181.

11. Sivridis E., Giatromanolaki A. // Virchows Arch. 2008. V. 453. P. 223-231.

12. Mills A.M., Longacre T.A. // Semin. Diagn. Pathol. 2010. V. 27. P. 199-214.

13. Wise M.R., Jordan V., Lagas A., Showell M., Wong N. Lensen S., Farquhar C.M. // Am. J. Obst. Gynecol. 2016. V. 214. № 6.

P. 689.e1-689.e17.

14. Kandoth C., McLellanM.D., Vandin F., Ye K., Niu B., Lu C., Xie M., Zhang Q., McMichaelJ.F., WyczalkowskiM.A., et al. // Nature. 2013. V. 502. P. 333-339.

15. Blanco-Aparicio C., Renner OLeal J.F.M., Carnero A. // Carcinogenesis. 2007. V. 28. № 7. P. 1379-1386.

16. Matias-Guiu X., Prat J. // Histopathology. 2013. V. 62.

P. 111-112.

17. Song M.S., Salmena L., Pandolfi P.P. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2012. V. 13. P. 283-296.

18. Milella M., Falcone I., Conciatori F., Cesta Incani U., Del Cu- ratolo A., Inzerilli N., Nuzzo C.M., Vaccaro V., Vari S., Cognetti

F. , Ciuffreda L. // Front. Oncol. 2015. V. 5. P. 24.

19. McCabe N., Kennedy R.D., Prise K.M. // Oncoscience. 2016.

V. 3. № 2. P. 54-55.

20. Brito M.B., Goulielmaki E., Papakonstanti E.A. // Front. Oncol. 2015. V. 5. P. 166.

21. Stambolic V., MacPherson D., Sas D., Lin Y., Snow B., Jang Y., Benchimol S., Mak TW. // Mol. Cell. 2001. V. 8. № 2. P. 317-325.

22. SongL.B., LiJ., LiaoW.T., Feng Y., YuC.P., HuL.J., Kong

Q. L., Xu L.H., Zhang X., Liu W.L., et al. // J. Clin. Invest. 2009.

V. 119. № 12. P. 3626-3636.

23. Whelan J.T., Forbes S.L., Bertrand F.E. // Cell Cycle. 2007.

V. 6. № 1. P. 80-84.

24. He L. // Sci. Signal. 2010. V. 3. P. 146, pe39.

25. Poliseno L., Salmena L., Riccardi L., Fornari A., Song M.S., Hobbs R.M., Sportoletti P., Varmeh S., Egia A., Fedele G., et al. // Sci. Signal. 2010. V. 3. P. 117, ra29.

26. Dahia P.L.M., FitzGeraldM.G., Zhang X., Marsh D.J., ZhengZ., PietschT., vonDeimlingA., HaluskaF.G., HaberD.A., EngC. // Oncogene. 1998. V. 16. P. 2403-2406.

27. Johnsson P., Ackley A., Vidarsdottir L., Lui W., Corcoran M., Grander D., Morris K.V. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2013. V. 20.

№ 4. P. 440-446.

28. Poliseno L., Salmena L., Zhang J., Carver B., Haveman W.J., Pandolfi P.P. // Nature. 2010. V. 465. P. 1033-1038.

29. Tay Y., Kats L., Salmena L., Weiss D.,Tan S.M., Ala U., Kar- reth F., Poliseno L., Provero P., Di Cunto F., et al. // Cell. 2011. V. 147. P. 344-357.

30. Poliseno L., Pandolfi P.P. // Methods. 2015. V. 77-78. P. 41-50.

31. Poliseno L., Haimovic A., Christos P.J., Vega Y., Saenz de Miera E.C., Shapiro R., Pavlick A., Berman R.S., Darvishian F., Osman I. // J. Invest. Dermatol. 2011. V. 131. № 12. P. 24972500.

32. Marsit C.J., Zheng S., Aldape K., Hinds P.W., Nelson H.H., Wiencke J.K., Kelsey K.T. // Hum. Pathol. 2005. V. 6. № 7.

P. 768-776.

33. Yu G., Yao W., Gumireddy K., Li A., Wang J., Xiao W., Chen K., Xiao H., Li H., Tang K. // Mol. Cancer Ther. 2014. V. 13.

№ 12. P. 3086-3097.

34. Kovalenko T.F., Sorokina A.V., Ozolinya L.A., Patrushev L.I. // Bioorg. Khim. 2013. V. 39. № 4. P. 445-453.

35. Lindblom B., Holmlund G. // Gene Anal. Techn. 1998. № 5.

P. 97-101.

36. Pikor L.A., Enfield K.S., Cameron H., Lam W.L. // J. Visual. Exp. 2011. e2763. P. 1-3.

37. Patrushev L.I., Valiaev A.G., Golovchenko P.A., Vinogradov S.V., Chikindas M.L., KiselevV.I. // Mol. Biol. (Mosk.). 1993.

V. 27. № 5. P. 1100-1112.

38. Lahtz Ch., Stranzenbach R., Fielder E., Hembola P., Dam- mann R.H. // J. Invest. Dermatol. 2010. V. 130. P. 620-622.

39. Salvesen H.B., Mac Donald N., Ryan A., Jacobs I.J., Lynch E.D., Akslen L.A., Das S. // Int. J. Cancer. 2001. V. 91. P. 22-26.

40. Zysman M.A., Chapman W.B., Bapat B. // Am. J. Pathol. 2002. V. 160. № 3. P. 795-800.

41. Garcia J.M., Silva J., Pena C., Garcia V., Rodriquez R., Cruz M.A., Cantos B., Provencio M., Espana P., Bonilla F. // Genes. Chromosomes Cancer. 2004. V. 41. P. 117-124.

42. Alimonti A., Nardella C., Chen Z., Clohessy J.G., Carracedo A., Trotman L.C., Cheng K., Varmeh S., Kozma S.C., Thomas

G. , et al. // J. Clin. Invest. 2010. V. 120. P. 681-693.

43. Childs B.G., Durik M., Baker D.J., van Deursen J.M. // Nat. Med. 2015. V. 21. P. 1424-1435.

Размещено на Allbest.ru